Los protocolos para analizar el papel de las células de Paneth en Regeneración del Murino Intestino utilizando condicional Cre-lox Ratón Modelos

El objetivo general de este procedimiento de disección es demostrar cómo aislar y preparar el intestino del ratón para las técnicas de caracterización posteriores. Este método podría utilizarse para investigar la capacidad de las células madre intestinales para repoblar el intestino siguiendo un procedimiento experimental. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar después de cualquier técnica o cualquier procedimiento o después de la manipulación genética. Usando la tecnología Cray Locks: Comience colocando un ratón adulto sacrificado en posición supina y humedeciendo el pelaje con etanol al 70%.

Luego, con unas tijeras, abra la cavidad intraperitoneal longitudinalmente a lo largo de la línea media y asegure el estómago con fórceps. A continuación, corte la conexión con el esófago y tire suavemente del estómago para extraer el intestino delgado hasta el apéndice. A continuación, tire suavemente del apéndice para extraer el intestino grueso hasta el ano.

Una vez que se hayan aislado los intestinos, extraiga el estómago en el apéndice y use una jeringa equipada con una punta de pipeta de punta roma para enjuagar los intestinos con PBS inmediatamente después de enjuagar, corte el intestino en tres secciones de igual tamaño, proximal, medio y distal. Luego, corte cada sección en pedazos de un centímetro y coloque de tres a cinco fragmentos de tejido en el medio de un trozo de cinta quirúrgica de dos por dos centímetros. En una formación piramidal, cuando se hayan unido todos los tejidos, selle la cinta alrededor de las piezas longitudinalmente creando una pila de troncos.

A continuación, coloque la cinta en un receptáculo de fondo plano que contenga al menos 10 veces el volumen de neutro, tamponado, formal y fijador con respecto al volumen de tejido, y almacene las muestras a cuatro grados centígrados antes de incluirlas y seccionarlas. Después de la fijación, transfiera el tejido a un recipiente de fondo plano que contenga al menos 10 veces el volumen de etanol al 70% que el volumen de tejido para fijar el tejido en Metcon inmediatamente después del lavado. Corta el intestino en tres secciones del mismo tamaño como se acaba de demostrar.

A continuación, coloque cada sección una al lado de la otra en un trozo de papel de filtro de 15 por 15 centímetros y utilice unas tijeras de arco de resorte para abrir las secciones en FOSS cuando se hayan dividido todas las secciones. Transfiera el papel de filtro a un plato de vidrio que contenga Metcon recién preparado durante tres a 24 horas a temperatura ambiente al final de la fijación, use pinzas para recoger el extremo de cada una de las piezas de intestino una a la vez y enrolle los tejidos alrededor de las pinzas para formar rollos suizos individuales. Asegure cada rollo abriendo ligeramente las pinzas e insertando una aguja de calibre 25 a través del tejido.

A continuación, coloque los pañuelos enrollados en un recipiente de fondo plano que contenga al menos 10 veces el volumen de la fórmula tamponada neutra y el fijador que los pañuelos durante al menos una hora antes de procesarlos para la visualización de la rotura del tejido en todo el montaje. Vierta cera cruda fundida mezclada con aceite mineral en placas de Petri de 15 centímetros. Luego, inmediatamente después de lavar los intestinos con PBS helado, enjuague los tejidos con 25 mililitros de fijador ex cal helado.

Después de la fijación, corte los intestinos en tres a cinco secciones iguales y coloque cada sección en una de las placas de cera enfriadas. Sujete con alfileres cada extremo de modo que las secciones se estiren ligeramente con las líneas mesentéricas en la parte superior de las placas. Recorta el exceso de mesenterio.

Luego, use unas tijeras de arco de resorte para cortar las tripas longitudinalmente sujetándolas a medida que se abren cuando se han sujetado todas las secciones. Inundar las placas con suficiente fijador xal para cubrir todos los tejidos después de al menos una hora a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta de 25 mililitros o una jeringa para retirar el fijador y lave los pañuelos una vez con 30 mililitros de PBS.

A continuación, cubra las secciones con 30 mililitros de solución unificadora DTTD para una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con balanceo. Al final de la incubación, retire la solución deificante con una pipeta o jeringa de 25 mililitros e inunde los tejidos con otros 30 mililitros de PBS. A continuación, utilice una pipeta posterior para eliminar la mucosidad con el PBS después del lavado.

Reemplace el PBS con 30 mililitros de xal para una mancha nocturna a temperatura ambiente en la oscuridad con una agitación suave en una plataforma mecedora a la mañana siguiente. Si las secciones han desarrollado una mancha verde azulada, reemplace el xal con 30 mililitros de PBS. Después de tres minutos de agitación suave, haga rollos suizos como se acaba de demostrar y coloque los pañuelos en un recipiente de fondo plano de boca ancha que contenga al menos 10 veces el volumen de fijador apropiado que el volumen de tejido a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas antes de incrustar y seccionar.

Utilizando el reportero condicional ROSA 26 R Laxy, se puede observar una recombinación del 100% tres días después de la inducción en el intestino delgado utilizando ADN extraído de las cunas recombinadas. La QPCR para los alelos recombinados demostró un aumento no significativo en la recombinación dentro del sistema de pliegues VI, posiblemente debido a que la recombinación en las células de paneth no se observó. Utilizando el sistema de pliegues ah utilizando el reportero laxo, ambos sistemas también demostraron una pérdida completa de células recombinadas a los tres días después de la inducción.

Los datos de mitosis y altura celular de la cripta K indicaron que el sistema ah H Cree podría recuperarse, presumiblemente debido a la repoblación por células madre intestinales no combinadas. En marcado contraste, el villano Cree no pudo recuperarse a pesar de conservar las células epiteliales de la cripta. Además, las células de la cripta en los ratones flocados vi Cree Cantin B no eran proliferativas y carecían de expresión del marcador de células madre intestinales.

EM cuatro. A diferencia de las criptas de los ratones ah cre de manera similar, las células PTH sufrieron apoptosis después de la deleción de Caden b solo dentro del sistema VI Cree. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente 10 minutos.

Es importante minimizar los retrasos para evitar la degradación de los tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer el intestino de un mouse para el análisis posterior.