Perfiles de expresión génica de los microbios Infección de Uso de una Plataforma Digital Bar-codificación

El objetivo general de este experimento es medir con precisión la expresión génica de patógenos in vivo para arrojar luz sobre cómo un patógeno se adapta al entorno infeccioso y causa daño a su huésped. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran la dinámica de la expresión génica de patógenos durante una infección real en varios tipos de tejidos y en múltiples puntos de tiempo. La principal ventaja de este método es que es altamente sensible y extremadamente reproducible.

Este método hace factible cuantificar la expresión génica del patógeno a partir de una pequeña cantidad de tejidos de una infección de la vida real. Para comenzar a preparar los reactivos, agregue 2-Mercaptoetanol al tampón RLT y mezcle bien. Prepare una mezcla 25:24:1 de solución de alcohol isoamílico de fenol-cloroformo.

Etiquete los tubos de homogeneización tipo M y enfríe con hielo. Etiquete dos tubos de tapón de rosca de mililitros y agregue aproximadamente 300 microlitros de perlas de circonio a cada tubo. Tenga los siguientes instrumentos listos para usar, incluido un disociador de tejidos, un batidor de perlas, una centrífuga de mesa con adaptadores para tubos de 50 mililitros y placas de 96 pocillos y un fotómetro.

Retire los riñones previamente congelados aislados de ratones infectados con C. albicans de un congelador a 80 grados centígrados y colóquelos en hielo. Agregue 1,2 mililitros de tampón RLT a cada riñón. A continuación, decantar cada riñón con tampón en un tubo de homogeneización de tipo M.

La cantidad de tampón RLT utilizada se determina empíricamente. Demasiado tampón RLT diluirá la concentración de la muestra, mientras que muy poco hará que el homogeneizado sea muy viscoso y extremadamente difícil de manipular. A continuación, utilizando un disociador de tejidos en la configuración precargada RNA 2.01, homogeneice los riñones.

Luego, centrifugar a 1000 x G durante un minuto. Transfiera 600 microlitros de cada homogeneizado a un tubo con tapón de rosca que contenga perlas de circonio y guarde el homogeneizado restante en hielo. Agregue 600 microlitros de alcohol isoamílico de fenol-cloroformo a cada tubo, cierre herméticamente las tapas y haga un vórtice en el batidor de cuentas durante tres minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifugar a 15.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera con cuidado la fase acuosa a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 mililitros, agregando un volumen igual de 70% de etanol. A continuación, cargue en la columna de centrifugado y centrifuga a 8.000 x G.Con 700 microlitros de tampón RW, lave cada columna de centrifugado una vez, seguida de dos lavados con 500 microlitros de tampón RPE.

Transfiera las columnas a tubos de recolección secos y centrigé un minuto más para eliminar el líquido restante. Por último, utiliza 50 microlitros de agua para eluir el ARN. A continuación, utilice un espectrofotómetro a OD 216 animetros para medir la concentración de ARN.

Para llevar a cabo el perfil de expresión génica mediante códigos de barras digitales, comience por descongelar el conjunto de códigos reporteros y el conjunto de códigos de captura en hielo. Agregue 130 microlitros de tampón de hibridación al conjunto de códigos reporteros. Invierta para mezclar y girar.

A continuación, agregue 20 microlitros de la mezcla a cada uno de los 12 tubos de reacción. A continuación, añada 10 microgramos de ARN tisular total a cada tubo y mezcle mediante pipeteo. Dependiendo del modelo de infección, el tamaño del inóculo y la cepa patógena utilizada, el porcentaje de ARN del patógeno dentro del ARN total varía de 0 a 2%Por lo tanto, la cantidad total de ARN que debe agregarse para cada uno debe optimizarse empíricamente.

Ahora agregue cinco microlitros de código de captura a cada tubo. Mezcle volteando los tubos y gire rápidamente. Luego incubar las reacciones en un termociclador a 65 grados centígrados con una tapa calentada durante aproximadamente 18 horas.

Retire un cartucho de muestra a 20 grados centígrados y deje que se caliente a temperatura ambiente. Retire dos placas de reactivos a cuatro grados centígrados y haga girar en una centrífuga de mesa a 670 x G durante dos minutos. A continuación, configure la estación de preparación siguiendo las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccionando la opción de alta sensibilidad.

A continuación, retire las reacciones del termociclador y cárguelas inmediatamente en la estación de preparación. Después de ejecutar el programa de alta sensibilidad de tres horas, retire el cartucho y use cinta adhesiva transparente para sellar los carriles. Aplique aceite mineral en el fondo del cartucho si es necesario.

A continuación, cargue el cartucho en el analizador digital. Configure el analizador digital siguiendo las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccionando la opción de escaneo de alta resolución. Después de ejecutar el programa de escaneo, descargue los resultados o elija recibirlos por correo electrónico e importar los datos sin procesar al software del fabricante.

Analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. El protocolo demostrado en este video tiene la ventaja única de que utiliza tanto una sonda de captura como una sonda de informe para aumentar la especificidad y reducir el ruido del ARN del huésped. Como se muestra aquí, los recuentos brutos de fondo de una muestra de tejido no infectado estaban todos por debajo de 10, mientras que los recuentos brutos de dos muestras de tejido infectado estaban todos por encima de 10.

Los recuentos brutos de dos muestras biológicas tuvieron muy buena correlación con un valor de R cuadrado de 0,945. La plataforma también proporciona suficiente rango dinámico para abarcar los niveles de expresión biológica natural. Utilizando un conjunto de sondas que especificó 248 genes de respuesta ambiental, se determinaron dos fases de la expresión génica del patógeno.

Una respuesta temprana a la expresión génica comprende genes con niveles de ARN significativamente diferentes entre el inóculo y las muestras posteriores a la infección 12 horas. También se descubrió una respuesta tardía a la expresión génica que comprende genes con niveles de ARN que son significativamente diferentes entre las muestras puntuales de 12 horas y las muestras posteriores a la infección de 48 horas. Estos resultados indican que la expresión génica de C. albicans se regula dinámicamente durante la infección invasiva de un huésped mamífero.

Este método es fácil y rápido. Todo el procedimiento, desde la recolección de tejidos hasta la extracción de datos, requiere menos de 48 horas. El tiempo de manipulación es de alrededor de cuatro horas para 12 muestras.

Si bien este método se desarrolla para capturar la expresión génica del patógeno in vivo, también se puede utilizar para responder a la expresión génica del huésped. Por lo tanto, los investigadores pueden obtener información útil de ambos lados de una infección simultáneamente.