Perfiles de expresión génica de los microbios Infección de Uso de una Plataforma Digital Bar-codificación

El objetivo general de este experimento es medir con precisión la expresión génica de patógenos in vivo, con el fin de esclarecer cómo un patógeno se adapta al entorno infeccioso y causa daño a su huésped. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran la dinámica de la expresión génica de patógenos durante una infección real en diversos tipos de tejidos y en múltiples puntos temporales. La principal ventaja de este método es que es altamente sensible y extremadamente reproducible.

Este método hace posible cuantificar la expresión génica del patógeno a partir de una pequeña cantidad de tejidos procedentes de una infección real. Para comenzar la preparación de los reactivos, agregue 2-mercaptoetanol al tampón RLT y mezcle bien. Prepare una mezcla 25:24:1 de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.

Etiquete tubos de homogenización tipo M y enfríelos en hielo. Etiquete tubos de tapón roscado de dos mililitros y agregue aproximadamente 300 microlitros de perlas de circonio a cada tubo. Tenga listos para su uso los siguientes instrumentos: un disociador de tejidos, un agitador de perlas, una centrífuga de banco con adaptadores para tubos de 50 mililitros y placas de 96 pocillos, y un fotómetro.

Retire los riñones previamente congelados aislados de ratones infectados con C.albicans de un congelador a 80 grados Celsius y colóquelos sobre hielo. Añada 1,2 mililitros de tampón RLT a cada riñón. Luego, vierta cuidadosamente cada riñón con tampón en un tubo de homogenización tipo M.

La cantidad de tampón RLT utilizada se determina empíricamente. Un exceso de tampón RLT diluirá la concentración de la muestra, mientras que una cantidad insuficiente hará que el homogenato sea muy viscoso y extremadamente difícil de manipular. A continuación, utilizando un disociador de tejidos en la configuración preestablecida RNA 2.01, homogenice los riñones.

Luego, centrifugue a 1000 x G durante un minuto. Transfiera 600 microlitros de cada homogenato a un tubo con tapa roscada que contenga perlas de circonia y guarde el homogenato restante sobre hielo. Añada 600 microlitros de fenol-cloroformio alcohol isoamílico a cada tubo, cierre bien las tapas y vortexee en la batidora de perlas durante tres minutos a cuatro grados centígrados.

Centrifugar a 15.000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transferir cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, añadiendo un volumen igual de etanol al 70 %. A continuación, cargar sobre la columna de giro y centrifugar a 8.000 × G. Lavar cada columna de giro una vez con 700 microlitros de tampón RW, seguido de dos lavados con 500 microlitros de tampón RPE.

Transfiera las columnas a tubos de recolección secos y centrifugue un minuto adicional para eliminar cualquier líquido residual. Finalmente, use 50 microlitros de agua para eluir el ARN. Luego, use un espectrofotómetro a OD 216 nanómetros para medir la concentración de ARN.

Para realizar el perfilado de expresión génica utilizando codificación digital por barras, comience por descongelar el conjunto de códigos de reportero y el conjunto de códigos de captura sobre hielo. Añada 130 microlitros de tampón de hibridación al conjunto de códigos de reportero. Invierta para mezclar y centrifugue brevemente.

A continuación, agregue 20 microlitros de la mezcla a cada uno de los 12 tubos de reacción. Luego, agregue 10 microgramos de ARN total del tejido a cada tubo y mezcle mediante pipeteo. Dependiendo del modelo de infección, el tamaño del inóculo y la cepa del patógeno utilizada, el porcentaje de ARN del patógeno dentro del ARN total varía desde 0 hasta 2 %. Por lo tanto, la cantidad total de ARN que debe agregarse a cada muestra debe optimizarse empíricamente.

Ahora agregue cinco microlitros del conjunto de códigos de captura a cada tubo. Mezcle invirtiendo los tubos y centrifugue brevemente. A continuación, incube las reacciones en un termociclador a 65 grados Celsius con tapa calentada durante aproximadamente 18 horas.

Retire un cartucho de muestra de 20 grados celsius y déjelo calentar a temperatura ambiente. Retire dos placas de reactivo de cuatro grados celsius y centrifugue en una centrífuga de sobremesa a 670 × g durante dos minutos. A continuación, configure la estación de preparación siguiendo las instrucciones paso a paso en la pantalla, seleccionando la opción de alta sensibilidad.

Luego retire las reacciones del ciclador térmico e introdúzcalas inmediatamente en la estación de preparación. Después de ejecutar el programa de alta sensibilidad de tres horas, retire el cartucho y use cinta transparente para sellar los carriles. Aplique aceite mineral en la parte inferior del cartucho si es necesario.

Luego cargue el cartucho en el analizador digital. Configure el analizador digital siguiendo las instrucciones paso a paso que aparecen en la pantalla, seleccionando la opción de escaneo de alta resolución. Después de ejecutar el programa de escaneo, descargue los resultados o elija recibirlos por correo electrónico e importe los datos brutos al software del fabricante.

Analice los datos según el protocolo descrito en el texto. El protocolo mostrado en este video tiene la ventaja única de utilizar tanto una sonda de captura como una sonda reportera para aumentar la especificidad y reducir el ruido proveniente del ARN del huésped. Como se muestra aquí, los conteos brutos de fondo provenientes de una muestra de tejido no infectado estuvieron todos por debajo de 10, mientras que los conteos brutos de dos muestras de tejido infectadas fueron todos superiores a 10.

Los conteos brutos de dos muestras biológicas presentaron una muy buena correlación con un valor de R cuadrado de 0,945. La plataforma también proporciona un rango dinámico suficiente para abarcar los niveles naturales de expresión biológica. Utilizando un conjunto de sondas que especifica 248 genes de respuesta ambiental, se determinaron dos fases de la expresión génica del patógeno.

Una respuesta temprana de expresión génica comprende genes cuyos niveles de ARN difieren significativamente entre las muestras del inóculo y las de 12 horas posteriores a la infección. También se descubrió una respuesta tardía de expresión génica que comprende genes cuyos niveles de ARN son significativamente diferentes entre el punto de las 12 horas y las muestras de 48 horas posteriores a la infección. Estos resultados indican que la expresión génica de C.albicans está regulada dinámicamente durante la infección invasiva de un hospedador mamífero.

Este método es sencillo y rápido. Todo el procedimiento, desde la recolección del tejido hasta la expresión de los datos, requiere menos de 48 horas. El tiempo de manipulación es de aproximadamente cuatro horas para 12 muestras.

Aunque este método se desarrolló para capturar la expresión génica de patógenos in vivo, también puede utilizarse para analizar la expresión génica del huésped. Por lo tanto, los investigadores pueden obtener información útil de ambos lados de una infección simultáneamente.