Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Hola, soy Tim Duso de Agriculture and AgriFood Canada. En este video, demostraremos un protocolo para determinar la presencia y abundancia de microorganismos específicos en una muestra clínica o ambiental compleja utilizando un instrumento bioplex. Este protocolo utiliza perlas de poliestireno fluorescente que se acoplan químicamente a una sonda de oligonucleótidos específica de la especie.

Se genera un amplicón a partir de la muestra utilizando cebadores de PCR universales y el amplicón se hibrida con las perlas acopladas a la sonda. Con el instrumento bio plex se generan dos señales. Uno identifica la cuenta y el otro cuantifica la señal de hibridación.

El objetivo general del procedimiento es determinar un perfil de la microbiota de interés de forma rápida y semicuantitativa. Hemos aplicado esta técnica para determinar los perfiles bacterianos en los hisopos vaginales y utilizar los datos generados para diagnosticar la vaginosis bacteriana, una afección clínica que se caracteriza por un cambio en la microbiota en el que los organismos lactobacillus se vuelven menos prevalentes y otros organismos como Gardnerella, vais y apoian vae se vuelven detectables en los hisopos vaginales. Sin embargo, es importante tener en cuenta que esta técnica puede aplicarse a cualquier otra microbiota para la que sea deseable un ensayo múltiple rápido.

Comencemos describiendo cómo funciona el procedimiento. Se genera un perfil microbiano amplificando una proteína y recubriendo el gen chaperona en 60 de todos los organismos presentes en el extracto de ADN A del hisopo. Uno de los cebadores de amplificación universales se modifica mediante la adición de biotina, así como la inclusión de bases modificadas con fosfoato.

En el extremo de los cinco primos, el amplicón se hace monocatenario utilizando la nucleasa del exón T seven, que degrada solo la hebra antisentido. Dado que la hebra de detección está protegida por un cebador de PCR modificado con fosforato, las sondas de oligonucleótidos complementarias a la hebra restante se acoplan covalentemente a perlas de poliestireno fluorescente. Con cada color de perla único que contiene una sonda que detecta un organismo diferente, se pueden usar hasta cien perlas diferentes para una sola muestra.

El producto de PCR monocatenario del hisopo vaginal se hibrida con una mezcla de perlas acopladas a sondas que contiene sondas para todos los organismos de interés. Se añade una etitina FICO reportera fluorescente que se une a las sondas biotiniladas a través de un conjugado estreptococo din. Finalmente, la mezcla de hibridación se analiza en un instrumento luminex o bio plex, que examina cada cuenta individualmente en busca de identidad y señal de hibridación.

Los resultados de este análisis indican la presencia de microorganismos específicos y la intensidad de la señal de hibridación se correlaciona con la abundancia de ese organismo. En la muestra, la presencia de microorganismos relacionados con la VB se puede utilizar para diagnosticar la VB. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la tinción de Grand, es que se genera información sobre la presencia de microorganismos específicos y su abundancia.

Jennifer Town, asistente de investigación en nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento y suspenderá las microesferas mediante vórtice durante aproximadamente 20 segundos. Transfiera 400 microlitros de microesferas a una centrífuga de tubo einor a 14.000 veces G durante un minuto, retire y deseche el snat Resus. Suspender las microesferas en 50 microlitros de MES 0,1 molar pH 4,5.

Agregue un animo de oligo de captura a las microesferas y mezcle por vórtice. Agregue 2,5 microlitros de solución EDC fresca a las microesferas. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.

Deseche la solución de EDC que se preparó anteriormente y prepare una muestra fresca de 10 miligramos por mililitro de EDC en agua. Como en el caso anterior, añada otros 2,5 microlitros de solución fresca de EDC a las microesferas y al vórtice durante cinco segundos. Incubar de nuevo a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.

Lave las perlas agregando un mililitro de 0.02%Tween 20 vórtice para resuspender las perlas centrífuga a 14, 000 veces G.Durante un minuto, retire y deseche el sobrenadante. Lavar las cuentas de nuevo añadiendo un mililitro de 0,1%SDS Resus. Suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón.

Enumere las perlas en un hemocitómetro para determinar la concentración de existencias. Prepare una mezcla maestra de microesferas diluyendo cada perla hasta una concentración final de 100 perlas por microlitro en el agrupe tampón las perlas acopladas de acuerdo con el plex deseado del ensayo. Almacene la mezcla maestra de microesferas a cuatro grados en la oscuridad. Esta mezcla se puede almacenar durante meses si se mantiene en estas condiciones, genere producto PCR para cada muestra.

Incluya el juego de cebadores de cinco cebadores modificados con fosfolato y biotina inmediatamente después de que se complete la PCR. Añadir dos microlitros de T seven exonucleasa a cada tubo de PCR incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos. Al final de esta incubación, agregue 12.5 microlitros de 0.5 molar E-D-T-A-P-H 8.0 en la mezcla.

Esto da un total de aproximadamente 64,5 microlitros de producto PCR monocatenario. Mezcla maestra Resus Bend Microsphere con una pipeta. Dispense una cantidad adecuada en un tubo einor.

Tape el tubo y sonique en un baño de agua sónica durante dos minutos. Dispense 17 microlitros de producto PCR monocatenario en los pocillos apropiados de un perfil bajo 96. La placa de pocillo agregue 33 microlitros de mezcla de perlas sonicadas resuspendidas a cada uno.

Cubra bien la placa con una cubierta de silicona y golpee. Coloque suavemente la placa en el termociclador con un programa de 95 grados durante cinco minutos, 60 grados durante 10 minutos, sostenga o haga una pausa de 60 grados durante cinco minutos. Finalizar, inicie el programa.

Prepara una solución fresca de estreptococo Aden FICO Ethin. Necesitarás 25 microlitros por pocillo. Produzca estreptococos y FICO etina diluyendo el tallo a un miligramo por mililitro.

Uno en 50 a 20 microgramos por mililitro con un tampón de una vez tmac. Cuando el termociclador llegue al escalón de retención de 60 grados, abra la tapa, retire la cubierta de silicona y agregue la solución de etitina strep din FICO directamente a cada uno. Bueno, vuelva a colocar la cubierta de silicona, cierre la tapa del termociclador y reanude el programa.

Cuando se complete el programa, saque la placa y transfiérala rápidamente a la máquina bioplex para leerla. La placa debe leerse dentro de los 10 minutos. Lea la placa a 60 grados.

Asegúrese de que el bioplex se haya precalentado a esta temperatura. Esto muestra los resultados de las tinciones de Gram correspondientes y los perfiles de luminex de muestras longitudinales de un solo individuo en el tiempo cero. La tinción de Gram es consistente con un diagnóstico clínico de VB, y esto se corrobora mediante un ensayo Fiveplex Luminex que muestra señales de hibridación positivas para los organismos asociados a VB, incluidos Gardner Relic, vais y Apoian Vae.

Lactobacillus Iners también se detecta en niveles bajos a medida que pasa el tiempo. Este individuo pasa de una microbiota vaginosa a una microbiota normal, como muestran las tinciones de Gram. El análisis Luminex de estas mismas muestras muestra que la abundancia de Gardnerella Vaginalis alcanza su punto máximo y disminuye, mientras que Lactobacillus iners aumenta hasta convertirse en el organismo dominante en el punto de tiempo final.

Utilizando este método para perfilar la microbiota, se genera información sobre la presencia de organismos específicos, así como su abundancia. Dado que el método se basa en secuencias, el diseño de la sonda puede basarse en el análisis de secuenciación profunda y los microorganismos que se identifican mediante los métodos de secuenciación de próxima generación se pueden rastrear en muestras de una manera rápida y de costo relativamente bajo. Ver este video debería haberle dado una buena comprensión de cómo generar un perfil microbiano a partir de una muestra utilizando el instrumento Luminex o Bio Plex.

Le hemos mostrado cómo acoplar sondas de oligonucleótidos a las perlas fluorescentes, generar alicon monocatenario a partir de una muestra clínica o ambiental, realizar hibridación y determinar los resultados en el instrumento Luminex o Bio Plex. Buena suerte con tus experimentos.