Electrotaxis microfluidos basados en On-Demand Análisis cuantitativo de
2 de mayo de 2013
Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda de Caenorhabditis elegans Se describe. Este método se basa en el fenómeno neurofisiológica de gusanos que responden a los campos eléctricos suaves ("electrotaxis") dentro de los canales de microfluidos. Microfluidos electrotaxis sirve como una técnica rápida, sensible, de bajo costo, y escalable para la detección de factores que afectan a la salud neuronal.
El objetivo general de este procedimiento es identificar anomalías en la señalización neuronal y neuromuscular en el organismo modelo de C Allergan tras la exposición a productos químicos o manipulaciones genéticas. Esto se logra primero diseñando y grabando un patrón de microcanales en una oblea de silicio. Durante el segundo paso, se utiliza el molde de silicio para moldear uno o más microcanales de PDMS.
Luego se fijan componentes accesorios al molde de PDMS. A continuación, se registra mediante una cámara montada en un microscopio el comportamiento de los gusanos mientras se les estimula para nadar a través del microcanal. Finalmente, se utiliza la microfluídica electroquímica para determinar los cambios en los sistemas neuronal y muscular de los nematodos inducidos por manipulaciones químicas o genéticas, utilizando la locomoción como parámetro de lectura.
Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes, especialmente los ensayos conductuales basados en placas, es que con este método se puede controlar rigurosamente la dirección de la locomoción del gusano, lo que permite una cuantificación precisa de los comportamientos locomotores, como la frecuencia de dobleces corporales, el tiempo de rotación y la velocidad de nado. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos neurodegenerativos como el de Parkinson y el de Alzheimer, ya que puede utilizarse para identificar factores químicos y genéticos con propiedades neuroprotectoras. Tuvimos por primera vez la idea de esta técnica cuando nos dimos cuenta de que faltaba un método para analizar el comportamiento de movimiento de los gusanos de manera cuantitativa.
El movimiento es voluntario y aleatorio, y es difícil caracterizarlo. Por eso queríamos establecer un método sencillo que todos pudieran aprender. Para fabricar el molde maestro, comience sumergiendo una oblea de silicio de tres pulgadas en acetona y luego en metanol durante 30 segundos cada uno. Luego, enjuague la oblea con agua desionizada durante cinco minutos.
A continuación, utilice una pistola de aire con nitrógeno para secar la superficie de la oblea y luego caliente la oblea en una placa calefactora a 120 grados Celsius durante dos minutos; oxide la superficie de la oblea de silicio mediante plasma a 50 vatios durante un minuto. Ahora, usando tres mililitros de resistencia fotolitográfica SU-8 100, aplique un recubrimiento por centrifugado sobre la superficie de la oblea a 1.750 RPM durante 40 segundos, y luego realice un prehorneado de la oblea recubierta en una placa calefactora a 65 grados Celsius. Después de 10 minutos, aumente la temperatura a 95 grados Celsius en un lapso de dos minutos y hornee la oblea durante una hora adicional.
Después de retirar la oblea de la placa calefactora, coloque una máscara fotográfica con el diseño deseado sobre la oblea. Exponga la resistencia fotográfica a la luz UV durante 95 segundos. Luego, hornee la oblea posteriormente en una placa calefactora utilizando el mismo gradiente de temperatura que se usó para la cocción previa después del horneado posterior.
Sumerja la oblea en SU ocho. Prepare una solución durante 10 a 15 minutos. Enjuague la oblea con isopropanol para confirmar la finalización del desarrollo del diseño.
Luego, enjuague con agua desionizada durante 30 segundos. Finalmente, seque la oblea con una pistola de nitrógeno y hornee brevemente a 120 grados Celsius. Ahora, coloque el molde maestro fabricado, así como una oblea de silicón virgen, en dos placas de Petri separadas forradas con papel de aluminio.
Vierta 20 mililitros de prepolímero de PDMS en el molde matriz y en el recipiente, y 15 mililitros en el recipiente con oblea en blanco. A continuación, presione suavemente las obleas con un aplicador desechable de madera para eliminar cualquier bolsa de aire debajo de ellas, luego cubra ambos recipientes y déjelos reposar durante un día para que se cure. Después de que las obleas hayan curado, retire el papel de aluminio y desprenda el PDMS.
Luego, utilice un punzón Harris Unicorn de 2,5 milímetros para perforar puertos de acceso de fluido en ambos extremos del canal en el PDMS proveniente del molde maestro. Corte ambos discos de PDMS en tiras de tamaño similar. Luego, en un cuarto limpio, cargue el canal, la tira de PDMS sin grabado y una lámina de vidrio en un oxidador de plasma.
Someta los materiales a un plasma de oxígeno a 40 vatios de potencia durante 40 segundos. Luego, adhiera el trozo del canal y la laminilla de vidrio a lados opuestos de la tira en blanco y deje a un lado los materiales para completar la unión. Después de dos horas, utilice polímero previo de PDMS para fijar dos trozos de tubo de plástico de al menos seis pulgadas de largo a los depósitos perforados en una placa calefactora a 120 grados Celsius.
Deje que el PDMS cure antes de continuar. Luego, fije un conector plástico para fluidos a uno de los tubos para permitir la conexión de jeringas. Ahora, inserte trozos de tres pulgadas de alambre de cobre aislado calibre 22 en cada reservorio, entre el tubo de entrada y el canal, asegurando los alambres con más pre-polímero de PDMS.
Comience este paso colocando el microcanal recién ensamblado sobre una plataforma móvil XY de un microscopio equipado con una cámara montada conectada a un monitor, y conecte la fuente de alimentación a los electrodos del microcanal. Después de confirmar que la resistencia del microcanal es de aproximadamente 0,6 megaohmios, conecte el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. Luego sumerja el extremo del tubo de entrada en una solución de nematodos suspendidos en tampón fisiológico M nueve.
Aplique presión negativa dentro de la jeringa para aspirar el líquido hacia el canal. Cuando los tubos de entrada y salida estén ambos llenos, desconecte la jeringa y el sistema hidrostático. Manipule el flujo ajustando la altura relativa de los tubos para colocar un gusano en el centro del canal.
Luego coloque ambos tubos en posición horizontal y a la misma altura para mantener un flujo nulo dentro del microcanal. Al cambiar las muestras de gusano durante un experimento de electrotaxia, después de nivelar ambos tubos de entrada a la misma elevación, si aún hay flujo, realice ajustes pequeños en la altura de los tubos en relación uno con otro. Si en algún momento no estamos seguros de si el flujo es realmente cero, podemos inducir una inversión en el movimiento del gusano cambiando la polaridad del campo eléctrico y luego evaluando la velocidad lineal del gusano mientras gira.
Ahora configure la fuente de alimentación en el voltaje adecuado. Active la señal eléctrica y permita un minuto de preexposición para que el gusano se aclimate al campo, durante el cual el gusano debe comenzar a moverse hacia el cátodo cuando haya transcurrido el minuto. Comience la grabación.
Una vez finalizado el experimento, retire todo el líquido y los gusanos del canal. Enjuague la cámara con agua desionizada y deje el dispositivo en una placa calefactora a 125 grados Celsius para que se seque. En este video representativo, se muestra un nematodo adulto joven de tipo silvestre en el eje electro y sus salidas de posición y velocidad provenientes del software de seguimiento de gusanos.
El video comienza con el cátodo en el lado derecho. La apariencia de la pipeta de vidrio indica la inminente inversión; posteriormente, la eliminación de las señales de la pipeta. En el momento de la inversión, se muestran los datos de posición respecto al tiempo y de velocidad instantánea respecto al tiempo, generados por el programa personalizado de seguimiento de gusanos para el gusano del video. El programa calculó la curva de velocidad a partir de la curva de posición respecto al tiempo.
Este gráfico de caja muestra datos de velocidad electroquínética de un conjunto de animales de tipo silvestre y transgénicos trench. Los animales transgénicos T expresan el gen humano de la alfa-sinucleína en los músculos de la pared corporal bajo el control del promotor del gen de la cadena pesada de miosina UNC-54, lo que provoca agregación proteica y se manifiesta como una respuesta electrotáctica más lenta en comparación con la de los animales de tipo silvestre. Una vez dominado, se pueden analizar más de 20 gusanos por hora si se realiza adecuadamente el experimento de electrotaxia.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo las mutaciones y sustancias químicas que afectan la locomoción o la electrorecepción producirán fenotipos detectables mediante el ensayo de electrotaxia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo crear un patrón en silicona, cómo ensamblar un canal microfluídico y cómo analizar la locomoción de N. method utilizando un ensayo axxis.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe un método microelectrofluídico semiautomatizado para inducir la locomoción bajo demanda en Caenorhabditis elegans. La técnica aprovecha el fenómeno de la electrotaxis, lo que permite un cribado rápido de factores que afectan la salud neuronal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Microfluídica
- Análisis del comportamiento
Antecedentes
- Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para estudiar la señalización neuronal y neuromuscular.
- La electrotaxis es una respuesta neurofisiológica a campos eléctricos.
- Los canales microfluídicos permiten experimentos controlados en organismos pequeños.
- Comprender la locomoción puede revelar información sobre la salud neuronal.
Objetivo del estudio
- Identificar anomalías en la señalización neuronal y neuromuscular.
- Evaluar los efectos de la exposición química o la manipulación genética.
- Utilizar la locomoción como indicador de cambios neuronales y musculares.
Métodos Utilizados
- Diseñar y grabar patrones de microcanales en obleas de silicio.
- Colar microcanales de PDMS utilizando moldes de silicio.
- Fijar componentes accesorios al molde de PDMS.
- Registrar el comportamiento de los gusanos mediante una cámara montada en el microscopio.
Resultados principales
- Inducción exitosa de la locomoción en C. elegans mediante electrotaxis.
- Identificación de cambios en los sistemas neuronal y muscular.
- Demuestra la electrotaxis en microfluidos como un método de cribado escalable.
- Información sobre los efectos de manipulaciones genéticas y químicas.
Conclusiones
- La electrotaxia microfluídica es una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- Este método proporciona un enfoque sensible y de bajo costo para estudiar la salud neuronal.
- Aplicaciones adicionales podrían mejorar la comprensión de los trastornos neuromusculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo de la locomoción en C. elegans permite la selección de alto rendimiento de compuestos neuroprotectores y modificadores genéticos en modelos de enfermedades neurodegenerativas. Al convertir los defectos en la señalización neuronal en respuestas electrotácticas medibles, este método apoya la validación temprana de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos en las líneas de descubrimiento. El formato microfluídico proporciona lecturas fenotípicas escalables y reproducibles que mejoran la confianza predictiva en las campañas de identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la función de las neuronas dopaminérgicas con fenotipos cuantificables de locomoción.
- Valor operativo: Permite la evaluación rápida de manipulaciones genéticas y químicas que afectan la señalización neuronal mediante estimulación de electrotaxis bajo demanda.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que revierten los defectos de movimiento en modelos de PD antes de realizar estudios mamíferos costosos.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera salidas cuantitativas estandarizadas, como la velocidad de nado y la frecuencia de dobleces corporales, para evaluar la idoneidad del ensayo.
- Valor operativo: Facilita el potencial de automatización mediante el control microfluídico de la posición de los gusanos y la inversión de la polaridad del campo para medir el tiempo de reversión.
- Escalabilidad: Permite el cribado de más de 20 gusanos por hora, posibilitando cribados primarios eficientes de factores neuroprotectores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Utiliza la locomoción como una lectura funcional relevante a la enfermedad que se correlaciona con la neurodegeneración dopaminérgica en modelos de C. elegans de la enfermedad de Parkinson.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Distingue los efectos neurotóxicos de la toxicidad general al aislar defectos en la señalización neuronal mediante alteraciones en la respuesta electrotáctica.
- Alineación de Biomarcadores: Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al cuantificar la variabilidad electrotáctica dependiente de la edad en adultos jóvenes frente a larvas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo de electrotaxia microfluídico se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento como una plataforma de cribado fenotípico entre la confirmación del blanco y la optimización del candidato, proporcionando información mecanicista sobre la viabilidad neuronal.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre genes y compuestos neuroprotectores mediante la cuantificación de la recuperación locomotora en modelos de enfermedad.
- Selección: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles de locomoción que permiten la evaluación del factor Z' y la robustez del ensayo.
- Análisis: Ofrece salidas temporales de posición y velocidad para el análisis cinético de la dinámica de respuesta electrotáctica.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de variaciones en la respuesta dependientes de la edad, relevantes para la neurodegeneración de aparición tardía.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección cruzada de moduladores neuronales en diversos contextos genéticos y cepas, como C. briggsae.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en el cribado neuronal al aislar la locomoción como un indicador específico de la función neuromuscular.
- Valor operativo: Estandariza el manejo de los gusanos y la administración del estímulo, minimizando la variabilidad de los ensayos manuales y permitiendo la reproducibilidad entre diferentes centros.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al acelerar las decisiones de avance o descarte mediante el perfilado fenotípico temprano de candidatos neuroprotectores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de los aciertos basándose en la recuperación electrotáctica dependiente de la dosis en modelos transgénicos que expresan proteínas humanas asociadas a enfermedades.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de dispositivos microfluídicos, incluyendo técnicas de fotolitografía y unión de PDMS.
- Depende del acceso a sistemas de cámaras montadas en microscopios y fuentes de alimentación programables para un control preciso del campo eléctrico.
- Necesita la estandarización de protocolos de preparación de gusanos, incluyendo sincronización por edad y acondicionamiento con tampón M9.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el ensayo a otras especies de nematodos o a geometrías de canales variables.
- Se limita a la detección de fenotipos que afectan la locomoción o la electro-sensibilidad, tal como se confirma en el material de origen, que indica que solo tales mutaciones o productos químicos producen respuestas detectables.
