Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

El objetivo general de este procedimiento es identificar anormalidades en la señalización neuronal y neuromuscular en el organismo modelo de C. Allergan después de la exposición química o la manipulación genética. Esto se logra diseñando y grabando primero un patrón de microcanal en una oblea de silicio. Durante el segundo paso, el molde de silicona se utiliza para fundir uno o más microcanales a partir de PDMS.

A continuación, los componentes accesorios se fijan al molde de PDMS. A continuación, se registra el comportamiento de los gusanos a medida que se les estimula a nadar a través del microcanal utilizando una cámara montada en un microscopio. En última instancia, la electromicrofluídica se utiliza para determinar los cambios en los nematodos, los sistemas neuronal y muscular debido a la manipulación química o genética con la locomoción como lectura.

Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, especialmente los ensayos de comportamiento basados en placas, es que con esta técnica, la dirección de locomoción del gusano se puede controlar estrictamente, lo que permite una cuantificación precisa de los comportamientos de la locomotora, como la frecuencia de flexión del cuerpo, el tiempo de rotación y la velocidad de natación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de trastornos neurodegenerativos como el Parkinson y el Alzheimer, ya que se puede utilizar para detectar factores químicos y genéticos con propiedades neuroprotectoras. La primera vez que tuvimos la idea de esta técnica fue cuando nos dimos cuenta de que faltaba un método para analizar el comportamiento del movimiento del método de manera cuantitativa.

El movimiento es voluntario y aleatorio, y es difícil de caracterizar. Así que queríamos establecer un método fácil que todos puedan aprender: para hacer el molde maestro, comience bañando una oblea de silicona de tres pulgadas en acetona y luego metanol durante 30 segundos cada una. Luego enjuague la oblea con agua desionizada durante cinco minutos.

A continuación, use una pistola de soplado de nitrógeno para secar la superficie de las obleas y luego caliente la oblea en una placa caliente a 120 grados centígrados después de dos minutos, el plasma oxida la superficie de la oblea de silicio a 50 vatios durante un minuto. Ahora, con tres mililitros de SU eight 100 photo resist, recubra la superficie de la oblea a 1.750 RPM durante 40 segundos y luego hornee previamente la oblea recubierta en una placa caliente a 65 grados centígrados. Después de 10 minutos, aumente la temperatura a 95 grados centígrados durante dos minutos y hornee la oblea durante una hora más.

Después de retirar la oblea de la placa calefactora, coloque una máscara fotográfica del diseño deseado sobre la oblea. Exponga la fotoresistencia a la luz ultravioleta durante 95 segundos. Luego, hornee la oblea en una placa caliente usando el mismo gradiente de temperatura que se usa para el prehorneado después del horneado.

Sumerja la oblea en SU ocho. Desarrolle una solución durante 10 a 15 minutos. Enjuague la oblea con isopropanol para confirmar la finalización del desarrollo del diseño.

Luego enjuague con agua desionizada durante 30 segundos. Finalmente, seque la oblea con una pistola de nitrógeno y hornee brevemente a 120 grados centígrados. Ahora, coloque el molde maestro fabricado, así como una oblea de silicona en blanco, en dos placas de Petri separadas forradas con papel de aluminio.

Vierta 20 mililitros de prepolímero PDMS en el molde maestro y el plato, y 15 mililitros en el plato de obleas en blanco. A continuación, presione suavemente las obleas con un aplicador de madera desechable para eliminar las bolsas de aire debajo de las obleas, y luego cubra ambos platos y déjelos a un lado durante un día para que se curen. Una vez que las obleas se hayan curado, retire el papel de aluminio y retire el PDMS.

A continuación, utilice un unicornio Harris de 2,5 milímetros para perforar los puertos de acceso al fluido en ambos extremos del canal en el PDMS desde el molde maestro. Corta ambos discos de PDMS en tiras de tamaño similar. Luego, en una sala limpia, cargue el canal, la tira de PDMS en blanco y un vidrio se deslizan en un oxidante de plasma.

Exponga los materiales al plasma de oxígeno a 40 vatios de potencia durante 40 segundos. A continuación, pegue la pieza del canal y la corredera del vidrio a los lados opuestos de la tira en bruto y deje los materiales a un lado para completar la unión. Después de dos horas, use el prepolímero PDMS para conectar dos piezas de tubería de plástico de al menos seis pulgadas de largo a los depósitos perforados en una placa caliente a 120 grados Celsius.

Deje que el PDMS se cure antes de continuar. A continuación, fije un conector de plástico fluido a uno de los tubos para permitir la conexión de la jeringa. Ahora, inserte tres pulgadas de alambre de cobre aislado de calibre 22 en cada depósito entre el tubo de entrada y el canal que asegura los cables con más prepolímero PDMS.

Comience este paso colocando el microcanal recién ensamblado en una platina móvil XY de un microscopio con una cámara montada conectada a un monitor, conecte la fuente de alimentación a los electrodos de microcanales. Después de confirmar que la resistencia del microcanal es de alrededor de 0,6 mega ohmios, conecte el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. A continuación, sumerja la boca del tubo de entrada en una solución de nematodos suspendida en un tampón fisiológico M nine.

Aplique presión negativa dentro de la jeringa para aspirar el líquido en el canal. Cuando los tubos de entrada y salida estén llenos, desconecte la jeringa y la hidrostática. Manipule el flujo ajustando la altura relativa de los tubos para colocar un tornillo sin fin en el centro del canal.

A continuación, coloque ambos tubos planos a la misma elevación para mantener el flujo cero dentro del microcanal. Al cambiar muestras de gusano durante un experimento de electrotaxis, después de nivelar ambos tubos de entrada a la misma elevación, si todavía hay flujo, haga pequeños ajustes en la altura del tubo entre sí. Si alguna vez no estamos seguros de si el flujo es realmente cero, podemos inducir una inversión en el movimiento del gusano cambiando la polaridad del campo eléctrico y luego evaluando la velocidad lineal del gusano a medida que gira.

Ahora ajuste la fuente de alimentación al voltaje apropiado. Active la señal eléctrica y permita un minuto de preexposición para que el gusano se aclimate al campo, tiempo durante el cual el gusano debe comenzar a moverse hacia el cátodo cuando haya pasado el minuto. Comienza a grabar.

Cuando termine el experimento, retire todo el líquido y los gusanos del canal. Enjuague la cámara con agua desionizada y deje el dispositivo en una placa caliente a 125 grados centígrados para que se seque. En este video representativo, se muestra un eje eléctrico de nematodos adultos jóvenes de tipo salvaje y sus salidas de posición y velocidad del software de seguimiento de gusanos.

El video comienza con el cátodo a la derecha. La aparición de la pipeta de vidrio indica la inversión inminente y la posterior eliminación de las señales de la pipeta. El momento de inversión aquí, los datos para la posición frente al tiempo y las salidas instantáneas de velocidad frente al tiempo del programa de seguimiento de gusano personalizado para el gusano En el video se muestra el programa calculó la curva de velocidad a partir de la curva de posición y tiempo.

Este diagrama de caja muestra datos de velocidad eléctrica de un conjunto de animales salvajes y trenchgénicos. Los animales transgénicos T expresan el gen de la alfa-sinucleína humana en los músculos de la pared corporal bajo el control del promotor del gen de cadena pesada de miosina UNC 54, que causa la agregación de proteínas y se manifiesta como una respuesta electrotáctica más lenta que la de los animales de tipo salvaje. Una vez dominado, se pueden analizar más de 20 gusanos cada hora si el experimento de los electrotaxis se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo las mutaciones y los productos químicos que afectan la locomoción o la sensación electro producirán fenotipos que sean detectables por el ensayo de electroimpuestos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modelar una silicona. Ensamblamos el canal microfluídico y cómo analizar la locomoción del método de N utilizando un ensayo axxis.