Name: Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprende a caracterizar ovocitos antrales de ratón según la organización de la cromatina nucleolar. Este protocolo permite distinguir entre ovocitos SN y NSN para estudios de biología del desarrollo reproductivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.M. y C.A.R. agradecen el apoyo financiero del Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 de la Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M y C.A.R. desean agradecer a Marianna Longo por ayudar con la preparación de las imágenes.

Este protocolo se lleva a cabo de conformidad con los principios rectores de la Europea (UE) 63/2010 y 26/2014 (italianos) leyes que protegen a los animales utilizados para la investigación científica. La eutanasia Dislocación cervical se utiliza para ovarios aislamiento y es realizado por expertos y personas que figuran en el protocolo aprobado abarca este estudio entrenado. 1. Los animales <ol><li> Mantener adultos de 3 a ratones hembra de 6 semanas de edad, en una habitación con temperatura y humedad controladas (con fases de 12L: 12D y alimentados ad libitum). </li><li> Inyectar ratones por vía intraperitoneal con 2,5 UI de gonadotropina de suero de yegua embarazada (PMSG) para estimular el crecimiento folicular imitando los efectos de la hormona folículo estimulante (FSH). Aislar los ovarios para ovocitos antrales de 48 horas de recogida más tarde. La eutanasia del ratón hembra previamente inyectados con PMSG, de acuerdo con sus directrices institucionales. </li><li> Quite rápidamente los ovarios de la cavidad del cuerpo y los situará en el cont placa de Petriaining medio M2 para el aislamiento ovocitos posterior (véase la sección 3). <ol><li> Hacer una incisión en la piel que cubre la pared abdominal seguido de una incisión en el peritoneo mediante el uso de tijeras de disección estériles. Abra la incisión para exponer el abdomen, mover las agallas en un lado con unas pinzas estériles y localizar las trompas uterinas, formando una forma de V a partir de la vejiga. </li><li> Observar los ovarios ubicados debajo de los riñones. Mantenga cada tubo con pinzas estériles y hacer una pequeña incisión en la parte inferior de los ovarios para liberarlos. Transferencia ambos ovarios en la parte inferior de una placa de Petri que contiene medio de pre-equilibrada. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la hormona <ol><li> Diluir PMSG (disponible en diferentes concentraciones madre) con solución salina isotónica estéril para obtener una concentración de trabajo de 2,5 UI de hormona por 0,1 ml para un volumen de inyección adecuado. NOTA: Las soluciones de hormonas deben alícuotas en tubos de 0,5 ml y se almacenaron a -20 ° C hasta el día de uso. No mantenga alícuotas diluidas de más de tres meses a -20 ° C. Una vez descongelado, si se realizan inyecciones de serie, almacenar las alícuotas de las soluciones de la hormona en el 4 ° C y utilizarlos dentro de 4 días. </li></ol> 3. antro ovocitos Aislamiento Para el aislamiento ovocitos adecuado: <ol><li> Equilibrar medio M2 13 (M2) en 5% de CO 2 y 37 ° C durante al menos 1 hr antes de iniciar el procedimiento de aislamiento ovocitos. Preparar dos placas de Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 ml de M2 ​​para perforar ovario y la segunda una con pequeñas gotas (20 l) de M2 ​​cubierto con aceite mineral (~ 1,5 ml) para la transferencia de ovocitos después del aislamiento de la ovario (ver 3.4 a 3.6). Mantenga ambas placas de Petri en la incubadora a 5% de CO 2 y 37 ° C hasta que esté listo para ser utilizado. </li><li> Utilice un microscopio estereoscópico durante los procedimientos de aislamiento de ovocitos. </li><li> Preparar pipetas de vidrio boca delgadas para recoger los ovocitos por stretchhing pipetas Pasteur de vidrio mantienen horizontalmente (la celebración de los extremos de la pipeta con las dos manos), sobre una vertical de la llama procedente del quemador Bunsen (Figura 1). <ol><li> Una vez que el vidrio comienza a derretirse, tome la pipeta de la llama y realizar un movimiento de tracción rápida para obtener la pipeta deseada. Firmemente cortar el exceso de vidrio cerca de la punta de la pipeta con uñas para ajustar la longitud y el diámetro del capilar interno estrecho. Asegúrese de que el capilar fina tiene un diámetro interno de ~ 100 m, ligeramente mayor que el diámetro del ovocito (~ 80 m). </li><li> Para la boca pipeta, conecte un extremo del tubo de aspiración a la pipeta tirado por el uso de una punta adecuada y coloque el otro extremo en la boca, asegurándolo con los dientes. </li></ol></li><li> Recoger los ovarios usando pinzas estériles y depositarlas en la parte inferior de una placa de cultivo celular de Petri (35 mm x 10 mm). Cubra con 1 ml de M2 ​​equilibraron previamente a 37 ° Cy 5% de CO 2 (Figura 2). </li><li> Pinchar suavemente los folículos antrales de los ovarios con una aguja de jeringa de insulina estéril para liberar ovocitos antrales en M2 (Figura 3). </li><li> Suavemente boca pipetear los ovocitos a través de una pipeta Pasteur estrecha para eliminar las células del folículo y cualquier otra restos de tejido sea posible (Figura 4A) y luego conformarse ellos en la parte inferior de las pequeñas gotas (20 l) de M2 cubiertos con aceite mineral adecuado para el cultivo de embriones (anteriormente preparado; Figura 4B). NOTA: Es importante eliminar todas las células del cúmulo unidos a la zona pelúcida de los ovocitos por pipeteo continua a través de varias y diferentes gotas de M2. Realice este paso lo más rápido posible para evitar alteraciones en el pH del medio. </li></ol> 4. antral Los ovocitos tinción con Hoechst33342 NOTA: los ovocitos antrales se puede distinguir en SN (Rodeado Nucleolo), NSN (No Rodeado Nucleolo) oen cualquier otra forma intermedia, en función de su organización de la cromatina después de la tinción con la concentración de supravital Hoechst33342 (o cualquier otro marcadores específicos de bases AT) 14. De hecho, los ovocitos SN muestran un anillo de Hoechst-positivas alrededor del nucléolo, mientras que el NSN no lo hacen, de ahí su nombre. Para la tinción de ovocitos adecuado: <ol><li> La transferencia de los ovocitos utilizando una pipeta de boca en gotas de Hoechst33342 (20 l) diluido en M2 a la concentración supravital de 50 ng / l durante 10 min en oscuridad. </li><li> Después de la incubación con Hoechst33342, transferir cada solo ovocito con una pipeta de boca en la parte inferior de las pequeñas gotas (5 l) de M2 ​​cubiertos con aceite mineral, para la clasificación sobre la base de organización de la cromatina (SN o NSN). Utilice cualquier microscopio de fluorescencia equipado con filtro Hoechst33342 (longitud de onda de emisión de 486 nm) para visualizar la configuración de la cromatina de los ovocitos. NOTA: Dependiendo del tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, it puede llegar a ser imperativo el uso de fondo de cristal placa de Petri para la adquisición de imágenes. La microscopía confocal Olympus Fluoview FV10i cuando está equipado con un soporte de muestra para 35 mm plato requiere sólo de abajo a los platos de cristal para la adquisición de imágenes, con un grosor estándar de 0,17 mm y un rango de 0,13 a 0,21 mm aceptables. </li><li> Excite los ovocitos durante no más de 5-10 segundos, probablemente tiempo suficiente para visualizar la presencia o la ausencia de un anillo alrededor del nucléolo (Figura 5). </li><li> Después de la clasificación, la cultura de la SN antral y ovocitos NSN en M2 en el 5% de CO 2 y 37 ° C para inducir la maduración in vitro o mantenerlos en tampones apropiados para los análisis moleculares o celulares. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
<li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis%3A+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li>
<li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li>
<li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining%3A+a+study+using+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li>
<li>Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+%28BCB%29+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+%28IVP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biol%22%5BJournal%5D)">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li>
<li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li>
<li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li>
<li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li>
<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Este protocolo describe el método usado para aislar y clasificar antrales ratón ovocitos GV. No hay pasos críticos particulares a subrayar, con pocas excepciones. En primer lugar: este procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible para: a) mantener la vitalidad de los ovocitos y b) evitar los cambios de pH en el medio utilizado. Segunda: los ovocitos deben ser brevemente excitado (5-10 seg) para Hoechst33342 para evitar daños de la cromatina y la posterior muerte de los ovocitos, especialmente si IVM y la FIV...

Antrales ovocitos completamente crecidos (GV, vesícula germinal) aislados del compartimento antral del ovario se utilizan de forma rutinaria para diferentes propósitos, tales como, por ejemplo, el estudio de los mecanismos moleculares y celulares detrás de la maduración in vitro hasta la etapa metafase II. A pesar de sus hermosos apariencia ovocitos más antrales, pero no todos, son capaces de completar la meiosis y llegar a la etapa de blastocisto; de hecho, en muchas especies de mamíferos, incluyendo seres humanos 1,2, aproximadamente 30% de ellos detener su desarrollo en la etapa de 2 células, si se produce la fertilización 3-5. Hasta la fecha, unos parámetros se utilizan para distinguir entre ovocitos capaces de sostener el desarrollo embrionario de los que no pueden hacerlo. Por ejemplo, la tinción de azul de cresilo (BCB) es un método válido para ordenar los ovocitos basados ​​en la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa-aunque la utilidad de este método de clasificación relacionadas con BCB + o tinción es BCB-todavía depende 6-8 laboratorio. Otro método bien establecido reside en su organización de la cromatina: si se tiñeron con los tintes de intercalación de ADN (como Hoechst33342), el 70% de los ovocitos antrales muestra un anillo de tinte positivo alrededor del nucléolo y se llaman Rodeado Nucleolo (SN), mientras que el restante 30% mostrar unas señales positivas más manchados y se llaman No Rodeado Nucleolo (NSN) 3-5. Recientemente hemos demostrado que la ausencia de celosías citoplasmáticos 9 (CPL, centros de almacenamiento importantes para ARNm y ribosomas maternos en ambos ovocitos de mamíferos y embriones) 10 y la baja regulación de MATER (esencial para la formación de CPL 11), junto con la presencia de gotas de lípidos en sus citoplasmas 9,12, puede haber otras causas relacionadas con el ovocitos incapacidad NSN para continuar más allá de la etapa de 2 células. Desafortunadamente, algunas técnicas se pueden aplicar para ordenar SN antral y ovocitos NSN y,Por esta razón, el desarrollo de un método menos invasivo (sin tinción nuclear, los procedimientos de fijación o la manipulación con pipetas boca) podría llegar a ser muy importante para aumentar las tasas de tanto el desarrollo del embrión humano y animal. En este trabajo se detalle el protocolo simple y rápida utilizó para aislar ad tipo SN y NSN ovocitos antrales de ratones hembras y se dirige a todos los científicos interesados ​​en el estudio de la gametogénesis femenina, la maduración del ovocito y el desarrollo embrionario.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Plato de Cultivo Celular 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Plato 35mm, fondo de vidrio alto</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur Borosilicato</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas micropilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de ratón antral los ovocitos sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Este protocolo describe un método simple y rápido para aislar y caracterizar ovocitos de GV (Vesícula Germinal) antrales de ratón como capaces (SN, Nucleolo Rodeado) o incapaces (NSN, Nucléolo No Rodeado) de desarrollarse hasta la etapa de blastocisto después de la maduración in vitro (IVM) y la fertilización in vitro (FIV). Hace uso de Hoeschst33342 (o cualquier otro colorante intercalante de ADN) capaz de unirse a la heterocromatina del nucléolo mostrando un anillo en los ovocitos SN o no, como en los ovocitos NSN. Esto representa la forma más fácil y rápida de clasificar ambos ovocitos antrales que eventualmente se pueden usar para procedimientos de IVM o FIV. 
Brevemente, el protocolo consta de los siguientes pasos: inyección de hormonas para estimular el crecimiento folicular; aislamiento de los ovocitos en la etapa GV del compartimento antral mediante la punción del ovario con una aguja estéril; preparación de pipetas de vidrio delgadas para el pipeteo bucal de los ovocitos; clasificación de los ovocitos con Hoechst33342 preparado a una concentración supravital; IVM, FIV o cualquier otro análisis molecular/celular.
Desafortunadamente, todavía hay pocas evidencias para clasificar los ovocitos SN y NSN utilizando técnicas menos invasivas. Una vez identificadas, podrían aplicarse potencialmente a las tecnologías de reproducción asistida humana, aunque con varios aspectos que deberían modificarse. Hasta la fecha, esta técnica tiene implicaciones potenciales para aumentar drásticamente los procedimientos exitosos de IVM y FIV tanto en especies en peligro de extinción como en especies con interés económico.

Las siguientes imágenes muestran el método utilizado para aislar los ovocitos de los ovarios de ratones antrales, a partir de la preparación de las pipetas para la clasificación de los ovocitos &#39;mediante Hoechst33342. Este método es bastante sencillo y se puede realizar en cualquier laboratorio equipado con una incubadora de CO 2, un estereomicroscopio y un microscopio de fluorescencia equipado con el filtro correcto para la observación de la Hoechst33342 Figura 1<...

Aquí se presenta un protocolo para la caracterización de los ovocitos antrales ratón sobre la base de la organización nucleolar.

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

El objetivo general de este procedimiento es detallar todos los pasos necesarios para caracterizar los ovocitos antrales de ratón en función de su organización de la cromatina, según su capacidad para sostener completamente un desarrollo embrionario potencial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cómo distinguir y aislar dos tipos diferentes de ovocitos antrales, SN (nucleolo rodeado) y NSN (nucleolo no rodeado), que residen en el compartimento antral del ovario de mamíferos. Para recolectar los ovarios, comience inyectando por vía intraperitoneal a ratones hembra de tres a seis semanas de edad con 2,5 unidades internacionales de gonadotropina de suero de yegua preñada.Dos días después, aproximadamente una hora antes de la recolección, llene un plato de Petri estéril con medio M2 y agregue varias gotas de 20 microlitros de medio M2 a un segundo plato de Petri, cubriendo cada gota con 1,5 mililitros de aceite mineral. A continuación, transfiera todos los platos de Petri a una incubadora a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono para permitir que el medio se equilibre. Luego, utilice tijeras de disección estériles para hacer una incisión en la piel que cubre la pared abdominal, seguida de una incisión en el peritoneo del primer ratón inyectado con hormona.Utilice pinzas estériles para mover los intestinos a un lado y localizar los tubos uterinos, que forman una forma de V a partir de la vejiga. Después de localizar los ovarios debajo de los riñones, sujete un tubo uterino y libere el ovario correspondiente mediante una pequeña incisión en la parte inferior del tejido. Repita el proceso para extraer el otro ovario, y luego coloque ambos ovarios en la placa de Petri llena con medio M2 pre-equilibrado.Antes de aislar el ovocito antral, prepare pipetas de vidrio para boca agarrando ambos extremos de una pipeta Pasteur de vidrio y sosteniéndola horizontalmente sobre la llama de un mechero Bunsen. Cuando el vidrio comience a fundirse, retire la pipeta de la llama y tire rápidamente del instrumento para separarlo. Utilizando una uña, corte firmemente el exceso de vidrio cerca del punto estrecho de la pipeta para acortar la punta y lograr un diámetro interno del capilar de aproximadamente 100 micrones.Es importante tener un diámetro adecuado de pipeta. Si es demasiado estrecho, los ovocitos quedarán atrapados, se fragmentarán y morirán. Luego, conecte el extremo no modificado de la pipeta a un tubo de aspiración.A continuación, transfiera los ovarios al platillo de Petri que contiene un mililitro de medio M2 pre-equilibrado y use una aguja estéril de jeringa para insulina para perforar suavemente los folículos antrales de los ovarios. A medida que se liberen los ovocitos, recójalos suavemente con una pipeta de boca, teniendo cuidado de no aspirar células foliculares ni otros restos de tejido. Luego, aspire rápidamente cada ovocito a través de varias gotas de medio M2 pre-equilibrado para eliminar todas las células del cúmulo adheridas a la zona pelúcida de los ovocitos.Una vez que los ovocitos hayan sido desnudados, colóquelos cuidadosamente en el fondo de gotas individuales de medio M2 fresco y equilibrado. Para teñir los ovocitos, utilice una pipeta de boca para transferir las células a gotas de 20 microlitros de Hoechst 33342 diluido en medio M2. Luego transfiera los ovocitos a una nueva placa de Petri que contenga gotas de cinco microlitros de medio M2 cubiertas con aceite mineral, teniendo cuidado de colocar individualmente cada ovocito en el fondo de cada gota.Una vez que se hayan transferido todos los ovocitos, coloque la placa bajo el microscopio fluorescente y excite las células solo el tiempo necesario para visualizar la presencia o ausencia de un anillo alrededor del nucléolo. Tenga cuidado de no sobreexponer los ovocitos, ya que la cromatina puede dañarse y los ovocitos pueden morir si se exponen durante demasiado tiempo. Después de identificar los ovocitos SN y NSN, separe las células en la placa de Petri correspondiente adecuada, según su organización de la cromatina, utilizando el reactivo relevante para el análisis posterior deseado.La tinción con Hoechst 33342 para la organización de la cromatina es probablemente el paso más crítico del procedimiento. De cinco a 10 segundos de excitación deberían ser suficientes para clasificar los ovocitos según la presencia o ausencia de cromatina alrededor del nucléolo de cada ovocito. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de tres horas si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante trabajar a temperatura ambiente y recordar tratar con delicadeza tanto los ovarios como los ovocitos. Tras seguir este procedimiento, los ovocitos pueden utilizarse entonces para la maduración in vitro y la fertilización in vitro. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo pudieran responder a una pregunta aún sin resolver: cómo reconocer y distinguir entre dos tipos de ovocitos antrales que residen en los ovarios de los mamíferos.Después de ver este video, tendrá un buen conocimiento sobre cómo fabricar y utilizar su propia pipeta bucal, así como sobre cómo aislar y clasificar ovocitos antrales mediante la tinción con Hoechst 33342. No olvide que trabajar con animales y células requiere precauciones especiales, como usar equipo de protección personal y emplear instrumentos esterilizados.

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Este video describe el aislamiento de ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados. Estos ovocitos antrales se pueden utilizar para estudios posteriores de caracterización y desarrollo.

Aislamiento de ovocitos antrales de ratón: un método para aislar ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación no invasiva de competencia desarrollo de oocito durante su maduración en vitro de la vesícula germinal a la etapa de metafase II. Este método combina la proyección de imagen de Time-lapse con partículas imagen velocimetry (PIV) y análisis de redes neuronales.

Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Aprende a caracterizar ovocitos antrales de ratón según la organización de la cromatina nucleolar. Este protocolo permite distinguir entre ovocitos SN y NSN para estudios de biología del desarrollo reproductivo.

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

Explorar más videos