Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

El objetivo general de este procedimiento es detallar todos los pasos necesarios para caracterizar los ovocitos antrales de ratón en función de su organización de la cromatina, de acuerdo con su capacidad para mantener completamente un desarrollo embrionario prospectivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como por ejemplo cómo distinguir y aislar dos tipos diferentes de ovoctos antrales, SN, nucléolo rodeado, y NSN, nucléolo no rodeado, que reside en el compartimento antral del ovario de los mamíferos. Para extraer los ovarios, comience inyectando ratones hembra IP de tres a seis semanas de edad con 2,5 unidades internacionales de gonadotropina sérica de yegua preñada.

Dos días después, aproximadamente una hora antes de la cosecha, llene una placa de Petri estéril con medio M2 y agregue varias gotas de 20 micriliteros de medio M2 a una segunda placa de Petri, cubriendo cada gota con 1,5 mililitros de aceite mineral. Luego, transfiera todas las placas de Petri a una incubadora de dióxido de carbono al 5% de 37 grados Celsius para permitir que el medio se equilibre. A continuación, utilice unas tijeras de disección estériles para hacer una incisión en la piel que cubre la pared abdominal, seguida de una incisión en el peritoneo del primer ratón inyectado con hormonas.

Use pinzas estériles para mover los intestinos a un lado y localizar las trompas uterinas, que forman una V a partir de la vejiga. Después de ubicar los ovarios debajo de los riñones, agarre una trompa uterina y libere el ovario correspondiente con una pequeña incisión en la parte inferior del tejido. Repita el proceso para extraer el otro ovario y luego coloque ambos ovarios en la placa de Petri llena de medio M2 preequilibrado.

Antes de aislar el ovocito antral, haga pipetas de boca de vidrio agarrando ambos extremos de una pipeta Pasteur de vidrio y sosteniendo la pipeta horizontalmente sobre la llama de un mechero Bunsen. Cuando el vidrio comience a derretirse, retire la pipeta de la llama y separe rápidamente el instrumento. Con una uña, corte firmemente el exceso de vidrio cerca del punto estrecho de la pipeta para acortar la punta y lograr un diámetro capilar interno de aproximadamente 100 micras.

Es importante tener el diámetro de pipeta adecuado. Si es demasiado estrecho, los ooyctes se atascarán, se fragmentarán y morirán. A continuación, conecte el extremo no modificado de la pipeta a un tubo aspirador.

A continuación, transfiera los ovarios a la placa de Petri que contiene un mililitro de medio M2 preequilibrado y utilice una aguja de jeringa de insulina estéril para perforar suavemente los folículos antrales de los ovarios. A medida que se liberan los ovocitos, recójalos suavemente con una pipeta bucal, teniendo cuidado de no aspirar ninguna célula folicular u otros restos de tejido. A continuación, pipetea rápidamente cada ovocito a través de múltiples gotas de medio M2 preequilibradas para eliminar todas las células del cúmulo unidas a la zona pelúcida de los ovocitos.

Una vez que los ovocitos hayan sido desnudados, asiente cuidadosamente los ovocitos en el fondo de gotas individuales de medio M2 fresco y equilibrado. Para teñir los ovocitos, utilice una pipeta bucal para transferir las células a 20 gotas de microlitros de Hoechst 33342, diluidas en medio M2. A continuación, transfiera los ovocitos a una nueva placa de Petri que contenga cinco gotas de microlitros de medio M2 cubiertas de aceite mineral, teniendo cuidado de asentar los ovocitos individualmente en el fondo de cada gota.

Cuando se hayan transferido todos los ovocitos, coloque la placa bajo el microscopio fluorescente y excite las células el tiempo suficiente para visualizar la presencia o ausencia de un anillo alrededor del nucléolo. Tenga cuidado de no sobreexponer los ovocitos, ya que la cromatina puede dañarse y los ovocitos pueden morir si se exponen demasiado tiempo. Una vez identificados los ovocitos SN y NSN, clasifique las células en la placa de Petri correspondiente adecuada en el reactivo correspondiente para el análisis posterior deseado, de acuerdo con su organización de cromatina.

La tinción de Hoechst 33342 para la organización de la cromatina es probablemente el paso más crítico del procedimiento. De cinco a 10 segundos de excitación deben ser suficientes para clasificar los ovocitos en función de la presencia o ausencia de cromatina que rodea el nucléolo de cada ovocito. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante trabajar a temperatura ambiente y recordar tratar ambos ovarios y ovocitos con cuidado. Siguiendo este procedimiento, los ovocitos se pueden utilizar para la maduración in vitro y la fertilización in vitro. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo respondieran a una pregunta aún abierta, cómo reconocer y distinguir entre dos tipos de ovocitos antrales que residen en los ovarios de los mamíferos.

Después de ver este vídeo, tendrá una buena comprensión de cómo hacer y utilizar su propia pipeta bucal, cómo aislar y clasificar ovocitos antrales mediante la tinción de Hoechst 33342. No olvide que trabajar con animales y células requiere precauciones especiales, como usar su equipo de protección personal y usar instrumentos esterilizados.