Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Estamos desarrollando kits para ensayos de inmunofluorescencia multiplex rápidos y sensibles. El objetivo aquí es ayudar a los investigadores a perfilar diferentes tipos de células que aparecen en el tejido FFPE

La inmunofluorescencia se lleva a cabo comúnmente utilizando anticuerpos secundarios marcados con colorante o con peroxidasa. La inmunohistoquímica tiende a ser plexa baja. Los anticuerpos secundarios marcados con colorante sufren de menor señal. Los ensayos de amplificación de señales de tiramida son laboriosos de optimizar y tardan de varias horas a varios días en ejecutarse.

Los marcadores de los ensayos vienen preoptimizados y es significativamente más rápido que otras técnicas. Colocar cuatro marcadores lleva menos de ocho horas, y aproximadamente tres horas más por cada cuatro biomarcadores adicionales.

La capacidad de ejecutar inmunofluorescencia multiplex más rápido permitirá que la proteómica espacial se aplique más ampliamente y reducirá la barrera para comprender la contextura espacial del tejido.

[Narrador] Para comenzar, descongele todos los reactivos del kit a temperatura ambiente. Almacene los conjugados de anticuerpos, la enzima de amplificación, el iniciador de intercambio y el neutralizador de intercambio a menos 20 grados Celsius hasta su uso. Vortex, un diluyente de anticuerpos descongelado. Pipetea el diluyente de anticuerpos en un recipiente. Centrifugar brevemente y añadir todos los anticuerpos en el recipiente 1 de la solución de tinción de anticuerpos. Agregue el diluyente de anticuerpos provisto en una dilución de 1 a 100. A continuación, utilice una pipeta para mezclar la solución suavemente, evitando el vórtice. Agite la solución mezclada de preamplificación después de descongelarla para mezclar bien. Luego agregue la solución en el recipiente de mezcla respectivo. Agite el tampón de amplificación y mezcle la pipeta con la enzima de amplificación. Diluya la enzima de amplificación en una proporción de 1 a 10 en el tampón de amplificación para crear el tampón de amplificación. Mezclar suavemente pipeteando, evitando el vórtice. Luego agite y centrifugue la solución de contratinción nuclear provista y diluya de 1 a 100 en agua ultrapura. A continuación, diluya la solución de las sondas fluorescentes 1 en una proporción de 1 a 20 en el tampón de la sonda. Inserte la varilla de reactivo completa en el instrumento para permitir que se midan los volúmenes de reactivos. Vaya a la pestaña Configuración de portaobjetos en la parte superior del software de tinción automática una vez que todos los reactivos estén preparados. Haga clic en el botón Agregar estudio e ingrese el ID del estudio, el nombre del estudio y los comentarios del estudio según sea necesario. En Volumen de dispensación, seleccione 150 microlitros y elija *Desparafinado 4 pasos como método de preparación. Si no está disponible en el menú desplegable, abra el menú Configuración del protocolo, marque la casilla de verificación preferida y haga clic en Aceptar. Una vez creado el estudio, haga clic en el botón Agregar diapositiva ubicado en el lado derecho de la pantalla Configuración de diapositivas. Introduzca un nombre único para la diapositiva en Comentarios de diapositivas. Establezca el Tipo de tejido en Probar tejido en el campo apropiado. Luego elija 150 microlitros para el volumen de dispensación y configure el modo de tinción en Solo en el menú desplegable de la izquierda y Rutina en el menú desplegable de la derecha. En Proceso, elija IHC y establezca el Marcador en solución de tinción de anticuerpos. En la sección Protocolos de la ventana Agregar diapositiva, seleccione Ensayo de tinción 1 para tinción, *Desparafinado 4 pasos para preparación y *HIER 20 minutos con ER2 para HIER. Deje el protocolo Enzyme establecido en un guión de asterisco y haga clic en Agregar diapositiva cuando todos los campos estén completos. Después de agregar todas las diapositivas, cierre la ventana Agregar diapositiva e imprima las etiquetas de las diapositivas, colocándolas en la sección de tejido correspondiente. Cargue cada portaobjetos etiquetados en la bandeja y coloque los mosaicos de cobertura encima de cada sección de tejido. Inserte la bandeja deslizante en el instrumento y seleccione el tinte automático correspondiente en el lado derecho de la pantalla del software. Confirme que las tres bandejas de portaobjetos y toda la información de los reactivos, incluidos los reactivos a granel y preparados, sean visibles. Compruebe que los contenedores de reactivos a granel estén adecuadamente llenos y que los contenedores de residuos tengan suficiente volumen para completar el proceso. Luego presione el botón de reproducción para comenzar la ejecución de tinción y asegúrese de retirar oportunamente los portaobjetos del teñidor automático una vez que se complete el procedimiento. Coloque los portaobjetos teñidos en el tampón PBS y aplique cubreobjetos con el medio de montaje. Obtener imágenes de los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia o un escáner de portaobjetos completo con filtros compatibles con los colorantes de ensayo. Para el ensayo de intercambio, descongele el tampón de intercambio a temperatura ambiente. Mantenga el neutralizador de intercambio y el iniciador de intercambio almacenados a menos 20 grados Celsius hasta que estén listos para usar. Prepare dos recipientes de valoración de reactivos y recupere el kit de detección para utilizarlo durante el protocolo de intercambio. Agite el búfer de intercambio. Y la pipeta mezcla el iniciador de intercambio. Prepare la solución de intercambio en su recipiente designado mezclando los volúmenes necesarios de iniciador de intercambio y búfer de intercambio. Mezcle el contenido pipeteando solamente. Ahora combine la solución de sondas fluorescentes 2 con el tampón de intercambio diluido en el recipiente respectivo. Agite solo el tampón de la sonda y la mezcla de la sonda fluorescente y la pipeta mezcle la solución final. Coloque la varilla de reactivo completa con todos los reactivos preparados en el teñidor automático. Permita que la máquina realice una prueba de inmersión en todos los reactivos. Después de agregar las diapositivas, establezca el marcador en *Negativo. Y para Preparación, HIER y Enzima, seleccione la opción de guión de asterisco, ya que no se necesita desparafinado ni recuperación de antígenos para el protocolo de intercambio. Haga clic en Agregar diapositiva cuando haya terminado. Después de agregar todas las diapositivas, cierre la ventana Agregar diapositiva e imprima las etiquetas de diapositivas para colocarlas en cada sección de tejido correspondiente. Cargue cada portaobjetos en la bandeja y coloque una baldosa de cobertura sobre cada sección de tejido antes de colocar la bandeja en el tinte automático. Ahora presione el botón de reproducción para iniciar la carrera. Las imágenes de un núcleo de microarray tisular capturadas en dos rondas de tinción utilizando un protocolo de inmunofluorescencia de ocho plex mostraron marcadores inmunes distintos en cada ronda, con un co-registro de imágenes exitoso que combina ambas rondas en un compuesto unificado. Las imágenes de portaobjetos completos del tejido de cáncer colorrectal permitieron la identificación de fenotipos inmunes basados en la colocalización de marcadores, incluidas las células T reguladoras, las células T agotadas y los macrófagos inmunosupresores. La tinción de inmunofluorescencia mostró coexpresión de CD3, CD4 y FoxP3 en células T reguladoras. PD1 y PDL1 en células tumorales y del estroma. CD3, CD8 y PD1 en células T citotóxicas agotadas. Y CD 68 y PDL1 en macrófagos inmunosupresores. La comparación de la inmunohistoquímica de un solo marcador y la inmunofluorescencia simple o múltiple confirmó la concordancia cualitativa en los patrones de tinción en todos los marcadores. La tinción en serie en diferentes tipos de tejidos confirmó patrones de expresión consistentes de marcadores inmunes con núcleos de tejido representativos, mostrando una tinción exitosa y una variabilidad mínima. Las secciones de amígdalas teñidas en seis portaobjetos en serie para CD8 demostraron una alta reproducibilidad con una distribución de señal casi idéntica en todas las imágenes. La cuantificación de las densidades celulares positivas para marcadores en todos los tipos de tejido mostró densidades más altas en amígdalas y ganglios linfáticos, y más bajas en melanoma y colon.