Name: El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a extraer ADN genómico de biopsias de cola en ratones de 10 días usando técnicas de digestión con proteinasa K. Este método evita contaminación cruzada y permite identificar individuos mediante perforación de orejas.

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<ol style="margin-top: 0in"><li> Corte los pedazos de cola (3 mm) y las orejas marca. </li><li> Añadir 720 m l STE y 30 m l de proteinasa K (10 mg / ml). </li><li> Se incuba a 55 ° C en el bloque de calentamiento y agitar cada hora durante 3 horas a la máxima velocidad durante 10 segundos. </li><li> Inactivar la proteinasa K a 70 ° C durante 5 minutos. </li><li> Apagar en hielo durante 5 minutos. </li><li> Centrífuga ADN cola durante 10 minutos a toda velocidad. </li><li> Decantar en el tubo nuevo que contiene 720 m l de isopropanol. &nbsp; </li><li> ADN precipitado invirtiendo el tubo o agitación. </li><li> Girar el ADN durante 5 minutos a toda velocidad. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar precipitado con etanol al 70%. </li><li> Girar el ADN genómico 5 minutos a máxima velocidad. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Permitir que el ADN que se seque durante 1-2 minutos. </li><li> Resuspender el ADN en 100 a 200 l m dependiendo del tamaño del pellet. </li><li> Colocar el tubo a 55 º C durante 1 hora para facilitar la disolución de ADN. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / en H2O</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de adn genómico de colas de ratón

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Este es un ratón de 10 días de edad y voy a tomar una biopsia de la cola para luego extraer el ADN genómico de su cola. Lo que voy a hacer es cortar un pequeño trozo de su cola, aproximadamente unos tres milímetros, y luego colocaré el fragmento de cola en un tubo eppendorf y pondré el tubo eppendorf sobre hielo seco. Ahora, para evitar la contaminación de un ratón a otro, suelo marcar la cuchilla de afeitar en la parte donde hice el último corte.De esta manera, para el siguiente ratón, me aseguraré de usar una pieza limpia de hoja de afeitar para tomar la siguiente biopsia de cola. Con el fin de distinguir entre los diferentes ratones de tu camada, necesitarás una forma de identificarlos. Una manera de hacerlo es perforando un orificio en sus orejas mediante un perforador de orejas que se muestra aquí.Agarre suavemente al ratón por el pescuezo de su cuello, dándolo vuelta y pellizcando su cola entre los dedos. Tome el orificio de la oreja con la otra mano y haga un corte rápido en la oreja del ratón allí. ¿Vio lo indoloro que fue?Vale, ahora pueden ver que tengo algunos fragmentos de cola en estos tubos eppendorf y ahora voy a añadir las soluciones que ayudarán a su digestión. Primero voy a agregar 720 microlitros de solución STE, y luego añadiré 30 microlitros de proteína Ace K. A continuación se muestra el fragmento de cola que cortamos antes de la digestión.Ahora voy a colocar los fragmentos de cola en un bloque calefactor de 55 grados. Muchos protocolos requieren agitación continua a 55 grados, pero para mis propósitos esto no será necesario porque voy a vórtexar los fragmentos de cola. Ahora voy a vórtexar el fragmento de cola durante dos segundos.Uno, dos. Entonces, tras la agitación en vórtex, observe cómo queda el contenido dentro del tubo einor; puede ver que el trozo de cola se ha disuelto completamente. Active la proteinasa K a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Detenga la reacción enfriando en hielo durante cinco minutos.Centrifugar los fragmentos de cola en una microcentrífuga durante 10 minutos a velocidad máxima. En esta microcentrífuga, la velocidad máxima es de 13.000 rpm. Mientras los fragmentos digestivos se centrifugan, etiquetar algunos tubos eppendorf y llenarlos con 750 microlitros de isopropanol.Tras centrifugar las colas digeridas, el pelo y los materiales no digeridos formarán un precipitado en el fondo del tubo. La solución que contiene el material digerido, STE y proteinasa K se verterá en el tubo eppendorf que contiene el ADN en isopropanol; el ADN comenzará a salir de la solución, tendrá un aspecto fantasmal y similar a plumas, y justo allí, flotando alrededor de esa burbuja, se encontrará el ADN genómico aislado de la cola del ratón. Después de mezclar la solución de isopropanol y STE, el ADN genómico saldrá de la solución y aparecerá como esta pequeña bola aquí presente; centrifugue el ADN genómico precipitado durante cinco minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga.Allí, en el fondo del tubo, se observa nuestro ADN genómico en forma de pellet. Ahora voy a aspirar la solución dentro del tubo, dejando únicamente el pellet de ADN genómico. Cada vez que aspire otro tubo, cambiaré la pipeta.Punta de pipeta en la punta de este aspirador. Después de aspirar el STE y el isopropanol, añadiré un mililitro de etanol al 70 % para lavar el pellet de ADN genómico. Dado que el pellet de ADN genómico generalmente se adhiere a la pared del tubo de microcentrífuga y es difícil desprenderlo para lavarlo completamente en el etanol al 70 %, será necesario rasparlo a lo largo del soporte para tubos de microcentrífuga que tengo aquí.Puede hacerlo de la siguiente manera. Aquí se muestra una vista del ADN genómico después de que ha sido centrifugado y lavado con etanol al 70 %. Voy a centrifugar esto nuevamente a velocidad máxima durante cinco minutos y luego aspirar el etanol al 70 %, centrifugando los pellet de ADN genómico después de haber sido lavados.Su 70 % de etanol durante cinco minutos a velocidad máxima, proceder a aspirar el 70 % de etanol y dejar secar el ADN durante cinco minutos. Observen el pellet de ADN genómico en el fondo del tubo, que debe quedar aproximadamente así de seco. He secado los pellets de ADN genómico obtenidos de las colas de ratón, y ahora voy a añadir cien microlitros de tris 40 milimolar a pH ocho.Así que tengo el ADN genómico a 50 grados Celsius, donde pasará a solución más rápidamente que si se añade a temperatura ambiente. Después de aproximadamente una hora a 50 grados, lo congelaré o lo colocaré a cuatro grados hasta que desee realizar mis reacciones de PCR para determinar exactamente qué ratones son positivos para mi transgén.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La determinación del genotipo completo de una muestra de cola de ratón, incluyendo la digestión del tejido y la lectura de PCR, se realiza en una hora y media utilizando SYBR Sigma verde Extract-N-Amp PCR kit de tejido.

Genotipificación rápida de tejido de ratón utilizando extracto-N-Amp tejido Sigma PCR Kit

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

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Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

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Culturas Generación de fibroblastos primarios de mouse de oreja y rabo tejidos

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La Lambda seleccione cII sistema de detección de mutación

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El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

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