El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Este es un cachorro de ratón de 10 días y voy a tomar una biopsia de la cola y luego voy a extraer ADN genómico de su cola. Así que lo que voy a hacer es cortarle un poco de la cola, unos tres milímetros, y luego voy a colocar el trozo de cola en un tubo de einor y voy a colocar el tubo de einor en hielo seco. Ahora, para evitar la contaminación de un ratón a otro, suelo marcar la hoja de afeitar en la parte en la que hice el último corte.

De esa manera, para el próximo ratón, me aseguraré de usar un trozo limpio de hoja de afeitar para tomar la próxima biopsia de cola. Para distinguir entre los diferentes ratones de tu camada, necesitarás una forma de identificarlos. Una forma de hacerlo es perforando un agujero en sus orejas con un perforador de agujeros para orejas que se muestra aquí.

Toma suavemente al ratón por el pescuezo como si le dieras la vuelta y pellizcara su cola entre los dedos. Tome la perforación del orificio de la oreja en la otra mano y haga un corte rápido en la oreja del ratón allí. ¿Ves lo indoloro que fue?

Bien, ahora puedes ver que tengo algunos trozos de cola en estos tubos de einor y ahora voy a agregar las soluciones que les ayudarán a digerir. Primero voy a agregar 720 microlitros de solución de Stes, y luego voy a agregar 30 microlitros de proteína. Ace K.So aquí hay un vistazo al trozo de cola que hemos cortado antes de la digestión.

Ahora voy a colocar las piezas de la cola en un bloque calefactor de 55 grados. Muchos protocolos requieren un balanceo de movimiento continuo a 55 grados, pero para mis propósitos esto no será necesario porque estaré vórtice las piezas de la cola. Ahora voy a hacer un vórtice del trozo de cola durante dos segundos.

Uno, dos. Así que después del vórtice, aquí hay un vistazo a lo que queda dentro del tubo de einor aquí, y se pudo ver que el trozo de cola se ha disuelto por completo y activar la proteinasa K a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Enfríe en hielo durante cinco minutos.

Gire las piezas de cola en una microcentrífuga durante 10 minutos a toda velocidad. En esta microcentrífuga, la velocidad máxima es de 13, 000 RPM. Mientras las colas digestivas giran hacia abajo, etiquete algunos tubos de einor y llene los tubos de einor con 750 microlitros de isopropanol.

Después de girar las colas digeridas, el pelo y el material no digerido formarán una bolita en el fondo del tubo de decantación. La solución que contiene el material digerido, STE y proteinasa K en el tubo de einor que contiene el ADN del isopropanol comenzará a salir de la solución, aparecerá como un fantasma y como una pluma, y allí mismo nadando alrededor de esa burbuja está el ADN genómico que se ha aislado de la cola del ratón. Después de mezclar la solución de isopropanol y STE, el ADN genómico saldrá de la solución y aparecerá como esta pequeña bola aquí, gire el ADN genómico precipitado durante cinco minutos a toda velocidad en una microcentrífuga.

Allí, en el fondo del tubo, hay una mirada a nuestro ADN genómico granulado. Ahora voy a aspirar la solución dentro del tubo, dejando solo la bolita de ADN genómico. Cada vez que aspire otro tubo, cambiaré el tubo.

Punta de mascota en la punta de este aspirador. Después de aspirar el STE y el isopropanol, agregaré un mililitro de etanol al 70% para lavar la bolita de ADN genómico. Debido a que la bolita de ADN genómico generalmente se adhiere al costado de un tubo de micro fuga y es difícil de quitar para lavarla a fondo en el etanol al 70%, deberá rastrillarla a través de la rejilla de tubos de micro fuga que tengo aquí.

Puedes hacerlo así. Así que aquí hay un vistazo al ADN genómico después de que haya sido granulado y lavado en etanol al 70%. Voy a girar esto de nuevo a toda velocidad durante cinco minutos y luego aspirar el 70% de etanol y girar las bolitas de ADN genómico después de que se hayan lavado.

Su etanol al 70% cinco minutos a toda velocidad, aspirando el etanol al 70% y dejando secar el ADN durante cinco minutos. Hay una mirada a la bolita de ADN genómico en el fondo del tubo, y eso es tan seco como quieras obtenerlo. Así que he secado los gránulos de ADN genómico de las colas de ratón, y ahora voy a añadir cien microlitros de triss de 40 milimolares a pH ocho.

Así que tengo el ADN genómico a 50 grados centígrados, donde se disolverá más rápidamente que a temperatura ambiente. Después de aproximadamente una hora más o menos a 50 grados, lo congelaré o lo pondré a cuatro grados hasta que quiera ejecutar mis reacciones de PCR para averiguar qué ratones son positivos para mi transgén.