Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

El objetivo general de este procedimiento es identificar los sitios de integración de vectores retrovirales en el genoma del huésped y cuantificar las frecuencias relativas de las poblaciones de células clonales, cada una de las cuales comparte el mismo sitio de integración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la terapia génica retroviral, como qué parte del vector del genoma del huésped se ha integrado, cómo se repoblará una célula modificada genéticamente después del trasplante y cómo son funcionalmente diferentes. La principal ventaja de esta técnica es que las secuencias de sitios de retrointegración se pueden analizar con mayor precisión y sensibilidad mediante la secuenciación simultánea de las uniones de ADN del huésped vectorial aguas arriba y aguas abajo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la seguridad de los vectores y las células modificadas genéticamente en estudios de terapia génica, también se puede aplicar a otros estudios básicos de biología para investigar el comportamiento de las células individuales in vivo. El primer paso en este procedimiento es determinar la concentración de ADN y la relación de absorbancia a 260 y 280 nanómetros del ADN genómico a analizar. Después de esto, diluya uno o dos microgramos de la muestra de ADN genómico hasta un volumen final de 170 microlitros de solución de ADN genómico utilizando agua libre de nucleasas.

Prepare una reacción de PCR de 200 microlitros mezclando lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 2,5 microlitros de cebadores de biotina específicos para el VIH-1, o un total de 10 microlitros para cuatro cebadores específicos de lentivirus, 20 microlitros de tampón de ADN polimerasa termoestable 10X, cuatro microlitros de dNTP de 10 milimolares, tres microlitros de ADN polimerasa termoestable y 163 microlitros de ADN genómico. Divida la solución en partes iguales en cuatro tubos de PCR y realice un solo ciclo de extensión en la siguiente condición.

94 grados Celsius durante 5 minutos, 56 grados Celsius durante 3 minutos, 72 grados Celsius durante 5 minutos y 4 grados C para almacenamiento. Agrupe las cuatro reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Siga el procedimiento del fabricante de un kit de purificación de PCR y eluya con 50 microlitros de tampón de elución.

Prepárese para una digestión de 100 microlitros agregando lo siguiente a un tubo de microcentrífuga: 50 microlitros de ADN, 10 microlitros de tampón A 10X, dos microlitros de enzima RSAI y 38 microlitros de agua sin nucleasa. Incubar a 37 grados centígrados en un termociclador durante una hora.

A continuación, agregue un microlitro de enzima CviQI a la reacción e incube a 25 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando se complete la digestión de RSAI y CviQI, proceda inmediatamente con la terminación roma. Prepare una mezcla de 4,5 microlitros que contenga 2,5 microlitros de ADN polimerasa I, fragmento grande, y 2 microlitros de dNTP de 10 milimolares.

Transfiere 1 microlitro de la mezcla a la muestra de ADN. El volumen total será de 102 microlitros. Mezclar bien por vórtice e incubar a 25 grados centígrados durante una hora.

Proceda inmediatamente con la unión de las perlas de estreptavidina cuando se complete la incubación. Prepare las perlas de estreptavidina mediante un breve vórtice de la solución de perlas y transfiriendo 50 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Retire el sobrenadante con un soporte magnético y lave los frijoles con 200 microlitros de solución aglutinante.

Vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de solución aglutinante y coloque el tubo lejos del soporte magnético. Transfiera 100 microlitros de la muestra de ADN a los 100 microlitros de solución de perlas resuspendidas y mezcle cuidadosamente pipeteando para evitar la formación de espuma en la solución. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 3 horas en una rueda giratoria.

Utilice el soporte magnético para capturar las cuentas y desechar el sobrenadante. Lave las perlas dos veces en 400 microlitros de solución de lavado y dos veces en 400 microlitros de tampón de ADN ligasa 1X T4. Vuelva a suspender las perlas en 200 microlitros de tampón de ADN ligasa 1X T4 y colóquelo lejos del soporte magnético.

La ligadura del enlazador debe realizarse inmediatamente después de la unión de las perlas de estreptavidina. Prepare una solución de reacción de ligadura de 400 microlitros mezclando lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. 0,5 microlitros del enlazador de ADN, 10 microlitros de tampón de ADN ligasa T4 10X, 20 microlitros de tampón de ADN ligasa T4 5X, 5 microlitros de ADN ligasa T4, 164,5 microlitros de agua libre de nucleasas y 200 microlitros de las perlas resuspendidas.

Coloque el tubo de reacción en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 3 horas. Lave las perlas dos veces con la solución de lavado y dos veces con tampón de ADN polimerasa termoestable 1X. Vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón PCR de ADN polimerasa termoestable 1X y colóquelo lejos del soporte magnético.

Para comenzar este procedimiento, prepare una reacción de PCR de 200 microlitros agregando lo siguiente a las perlas resuspendidas: 10 microlitros de un cebador 1L, 10 microlitros de cebador 1R, 20 microlitros de cebador Link1, 10 microlitros de tampón de ADN polimerasa termoestable 10X, cuatro microlitros de dNTP de 10 milimolares, ocho microlitros de ADN polimerasa termoestable y 88 microlitros de agua sin nucleasasa. Alícuota la mezcla de reacción en cuatro tubos de PCR y realizar la PCR con la siguiente condición.

94 grados Celsius durante 2 minutos, 25 ciclos de 94 grados Celsius durante 20 segundos, 56 grados Celsius durante 25 segundos y 72 grados Celsius durante dos minutos, y una extensión final a 72 grados Celsius durante 5 minutos. Agrupe las cuatro reacciones de PCR en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Siga el procedimiento del kit de purificación de PCR y eluya con 50 microlitros de tampón de elución.

Determine la concentración de ADN y la relación de absorbancia a 260 y 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro visible UV. El ADN ahora se puede almacenar a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para el siguiente paso. Dado que los procedimientos para las amplificaciones específicas de la unión izquierda y la unión derecha son idénticos, excepto por los cebadores utilizados en la PCR, solo se demostrará la amplificación de la unión izquierda.

Prepare una reacción de PCR de 50 microlitros mezclando lo siguiente en un tubo de PCR. Cinco microlitros de ADN, cinco microlitros de 10 micromolares de 2L-primer, cinco microlitros de 10 micromolares de cebador Link2, 5 microlitros de tampón de ADN polimerasa termoestable 10X, un microlitro de dNTP de 10 milimolares, dos microlitros de ADN polimerasa termoestable y 27 microlitros de agua libre de nucleasas. Realizar PCR con la siguiente condición.

94 grados Celsius durante 3 minutos, 8 a 15 ciclos de 94 grados Celsius durante 20 segundos, 56 grados Celsius durante 25 segundos y 72 grados Celsius durante dos minutos, y una extensión final a 72 grados Celsius durante 5 minutos. Utilice el kit de purificación de PCR para purificar el ADN y eluir con 50 microlitros de tampón de elución. Determine la concentración de ADN y la relación de absorbancia a 260 y 280 nanómetros.

El último paso en la generación de bibliotecas de secuencias de unión izquierda y derecha es analizar las variaciones de longitud del amplicón de PCR mediante la realización de electroforesis capilar. Este resultado representativo muestra longitudes variables de amplicones de PCR en sitios de integración de vectores lentivirales para las uniones de huéspedes vectoriales aguas arriba y aguas abajo. El marcador de tamaño de ADN está en el carril M.

Después de secuenciar los amplicones de PCR, se realiza un análisis de la secuencia del sitio de integración computacional utilizando un script de programación interno. El ensayo del sitio de integración bidireccional genera diferentes tamaños de amplicones de PCR para las uniones vectoriales del huésped aguas arriba y aguas abajo visualizadas por electroforesis capilar. Una comparación del porcentaje de integración en los genes Alu y L1 de repeticiones de vectores lentivirales en células de repoblación de ratón humanizadas dentro de eventos de integración aleatorios generados por silico reveló que los sitios de integración están significativamente enriquecidos en genes.

Las frecuencias relativas de detección de integromas vectoriales se calcularon utilizando solo los recuentos de secuencia de uniones de sitios de integración que generan amplicones de PCR menores de 500 pb. Aproximadamente el 77% de los vectores pudieron analizarse cuantitativamente mediante el enfoque bidireccional. En la estrategia de cuantificación clonal suponemos que cada clon individual comparte el mismo integroma vectorial.

Las frecuencias relativas de las uniones izquierda y derecha se combinan para representar las cantidades relativas de las poblaciones clonales, o QVI. Este esquema de color muestra las frecuencias relativas de 44 clones QVI en células de repoblación de ratones humanizados. Sobre la base de un análisis de integración aleatoria in silico 10.000, se espera una sobreestimación de 1,25 veces de las frecuencias clonales cuando se utilizan enzimas con motivos GTAC, y una sobreestimación de 2,56 cuando se utiliza una enzima con motivos TCGA.

Una vez dominada, esta técnica puede dividirse en partes y completarse en dos días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los pasos de PCR son extremadamente sensibles y se deben tomar precauciones para evitar cualquier contaminación. Esta técnica ha allanado el camino para examinar la seguridad de los vectores retrovirales terapéuticos y para explorar los patrones de repoblación a largo plazo de clones de células madre hemotopoyéticas después del trasplante en macacos rhesus.