Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

El objetivo general del siguiente experimento es identificar las posiciones exactas de los vectores virales integrados en el genoma. Esto se logra mediante una reacción inicial de PCR lineal con cebadores biotinilados para enriquecer las secuencias de unión entre el vector y el genoma a partir de ADN genómico en fase sólida mediante una serie de reacciones; se generan moléculas de ADN de doble cadena con secuencias conocidas en ambos extremos del producto, lo que permite la amplificación exponencial de las uniones entre el vector y el genoma. A continuación, se incorporan adaptadores de secuenciación a los productos de PCR lamb.

Con el fin de secuenciar y caracterizar el ADN flanqueante desconocido mediante secuenciación profunda, estos fragmentos revelan las posiciones exactas de las integraciones del vector. El resultado es una diversidad de uniones amplificadas, visible mediante electroforesis en gel. Este método proporciona información sobre la distribución de los sitios de integración del vector viral en pacientes sometidos a terapia génica clínica.

También puede aplicarse a otros estudios, como inserciones, mutagénesis, cribados, infecciones virales, cáncer y clonalidad de células madre o diversidad de linfocitos T. El procedimiento será demostrado por Ina RA, una técnica de mi laboratorio. Para este procedimiento, primero prepare los casetes de enlazador mezclando 40 microlitros de cada uno de los dos LCO Legos con 110 microlitros de clorhidrato de tris y 10 microlitros de cloruro de magnesio en un tubo de microcentrífuga. A continuación, incube la mezcla en un bloque térmico a 95 grados Celsius durante cinco minutos y luego enfríe lentamente hasta temperatura ambiente durante la noche.

Al día siguiente, añada 300 microlitros de agua al conector de doble cadena preparado, ADN, y filtre sobre un tubo de microcentrífuga. Centrifugue el filtro para recoger el ADN del conector concentrado en el ouit. A continuación, recupere el ouit del filtro.

Añada 80 microlitros de agua al ouit y pipetee alícuotas de 10 microlitros en tubos PCR. Utilice PCR para preamplificar las uniones del genoma del vector en tubos de reacción de 50 microlitros para cordero.

Añada entre un nanogramo y un microgramo de ADN de la muestra por reacción de 50 microlitros. Para el cordero NR, utilice al menos 100 nanogramos de ADN. No añada más de 25 microlitros de ADN. Ejecute la PCR según la tabla dos del texto.

Y cuando finalice, añada 0,5 microlitros adicionales de tech a cada reacción y ejecute el programa de PCR una segunda vez. Primero, prepare las perlas magnéticas. Añada 20 microlitros de perlas magnéticas recubiertas con strept ENC a un tubo de 1,5 mililitros y colóquelas en el separador de perlas magnéticas durante un minuto a temperatura ambiente.

Luego deseche el sobrenadante. Suspenda las perlas en 40 microlitros de PBS con BSA y coloque las perlas de nuevo en el separador durante otro minuto. Reemplace el sobrenadante con una lavada de 20 microlitros de solución de cloruro de litio tres molar.

Y nuevamente, coloque las perlas en el separador durante un minuto. Finalice reemplazando el sobrenadante con 50 microlitros de solución de cloruro de litio seis molar. Ahora agregue la mezcla de perlas magnéticas al producto de la reacción de PCR y deje que esta mezcla incube de dos horas a toda la noche a temperatura ambiente con agitación suave.

El ADN biotinilado y la tira tava y las perlas recubiertas formarán complejos que pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta cuatro días. Continúe con LAMP o NR-LAMP debido a su alta sensibilidad. La LAMP-PCR es propensa a contaminación si se ejecuta sin atención.

Ese es un entorno de grado PCR. Y es de suma importancia prestar especial atención a la limpieza. Para amplificar con éxito el ADN flanqueante desconocido sin contaminar las muestras, primero exponga los complejos al separador durante un minuto y resuspenda las perlas de ADN en 100 microlitros de agua.

A continuación, exponga los complejos al separador durante un minuto. Y esta vez, resuspenda los complejos de perlas de ADN en una mezcla con 8,25 microlitros de agua, un microlitro de tampón de nucleótidos HEXA, un cuarto de microlitro de dDNTPs y medio microlitro de polimerasa cano.

Incube esta mezcla a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, agregue 90 microlitros de agua y exponga la reacción al separador durante otro minuto. A continuación, resuspenda los complejos de perlas de ADN en un lavado de 100 microlitros de agua.

Utilice el separador durante otro minuto y prepare la reacción con la enzima de restricción. Después de eliminar el sobrenadante, agregue 8,5 microlitros de agua, un microlitro de tampón para la enzima de restricción y medio microlitro de la enzima de restricción.

Al seleccionar la enzima de restricción, asegúrese de que no tenga sitios dentro ni aguas abajo del sitio de unión del cebador utilizado en la reacción de preamplificación. Después de permitir que las enzimas reaccionen durante una hora a la temperatura ideal, agregue 90 microlitros de agua. Use un separador durante un minuto y resuspenda los complejos BDNA en un lavado de 100 microlitros de agua.

Repita la separación y prepare la reacción de ligación. Añada a las perlas cinco microlitros de agua, un microlitro de tampón 10 x fast link, un microlitro de TP, un microlitro de ligasa de ADN fast link y un microlitro del casete de enlazador elaborado al comienzo del procedimiento.

Deje que esta reacción transcurra durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalice la reacción añadiendo 90 microlitros de agua y separando las perlas, seguido de un lavado con 100 microlitros de agua. Luego, tras otra separación, para desnaturalizar el ADN sintetizado, reconstituya las perlas en cinco microlitros de hidróxido de sodio 0,1 N y deje que la mezcla agite durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, separe los complejos durante un minuto y recoja el SUP natin, que contiene la unión del genoma del vector previamente amplificado. Proceda inmediatamente con la amplificación exponencial o almacene a menos 20 grados Celsius. Comience exponiendo los complejos al separador durante un minuto.

Y resuspender los perlas de ADN en 100 microlitros de agua. Y separarlos nuevamente y eliminar el sobrenadante. Para la reacción de ligación, añadir 6,5 microlitros de agua, un microlitro de circ Ligase, tampón de reacción 10 x.

Medio microlitro de cloruro de magnesio, medio microlitro de TP, un microlitro de oligos de enlazador SS y medio microlitro de cir ligasa. Después de una hora a 60 grados Celsius, finalice la reacción con 90 microlitros de agua utilizando el separador de perlas, suspendiendo las perlas en otros 100 microlitros de uno, usando el separador nuevamente y recogiendo los complejos de lavado en 10 microlitros de agua. Comience preparando una mezcla maestra de PCR como se describe en la tabla tres del texto.

Añada 48 microlitros de mezcla maestra a dos microlitros de productos de lamb o lamb NR en tubos PCR de 200 microlitros y realice la PCR según se describe en el texto anteriormente, prepare más strept en perlas y resuspenda estas en cloruro de litio seis molar. Utilice 20 microlitros para lamb o 50 microlitros para lamb NR. Luego añada las perlas al mismo volumen de productos de reacción PCR e incube en agitador a 300 RPM durante dos horas hasta toda la noche a temperatura ambiente, recoja el complejo de ADN y perlas y lávelo con 100 microlitros de agua como se ha demostrado previamente.

Ahora, suspenda el complejo en hidróxido de sodio 0,1 normal e incube las perlas durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Luego, exponga las perlas al separador durante un minuto y recoja el sobrenadante que contiene el ADN amplificado en un tubo nuevo. Utilizando el ADN amplificado como molde, use dos microlitros de este para realizar una PCR según se describe en la tabla cuatro del texto.

Visualice los productos mediante electroforesis en gel para purificarlos. Mezcle 40 microlitros de ellos con 44 microlitros de perlas magnéticas AMPure XP a temperatura ambiente e incube durante cinco minutos. Luego, separe las perlas durante dos minutos en el imán.

Después de eliminar el sobrenadante, lave las perlas dos veces utilizando 200 microlitros de etanol al 70%, y luego re suspenda las perlas en 30 microlitros de agua usando 40 nanogramos de cebador de fusión de ADN. Se puede utilizar PCR para añadir adaptadores específicos para secuenciación. Los detalles se proporcionan en la tabla cinco.

Verifique los productos en un gel. La visualización de los resultados de la PCR del gen lamb mediante electroforesis en gel de alta resolución es la mejor opción de análisis diagnóstico en comparación. Aunque el agarosa al 2 % también funciona, no lo hace tan bien.

La clonalidad de NR LAMB, los productos de PCR no pueden diagnosticarse visualmente. Un gel de agarosa al 2 % es, sin embargo, perfectamente suficiente para determinar el éxito del protocolo. Después de secuenciar los productos de PCR, se puede encontrar la ubicación de los vectores en el genoma del huésped.

A partir de estos datos, es posible registrar las ubicaciones de los sitios de inserción en regiones codificantes y cerca de los sitios de inicio de la transcripción tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia génica exploraran la biosseguridad de los vectores de transferencia génica tanto en modelos preclínicos como en ensayos clínicos de terapia génica.