Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

El objetivo general del siguiente experimento es identificar las posiciones exactas de la integración de vectores virales en el genoma. Esto se logra mediante una reacción inicial de PCR lineal con cebadores biotinilados para enriquecer las secuencias de unión del genoma del vector a partir de ADN genómico en fase sólida en una serie de reacciones, se genera ADN bicatenario con secuencias de ADN conocidas en ambos extremos del producto, lo que permite la amplificación exponencial de las uniones del genoma del vector. Los adaptadores de secuenciación siguiente se incorporan a los productos de PCR de cordero.

Con el fin de secuenciar y caracterizar el ADN flanqueante desconocido con secuenciación profunda, estos fragmentos revelan las posiciones exactas de las integraciones vectoriales. El resultado es una diversidad de uniones amplificadas vistas por electroforesis en gel. Este método proporciona información sobre la distribución del sitio de integración de vectores virales en pacientes clínicos de terapia génica.

También se puede aplicar a otros estudios como la inserción, la mutagénesis, los cribados, la infección por virus, el cáncer y la clonalidad de las células madre o la diversidad de células T. El procedimiento será demostrado por ina RA, un técnico de mi laboratorio Para este procedimiento, primero prepare los casetes enlazadores mezcle 40 microlitros de cada uno de los dos Legos LCO con 110 microlitros de clorhidrato de tris y 10 microlitros de cloruro de magnesio en un tubo de micro centrífuga. A continuación, configure la mezcla para incubar en un bloque de calor a 95 grados centígrados durante cinco minutos y luego enfríe lentamente a temperatura ambiente durante la noche.

Al día siguiente, agregue 300 microlitros de agua al enlazador de doble cadena preparado, ADN, y fíltrelos sobre un tubo de microcentrífuga. Gire hacia abajo el filtro para recoger el ADN enlazador concentrado en el ouit. A continuación, recupere el ouit del filtro.

Añadir 80 microlitros de agua a la boquilla y pipetear 10 microlitros en tubos de PCR. Utilice la PCR para preamplificar las uniones del genoma del vector en tubos de reacción de 50 microlitros para corderos.

Agregue entre un nanogramo y un microgramo de muestra de ADN por reacción de 50 microlitros. Para el cordero NR, use al menos 100 nanogramos de ADN. No agregue más de 25 microlitros de ejecutar la PCR de acuerdo con la tabla dos del texto.

Y cuando se complete, agregue 0,5 microlitros adicionales de tecnología a cada reacción y ejecute el programa de PCR por segunda vez. Primero, prepare las cuentas magnéticas. Agregue 20 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de strept ENC a un tubo de 1,5 mililitros y colóquelas en el separador de perlas magnéticas durante un minuto a temperatura ambiente.

A continuación, descarte la subida del sobrenadante. Suspenda las cuentas en 40 microlitros de PBS con BSA y vuelva a colocar las cuentas en el separador durante un minuto más. Reemplace el sobrenadante con un lavado de 20 microlitros de solución de cloruro de litio de tres molares.

Y de nuevo, pon las cuentas en el separador durante un minuto. Termine reemplazando el sobrenadante con 50 microlitros de solución de cloruro de litio de seis molares. Ahora agregue la mezcla de perlas magnéticas al producto de la reacción de PCR y deje que esta mezcla se incube durante dos horas o toda la noche a temperatura ambiente con una agitación suave.

El ADN biotinilado, la tira de tava y las cuentas recubiertas formarán complejos que se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de cuatro días. Proceda con cordero o cordero NR debido a su alta sensibilidad. L-A-M-P-C-R es propenso a la contaminación si se ejecuta con atención.

Ese es un entorno de grado PCR. Y especial atención a la limpieza de suma importancia. Para amplificar con éxito el ADN flanqueante desconocido sin contaminar las muestras, primero exponga los complejos al separador durante un minuto y vuelva a suspender las perlas de ADN en 100 microlitros de agua.

A continuación, exponga los complejos al separador durante un minuto. Y esta vez resuspender los complejos de perlas de ADN en una mezcla con 8,25 microlitros de agua. Un microlitro de tampón de nucleótidos HEXA, un cuarto de microlitro de NTPs de D DN y medio microlitro de cano polimerasa.

Incubar esta mezcla a 37 grados centígrados durante una hora. Luego agregue 90 microlitros de agua y exponga la reacción al separador durante un minuto más. A continuación, vuelva a suspender los complejos de perlas de ADN en un lavado de 100 microlitros de agua.

Utilice el separador durante un minuto más y prepare la reacción de la enzima de restricción. Después de eliminar el sobrenadante. Agregue 8,5 microlitros de agua, un microlitro de tampón de enzima de restricción y medio microlitro de la enzima de restricción.

Al seleccionar la enzima de restricción, asegúrese de que no tenga sitios dentro o aguas abajo del sitio de unión primario utilizado en la reacción de amplificación preem. Después de dejar que las enzimas reaccionen durante una hora a la temperatura ideal, agregue 90 microlitros de agua. Utilice un separador durante un minuto y vuelva a suspender los complejos de BDNA en un lavado de 100 microlitros de agua.

Repita la separación y prepare la reacción de ligadura. Agregue a las perlas cinco microlitros de agua, un microlitro de 10 x tampón de enlace rápido. Un microlitro de un TP, un microlitro de ADN ligasa de enlace rápido y un microlitro del casete del enlazador hecho al comienzo del procedimiento.

Deje que esta reacción se ejecute durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalice la reacción agregando 90 microlitros de agua y separando las perlas, seguido de un lavado en 100 microlitros de agua. Y luego otra separación para desnaturalizar el ADN sintetizado, resuspender las perlas en cinco microlitros de hidróxido de sodio normal 0,1 y dejar que la mezcla se agite durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, separe los complejos durante un minuto y recoja la natina SUP, que contiene la unión del genoma del vector amplificado preem. Proceda inmediatamente con la amplificación exponencial o almacene a menos 20 grados centígrados. Comience exponiendo los complejos al separador durante un minuto.

Y resus suspendiendo las perlas de ADN en 100 microlitros de agua. Y separarlos de nuevo y quitar el sobrenadante. Para la reacción de ligadura, agregue 6,5 microlitros de agua, un microlitro de circ ligasa, 10 x tampón de reacción.

Medio microlitro de cloruro de magnesio, medio microlitro de un TP, un microlitro de oligonucleótidos enlazadores de SS y medio microlitro de cir ligasa. Después de una hora a 60 grados centígrados, finalice la reacción con 90 microlitros de agua utilizando el separador de perlas Resus suspendiendo las perlas en otros 100 microlitros de uno, utilizando de nuevo el separador y recogiendo los complejos de lavado en 10 microlitros de agua. Comience por preparar una mezcla maestra de PCR como se describe en la tabla tres del texto.

Agregue 48 microlitros de mezcla maestra a dos microlitros de cordero o productos de cordero NR en tubos de PCR de 200 microlitros y ejecute la PCR como se describe en el texto como antes, prepare más estrepto en perlas y vuelva a suspenderlas en cloruro de litio de seis molares. Use 20 microlitros para cordero o 50 microlitros para cordero NR. A continuación, añada las perlas al mismo volumen de productos de reacción PCR e incubelas en un agitador a 300 RPM durante dos horas o toda la noche a temperatura ambiente, recoja el complejo de perlas de ADN y lávelo con 100 microlitros de agua como se ha demostrado anteriormente.

Ahora, suspenda el complejo en hidróxido de sodio normal 0,1 e incube las perlas durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador. A continuación, exponga las perlas al separador durante un minuto y recoja el sobrenadante que contiene el ADN amplificado en un nuevo tubo. Utilizando el ADN amplificado como plantilla, utilice dos microlitros del mismo para ejecutar una PCR como se describe en la tabla cuatro del texto.

Visualizar los productos mediante electroforesis en gel para purificar los productos. Mezcle 40 microlitros de ellos con 44 microlitros de perlas magnéticas am pure XP a temperatura ambiente, e incube durante cinco minutos. A continuación, separe las cuentas durante dos minutos en el imán.

Después de quitar el sobrenadante, lave las perlas dos veces con 200 microlitros de etanol al 70% y luego vuelva a suspender las perlas y 30 microlitros de agua con 40 nanogramos de cebador de fusión de ADN. PCR se puede utilizar para agregar adaptadores específicos de secuenciación. En el cuadro cinco se dan detalles.

Revisa los productos en un gel. La visualización de los resultados de la PCR de cordero mediante electroforesis en gel de alta resolución es la mejor opción de análisis diagnóstico en comparación. Si bien 2%aros también funciona, no funciona tan bien.

La clonalidad de los productos NR LAMB, PCR no se puede diagnosticar visualmente. Sin embargo, un gel de 2%agros es perfectamente suficiente para determinar el éxito del protocolo. Después de secuenciar los productos de PCR, la ubicación de los vectores se puede encontrar en el genoma del huésped.

A partir de estos datos, es posible registrar las ubicaciones de los sitios de inserción en las regiones de codificación y cerca de los sitios de inicio de la transcripción después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia génica exploraran la bioseguridad de los vectores de transferencia génica tanto en modelos preclínicos como en ensayos clínicos de terapia génica.