Name: Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a utilizar microarrays de glicanos miniaturizados para evaluar la avidez y especificidad de hemaglutininas del virus influenza A. Este método permite analizar simultáneamente la unión a receptores y la avidez relativa en una sola prueba.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo para el Scripps Microarray Core, y un contrato de los Centros para el Control de Enfermedades (JCP). RPdV es un beneficiario de una subvención VENI Rubicón y de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO). El Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/), financiado por la subvención GM62116 NIGMS (JCP) proporcionó varios glucanos utilizados en este estudio. Esta es la publicación 29113 de The Scripps Research Institute.

NOTA: Todas las etapas se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Matriz de construcción <ol><li> Glicanos Preparación y configuración de la placa <ol><li> Preparar una reserva de memoria intermedia de impresión. En primer lugar hacer 500 ml de una solución madre 150 mM de fosfato de sodio dibásico. También asegúrese de 50 ml de una solución madre 150 mM de solución de fosfato de sodio monobásico. En un matraz, usando una barra de agitación y pH metro magnética, lentamente se valora la solución de fosfato de sodio dibásico con la solución monobásico hasta que se alcanza un pH de 8,5. Añadir Tween-20 a 0,005%. </li><li> Preparar las muestras de glicanos. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) y 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) se deben diluirse a 100μg / ml en tampón de impresión de step1.1.1. glicanos monovalentes,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) y 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) a 100μM en tampón de impresión de la etapa 1.1.1. Por último, preparar los tintes de amina-funcionalizado, para su uso como marcadores de rejilla / luces de aterrizaje. manchas de colorante marcador se imprimen en 1 mM. NOTA: tinte Atto488-NHS se utiliza en nuestras impresiones. Sin embargo, cualquier colorante funcionalizada con amina, legible por el escáner de diapositivas es apropiado para este propósito. </li><li> Transferencia de 10 l de cada muestra de glicano a placas de microtitulación de 384 pocillos, que se utilizan para el robot de impresión. Tiendas glicanos no utilizados en solución tampón de impresión a -20 ° C en tubos sellados. Tansfer 10 l de marcador de colorante a la plancha de impresión. </li></ol></li><li> Impresión NOTA: Todas steps que la preocupación de tocar o mover las diapositivas debe hacerse con guantes. <ol><li> Coloque Arrayer alfileres en la cabeza de impresión de acuerdo con la configuración correcta de la disposición. Por esta disposición usar un pin para imprimir todas las muestras y matrices. Imprimir los glicanos en bloques de seis, saltarse una característica (una característica se define como único punto de un compuesto determinado), a cada lado, de tal manera que los puntos de la misma muestra no se imprimen exactamente al lado de otra. NOTA: El usuario final debe decidir la configuración. </li><li> Retirar los portaobjetos de las bolsas, cajas abiertas, y quitar cualquier partícula de polvo o pequeños trozos de plástico que pueda estar en sus superficies soplando gas nitrógeno de pureza ultra alta en cada diapositiva. Coloque el número deseado de diapositivas, cara recubierta hacia arriba, en la etapa arrayer. </li><li> Programa de la arrayer, utilice los parámetros de 27 puntos por cada visita a la placa de la fuente, usando 3 &quot;pre-spots&quot; en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, para eliminar el exceso de líquido en la punta de los pasadores de impresión <ol><li> Encienda MPU (unidad de alimentación principal) y la Unidad de Control de Clima. Abra el software de análisis de baldosas en el ordenador. </li><li> Selecciona un diseño a la impresión. Seleccione Opciones → herramienta del Pin para ser utilizado para la impresión de la matriz 1 x 1 herramienta de impresión - 1 solo perno. Seleccione la pestaña Destino → Herramienta de arreglo Definición → Modelo de la impresión y añadir el terreno de juego (punto-a-punto de distancia), el número de filas y columnas para dar cabida a las muestras que se desea imprimir, y el patrón de la impresión de las muestras (para esta matriz a 8 x 8 patrón de impresión se utiliza a 340 micras de paso de 7 muestras en total). </li><li> Seleccionar Destino → Diseño de la diapositiva y programar la distancia de bloque a bloque para permitir la impresión de cada matriz de duplicados en la plantilla de diapositivas de 48 pocillos (4 x 12). Seleccionar fuente y añadir el número de pastillas de origen (1 para cada muestra utilizando las patillas 1) (para esta impresión 7 pastillas de origen se utilizará para dar cabida a 6 pocillos de muestra y 1 marcador de tinte también). NOTA: El diálogo fuente cambiará a verde para indicar que el númerode visitas de origen coincide con las muestras que se van impresos en el patrón de impresión. </li><li> Seleccione la Plata Destino → Adaptador y diseño de diapositiva y ajustar el número de diapositiva (5 diapositivas se imprimen a la vez para esta impresión con 1 tobogán de pretratamiento). </li><li> Liberar la bandeja haciendo clic en el botón T1 para activar la bandeja y añadir el número deseado de diapositivas a la bandeja, prestando especial atención a la ubicación de la diapositiva de pretratamiento (AZUL) y se desliza &quot;reales&quot;. </li><li> Colocar los portaobjetos de vidrio de fricción en todos los puertos de vacío restantes para bloquear el vacío y haga clic en OK para activar el vacío. Compruebe que todas las diapositivas se mantienen en su sitio y haga clic en OK para volver la bandeja a la posición inicial. </li><li> Cargar la plancha de impresión en el soporte de la placa y asegurar el bastidor está configurado correctamente en su lugar. Haga clic en OK y permitir que el proceso de impresión continúe. </li></ol></li><li> Imprimir los 24 puntos restantes en repeticiones de 6 puntos por conjunto de matrices (4 / visita fuente). </li><li> Cargar las placas de 384 pocillosen la impresora y empezar a imprimir. Mantener la humedad relativa, durante la impresión, a través de la impresión entre 55 y 65%. La impresora se detiene después de imprimir 5 diapositivas. NOTA: Mientras el microarray en este ensayo se ha impreso un patrón específico de 8 x 8, diferentes tipos de robots de impresión de microarrays necesitará una programación específica equipo para lograr el diseño deseado. Corresponde al usuario final para determinar el patrón más adecuado dada especificaciones de sus equipos. </li></ol></li><li> Humidificación / Inmovilización NOTA: Una vez que las diapositivas han terminado de imprimir, se someten a una etapa de inmovilización temporal, también llamada de humidificación. La humidificación de post-impresión ayuda a homogeneizar la muestra de apego al volver a mojar las manchas y asegurar el bloqueo completo. <ol><li> Ponga los portaobjetos en una cámara de humedad del 100% inmediatamente después de la impresión por un período de 30 min. Construir la cámara mediante la colocación de toallas de papel húmedas muy planas en la parte inferior de un gran plato de vidrio, colocando las diapositivasen algún tipo de bastidor, como por ejemplo un Gradilla de impresión hacia arriba, y sellado con una envoltura de plástico para atrapar la humedad. </li><li> Número desliza con un / pluma de alcohol resistente a los disolventes marcar y guardar en una caja de desecación. Desecar durante la noche. </li></ol></li><li> Numeración, bloqueo y almacenamiento <ol><li> Preparar el tampón de bloqueo - etanolamina 50 mM en 50 mM de tampón de borato. En primer lugar, disolver el ácido bórico, en ddH 2 O, a una concentración final de 50 mM en un matraz que contenía una barra de agitación magnética. Agitar enérgicamente la solución en una placa de agitación hasta que se haya disuelto todo el sólido. Mientras que constantemente se agita, añadir la cantidad apropiada de etanolamina a partir de una solución de 16.54 m stock para alcanzar la concentración deseada 50 mM. Añadir hidróxido de sodio concentrado para ajustar a un pH final de 9,2. </li><li> Sumergir las diapositivas impresas en la solución tampón de bloqueo durante 1 hora. </li><li> Después de 1 hora, enjuague los portaobjetos en ddH2O para eliminar cualquier rastro de exceso de tampón de bloqueo.Desechar el amortiguador de bloqueo en un recipiente apropiado para desechos. </li><li> La transferencia de las diapositivas a los titulares de tinción de vidrio y centrifugar. matrices secas colocándolas en una centrífuga equipada con los titulares de la placa de balanceo, a una velocidad de 10 g durante 5 min. </li><li> Una vez que los portaobjetos están secos, pueden ser incubadas inmediatamente o almacenar. Las condiciones de almacenamiento son -20 ° C en una bolsa de plástico sellada. </li></ol></li></ol> 2. Análisis de proteínas de unión a glicanos <ol><li> Preparar una cámara humidificada en la que las matrices para hibridarse se ajuste. Una cámara sencilla consiste en un plato de Pyrex, en capas en la parte inferior con toallas de papel humedecidas y un bastidor, sobre la que se desliza descansarán. </li><li> Utilice lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) y ECA (Erythrina cristagalli aglutinina) a 10 mg / ml + 2 mg / ml de estreptavidina-555 tinte, en tampón de sondeo (PBS + 0,01% de Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203/04 H5N1 y A / KY / 07 H1N1, en este ejemplo), el usouna concentración de partida de 20 mg / ml pre-complejado, como se describió anteriormente 34. En pocas palabras, hacer una HA: Ratón-α-Strep: mezcla de cabra-α-ratón-Alexa647 en tampón de bloqueo (PBS + BSA al 3% + 0,01% de Tween-20), a una relación molar 4: 1: 2. NOTA: La matriz se sondeó con lectinas de cerciorarse de que los glicanos se inmovilizan y detectable (Figura 1B). </li><li> Transferir la solución de la mezcla proteína-anticuerpo de unión glicano de 20 l a una placa de 384 pocillos y se incuba en hielo durante 30 min. En serie diluir lectina y las muestras de HA 1: 1, en su tampón apropiado, 8 veces, mediante la mezcla de 10 l de muestra con 10 l de tampón. </li><li> Pipeta de 8 l de la muestra en la superficie micro-pocillo e incubar en la cámara de humidificación sellado (100% de HR) durante 90 min. </li><li> Se lavan los portas uno a la vez manteniendo los bordes y les inmersión cuatro veces en una mezcla de PBS y 0,05% de Tween, luego cuatro veces en PBS, y finalmente cuatro veces en H2O desionizada Utilizandoel mismo protocolo de secado descrito en la etapa de bloqueo, girar los arrays se secan en una centrífuga durante 5 minutos a 10 x g. </li></ol> 3. Los análisis de datos de exploración y NOTA: Los microarrays de glicanos pueden ser escaneados en diferentes configuraciones, dependiendo del fabricante del escáner de microarrays. Mediante la variación de la potencia del láser y la resolución, el instrumento puede producir una imagen con tantas señales como sea posible dentro de su rango dinámico (Figura 1C). <ol><li> Utilizar un escáner de diapositivas fluorescente y escanear las matrices inmediatamente después de la incubación con las proteínas de unión de glicanos. Tenga cuidado para asegurar la tapa está correctamente insertada en el instrumento de exploración. <ol><li> software de exploración abierta. Haga clic en Inicio para abrir el programa. Conectar con el escáner: Escáner → Conectar o el botón verde en el menú del panel de navegación del explorador. </li><li> Abrir puerta del cargador automático del escáner. Colocar los portaobjetos en las ranuras de cargador automático con el fin específico. Cierre la puerta del cargador automático. click &quot;leer cargador&quot; en el panel de herramientas de navegación para detectar automáticamente las diapositivas en el escáner. </li><li> Ajuste el parámetro de análisis: parámetros de escaneado del escáner → adecuadas para el experimento (por ejemplo, 635 de energía láser de alta, aumento de la detección del 50%). diapositivas de la exploración: explorador → escaneo. Seleccionar ruta mediante la creación de una carpeta para guardar las imágenes de la exploración y exploraciones individuales de nombres. Para ello, antes de la real de la exploración. Repita este procedimiento para cada diapositiva individual. Haga clic en OK para iniciar la exploración. </li></ol></li><li> Utilice el software del escáner para configurar el instrumento y escanear las diapositivas. Conjunto escáner para escanear de forma iterativa en láser de baja potencia (5 mW) con el aumento de los ajustes de ganancia de 25%, 50% y 75%. NOTA: Los ajustes pueden ser probados y optimizados, pero tenga en cuenta que cada exploración, posiblemente, puede reducir la salida de la fluorescencia de los colorantes debido a photobleaching. <ol><li> adquisición de datos abierta y software de análisis como el software MAPIX. Haga clic en Inicio para abrir el programa. Abrir exploración de imagen: Archivo → im abiertoaños. Abrir archivo GAL: Analizar → rejilla abierta y seleccione el archivo GAL apropiado. </li><li> Entre en el modo bloques: el modo de imagen → bloques para mover la cuadrícula. Utilice los marcadores de la red para configurar la red a la ubicación adecuada en la diapositiva. Ajuste bloques individuales como sea necesario para que coincida con la matriz impresa. </li><li> Ingrese al modo de manchas: Imagen → Modo de puntos para ajustar la ubicación y el tamaño de las manchas individuales dentro del bloque. Una vez que todos los bloques y los puntos se ajustan y en su lugar, la intensidad de señal medida por Analizar → cálculos fotométricos. Guarde el archivo de salida. </li></ol></li><li> Una vez que las diapositivas han terminado de escanear, las imágenes se analizaron para las señales de unión con el programa de procesamiento de imágenes instalado (Figura 1 D - G). Para el análisis de imágenes, cargar un archivo GAL (Lista Array) la imagen escaneada TIFF terminado. NOTA: El archivo GAL contiene tanto el patrón de disposición in situ y las identidades de cada lugar in situ. archivos GAL para las matrices son created por el software de la impresora utilizando un archivo de texto delimitado por tabuladores que contiene la identidad de las muestras y su ubicación en la placa de fuente de 384 pocillos. </li><li> Utilice la rejilla de luces de posición / desembarque impresas en los microarrays para colocar correctamente la red GAL. manchas individuales pueden necesitar ser movido de forma individual, sino un conjunto bien impreso generalmente permitirá bloques dentro de la red para ser colocados con facilidad. Tras la colocación de la rejilla, recoger las intensidades de terreno por el software y guardado como un archivo de texto delimitado por tabulaciones (.txt). <ol><li> Utilizando el programa de hoja de cálculo, abra el archivo de salida del escáner. Abra el archivo de macro adecuada de la ubicación de la carpeta. Haga clic en Ver → → Macro EjecutarMacro. NOTA: El pre-escrito copiará los datos de salida primas, eliminar filas y columnas innecesarias, ordenar los datos por ejemplo, el cálculo de los valores de fondo de la señal menos una media promedio y trazar los valores resultantes de a una hoja de hoja de cálculo que contiene los gráficos para cada de los seis sampLes probado en la matriz. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La evaluación de la especificidad del receptor IAV es un paso importante en el análisis de potencial pandémico del virus aviares. El ácido siálico reconocimiento por el virus está vinculada a varias propiedades biológicas tales como la unión a y la liberación de la célula. El conocimiento de que las mutaciones de aminoácidos son necesarios para los virus aviares para lograr la unión α2-6 y cruzan la barrera de las especies permite preparación para una pandemia. Varios ensayos se utilizan para determinar la especificidad...

Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV es capaz de cruzar la barrera de las especies de aves y mamíferos, incluidos los humanos. Virus de este tipo de aves reconocen α2-3 ácidos siálico unido (receptores de tipo aviar), mientras que los virus humanos se unen α2-6 ácidos siálico unido (receptores de tipo humano). Para ser capaz de replicarse y transmitir entre los seres humanos una IAV aviar necesita para unirse a los receptores de tipo humano 1 de manera eficiente. Virus de este tipo se dividen basado en serología que caracteriza a la antigenicidad de su hemaglutinina (HA) y glicoproteínas de la envoltura de la neuraminidasa (NA). HA se une a los ácidos siálicos, mientras que NA es la enzima destructora del receptor en el otro extremo del ciclo de vida viral, y se unirá de ácido siálico 2. Todos los virus que infectan a humanos, incluyendo H1N1, H2N2 y H3N2, tienen un origen aviar 3. Durante las dos últimas décadas de varias aves a humanos cruces se han producido, con el H5N1, H7N7, H7N9 y siendo el más conocido; Howeembargo, otros subtipos de haber infectado a los humanos de forma más esporádica (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Afortunadamente, parece que ninguno de estos virus han sido capaces de adaptarse plenamente a los receptores de ácido siálico ligado α2-6 de tipo humano 5-8. La adaptación de los virus zoonóticos aviar u otros para dar cabida a la replicación y la transmisión en huéspedes humanos podría tener un efecto devastador sobre la salud humana. Por lo tanto, el conocimiento previo de cómo estos virus están evolucionando para unirse a receptores de tipo humano ayudará a la vigilancia de todo el mundo de los virus de influenza emergentes. Determinación de preferencia receptor fue aclarada primero usando eritrocitos de diferentes especies y sigue siendo un ensayo favorecida entre los investigadores de la gripe 9-12. La demostración de que los virus aviares reconocen ácido siálico α2-3 y α2-6 virus humanos vinculados ácido siálico se basó originalmente en un ensayo usando la hemaglutinación de eritrocitos enzimáticamente por ingeniería genética para contener cada uno de los linkages 13,14. Aunque la lectura es de hemaglutinación, un ensayo estándar para los virólogos, las estructuras de glicano subyacentes no están definidos, sólo el enlace terminal. Además, la disponibilidad limitada de las sialiltransferasas, que se utiliza para volver a sialylate las células, han limitado el uso de este ensayo 15-18. Posteriormente, se introdujeron otros métodos de determinación de las preferencias de unión al receptor usando las estructuras de glicano sialiladas vinculados a las estructuras de poli-glutamato (PGA) de poli-acrilamida (PAA) o en ensayos basados ​​en la placa de 19,20. Varias variaciones son posibles en el revestimiento de cualquiera de los glicanos o virus a placas de microtitulación, cada uno de lo que resulta en un ensayo de tipo ELISA robusto, fiable y muy sensibles 21-23. Alternativamente, los glicanos de biotina ligada puede sustituir a PAA / PGA y se pueden conjugar a las placas recubiertas con estreptavidina 2,24. Aunque se puede requerir algunos sueros específica, las pruebas ELISA son glicanos estándar y varios enlaces a PAA son fácilmente commerciallY como no disponibles comercialmente (Consorcio para Funcional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)). Las tecnologías de microarrays de glicanos se han convertido en una herramienta muy valiosa para determinar la especificidad del receptor, como múltiples glicanos diferentes se han manchado, y la unión a una amplia gama de diferentes estructuras pueden ser evaluados dentro de un único ensayo de 25-29. La unión de IAV a estas estructuras proporciona una mejor comprensión de las estructuras de glicano que IAV reconoce preferentemente 30-33. microarrays de glicanos requieren pequeñas cantidades de volumen de muestra para realizar un ensayo de unión y sólo utiliza cantidades muy pequeñas de glicano por punto (2 nl). Sin embargo, estas matrices se utilizan normalmente sólo para evaluar la especificidad de los receptores de glicanos. Análisis de múltiples virus, o proteínas de hemaglutinina, en múltiples intervalos de concentración puede ser prohibitivo debido al número de diapositivas requeridos. Por otra parte, hasta la fecha, ningún ensayo de avidez relativa ha sido desarrollado utilizando ar glicanotécnicas de rayos. Para combinar el requisito bajo la muestra proporcionada por las técnicas de microarrays de glicanos y la sensibilidad de los glicanos PAA-ligado en ensayos basados ​​en ELISA, hemos tratado de desarrollar una matriz de glicanos de múltiples pocillos que permitiría análisis de alto rendimiento con una resolución similar o mejor en comparación para el ensayo basado en ELISA tradicional. Al mismo tiempo, hemos querido minimizar la cantidad de productos biológicos y químicos consumidos reportero. El resultado final es un ensayo de avidez miniaturizado, desarrollado específicamente para el seguimiento de IAV especificidad y es igualmente aplicable a evaluar otras proteínas de unión de glicano. El uso de un portaobjetos de vidrio separados en 48 micro pozos por una máscara de teflón, 6 glicanos diferentes se han manchado en 6 repeticiones por pocillo. La plataforma de microarrays ofrecen las mismas tendencias en la unión al receptor vistos en el formato ELISA macro con varias ventajas. Estos incluyen (I) de impresión de compuesto en 6 repeticiones, utilizando mínima de la muestra, en comparación con el recubrimiento de varias filas ina placa, usando 100 l por pocillo; (II) múltiples compuestos diferentes analizaron simultáneamente en un único pozo, incluyendo los controles; (III) una disminución masiva en volumen de incubación y; (IV) un rango dinámico más grande, utilizando una lectura fluorescente. Una sola diapositiva se puede calcular que es equivalente a 18x placas de 96 pocillos. Con el siguiente protocolo, cualquier laboratorio capaz de fabricar y analizar manchado microarrays deben ser capaces de fabricar este formato ELISA miniaturizado.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg; Diapositiva H MPX-48&nbsp;</td><td>Portaobjetos Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>descatalogado</td><td>escáner de microarrays confocal</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td><td>Innopsys-escáner</td> <td>de</td> <td>microarrays confocal</td></tr><tr><td>MicroGrid II&nbsp;</td><td>Impresora Digilab-microaray</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>Lectina vegetal</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>Lectina vegetal</td></tr><tr><td>Anticuerpo antiestreptococo</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>Anitbody para unión de alta disponibilidad</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody para unión</td></tr><tr><td>de HA Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>di-básico Fosfato de Sodio</td><td>Sigma 255793</td><td></td><td>componente de tampón</td></tr><tr><td>de impresión mono-básico Fosfato de Sodio</td><td>Sigma 229903</td><td>&nbsp;</td><td>Componente de búfer de impresión</td></tr><tr><td>solución de poli-l-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp;</td><td>Componente de deslizamiento de pre-detección</td></tr><tr><td>hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>componente de portaobjetos de pre-desmanchado</td></tr><tr>de<td>etanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>componente de portaobjetos de pre-desmanchado</td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>tampón de incubación/lavado</td></tr><tr><td>pines SMP4B Clavija</td> de <td>impresión</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td></tr><tr><td>Nitrógeno comprimido (Grado 5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>herramienta general para desempolvar/secar</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Reactivo de bloqueo de portaobjetos</td></tr><tr><td>etanolamina</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Reactivo de bloqueo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91 Marcador de</td><td>cuadrícula en matriz</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Consorcio de Glicómica Funcional</td><td>PA368</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>Consorcio para Glicómica funcional</td><td>PA362</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consorcio de glicómicos funcionales</td><td>PA343</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>Consorcio de glicómicos funcionales</td><td>Te98</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consorcio de glicómicos funcionales</td><td>Te175</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consorcio de glicómicos funcionales</td><td>Te176</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 384 pocillos</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Plancha de impresión</td></tr><tr><td>Marcador de laboratorio VWR</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Numeración de portaobjetos</td></tr><tr><td>Plato de tinción de portaobjetos</td><td>Wheaton Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Bloqueo y secado</td></tr></tbody></table>

un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe a hemaglutininas

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Virus de Influenza A (IAV) hemaglutininas reconocen ácidos siálico en la superficie celular como receptores funcionales para poder entrar en las células. Las aves acuáticas salvajes son el reservorio natural de IAV, pero IAV puede cruzar la barrera de las especies de aves de corral, cerdos, caballos y seres humanos. Los virus aviares reconocen ácido siálico unido a una penúltima galactosa mediante un enlace α2-3 (receptores de tipo aviar) mientras que los virus humanos reconocen preferentemente ácido siálico con una articulación (α2-6 receptores de tipo humano). Para controlar si los virus aviares se están adaptando a los receptores de tipo humano, varios métodos se pueden utilizar. microarrays de glicanos con diversas bibliotecas de sialosides sintéticos se utilizan cada vez más para evaluar la especificidad del receptor. Sin embargo, esta técnica no se utiliza para medir avideces. Medición de la avidez se consigue típicamente mediante la evaluación de la unión de la hemaglutinina o virus diluido en serie a glicanos adsorbidos en placas de 96 pocillos de polipropileno convencionales. En este ensayo, los glicanos con α2-3 o α2-6 ácidos siálicos están acoplados a biotina y adsorben a placas de estreptavidina, o se acoplan a poliacrilamida (PAA) que adsorben directamente al plástico. Hemos miniaturizado significativamente este ensayo imprimiendo directamente sialosides PAA-ligado y sus contrapartes no-PAA ligado en portaobjetos de vidrio micro pocillos. Esta puesta a punto, con 48 matrices en una sola diapositiva, permite ensayos simultáneos de 6 glicano proteínas de unión a los 8 diluciones, interrogando 6 glicanos diferentes, incluyendo dos controles no sialilados. Esto es equivalente a 18x placas de 96 pocillos en el ensayo de placa tradicional. El formato de matriz de glicanos disminuye el consumo de compuestos y productos biológicos y de este modo se mejora notablemente la eficiencia.

Impresión, escaneo y análisis de datos Para garantizar una impresión correcta, que es vital tener la correcta alineación de la rejilla manchado dentro de la máscara de teflón, que delimita cada matriz en la diapositiva. Durante la impresión, debido a la naturaleza del recubrimiento de teflón, puntos no pueden ser vistos por el ojo desnudo en las diapositivas MPX. Se presta atención a continuación a la aparición de los pre-manc...

Utilizando una estrategia de microarrays de glicanos impresos, se miniaturizó un ensayo convencional de placa de 96 pocillos para analizar la avidez de hemaglutinina del virus de la influenza A y la especificidad de los receptores que contienen ácido siálico.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

El objetivo general de esta matriz de glicanos miniaturizada es analizar la especificidad y la avidez de las hemaglutininas del virus de la influenza A. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la unión de receptores y la avidez del virus de la influenza A. La principal ventaja de esta técnica es que, en un solo ensayo, podemos evaluar tanto la especificidad como la avidez relativa de unión, algo que normalmente no se logra en ensayos convencionales basados en matrices de glicanos o en placas.Este protocolo comienza con los preparativos de las muestras de glicanos. La solución base para los glicanos es un tampón de impresión stock que, una vez preparado, debe titularse lentamente hasta un pH de 8,5 y luego agregársele un surfactante. Utilizando el tampón de impresión preparado, diluya los glicanos conjugados con PAA hasta 100 microgramos por mililitro.Luego, diluya los glicanos monovalentes a 100 micromolares también en tampón de impresión. Finalmente, prepare alícuotas de trabajo de los colorantes funcionalizados con amina a un micromolar. Ahora, cargue diez microlitros de cada muestra de glicano en un pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos.Esta cantidad de solución es suficiente para imprimir cinco portaobjetos. También transfiera diez microlitros del marcador de colorante a un pocillo de la placa de impresión. Prepárese para imprimir los arreglos posicionando primero las puntas del arrayer y la cabeza de impresión de acuerdo con la distribución.En este caso, un pin puede imprimir todas las muestras. Las matrices de glicanos se imprimen en bloques de seis rodeados por un espacio vacío en todos los lados. Póngase guantes para manipular los portaobjetos.Desempaquételos y sople cualquier residuo de sus superficies con gas de nitrógeno de ultra alta pureza. A continuación, coloque los portaobjetos con la cara recubierta hacia arriba en la plataforma del dispensador. Luego, programe el dispensador.En este caso, el programa realiza 27 depósitos por visita a la placa de origen. Tres depósitos previos colocados en el área no destinada a la matriz sobre un portaobjetos recubierto con poli-L-lisina se utilizan para eliminar el exceso de líquido en la punta del pin. Los otros 24 depósitos por visita del pin se emplean para colocar seis depósitos en cuatro matrices replicadas.Los detalles se proporcionan en el protocolo escrito. Ahora, cargue las placas de múltiples pocillos en la impresora e inicie la impresión de los arreglos. Durante la impresión, asegúrese de que la humedad se mantenga entre 55 y 65 %. Preste atención al aspecto de los puntos previos en los portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.Después de la impresión, inspeccione visualmente cada portaobjetos. Verifique la alineación correcta de los puntos dentro de los bordes de teflón, lo cual es fundamental, y compruebe el número correcto de características impresas. Para ayudar a homogeneizar la fijación de los puntos, coloque los portaobjetos impresos inmediatamente después de su elaboración en una cámara de humedad al 100 %, con la cara impresa hacia arriba.Utilice toallas de papel húmedas para forrar un recipiente y un estante improvisado. Envuelva la cámara con plástico para retener la humedad. Después de media hora, retire los portaobjetos.Luego, numere los portaobjetos con un marcador resistente a disolventes y guárdelos en una caja de desecación durante la noche. Al día siguiente, prepare un stock fresco de tampón de bloqueo con agitación vigorosa. Ajuste el pH a 9,2 utilizando hidróxido de sodio concentrado.Luego, incubar las laminillas en el tampón durante una hora. Para eliminar el bloqueo, enjuagar las laminillas con agua doblemente destilada. A continuación, transferir las laminillas a portaobjetos de vidrio para tinción y colocar los portaobjetos en un soporte giratorio para centrifugar las laminillas y secarlas a 10 G durante cinco minutos.Una vez secos, si es necesario, guarde los portaobjetos a menos 20 grados Celsius en bolsas de plástico selladas. Como preparación, prepare otra cámara de humectación como antes. Para detectar los glicanos inmovilizados, prepare lectinas biotiniladas de SNA y ECA a 10 microgramos por mililitro en tampón de detección, y agregue dos microgramos por mililitro de estreptavidina 555 a cada dilución.Para teñir con las hemaglutininas, prepare una solución de 20 microgramos por mililitro de anticuerpo previamente complejado en tampón bloqueador en una proporción molar de cuatro a dos a uno, como se describe en el protocolo del texto. Transfiera 20 microlitros de las soluciones preparadas a los pocillos de una placa de 384 pocillos. A continuación, diluya seriadamente las lectinas y hemaglutininas uno a uno en sus tampones respectivos.Realice ocho diluciones, llenando cada pocillo con 10 microlitros de muestra y 10 microlitros de tampón. A continuación, incube la placa sobre hielo durante 30 minutos. Ahora agregue ocho microlitros de cada dilución a uno de los 48 micropocillos de una lámina impresa.A continuación, incubar la preparación en la cámara de humectación durante 90 minutos. Después de 90 minutos, lavar la preparación sujetándola por el borde; sumergirla en PBS-T cuatro veces, luego sumergirla en PBS cuatro veces y finalmente, sumergirla en agua desionizada cuatro veces. Ahora, secar la preparación mediante centrifugación como antes.Después de secar por centrifugado, escanee inmediatamente la laminilla. Asegúrese de cargar cuidadosamente la laminilla en el escáner en la orientación correcta. Escanee iterativamente las laminillas utilizando una potencia baja del láser de cinco milivatios, aumentando gradualmente la ganancia del 25 al 75 %. Al optimizar los parámetros de escaneo, tenga en cuenta que los fluoróforos se desvanecerán con escaneos repetidos.Analice la imagen guardada para detectar señales de unión utilizando el software asociado. Puede cargarse una lista de matriz que contenga el patrón de impresión. Superponga esta lista sobre el escaneo para ayudar a navegar la colocación de los marcadores de cuadrícula.Luego, utilice el software para analizar las intensidades de los puntos y guarde los resultados como un archivo de texto delimitado por tabulaciones para exportarlo a una hoja de cálculo o a otro paquete estadístico. Analice los datos calculando la intensidad media de la señal menos el fondo. Tome el promedio de cuatro de los seis puntos replicados para cada muestra, excluyendo la señal más alta y la señal más baja.Luego, elabore un gráfico de líneas de la señal media promedio menos el fondo frente a las ocho concentraciones de proteína. Suavice la línea resultante utilizando regresión no lineal. La matriz de PAA se utilizó para evaluar la especificidad de unión al receptor de las hemaglutininas del virus de la influenza A.El arreglo incluyó controles no sialilados en los mismos micropozos. Se utilizaron lectinas vegetales con especificidades conocidas para los compuestos impresos como controles positivos. La lectina ECA se unió a la galactosa terminal beta 1-4 unida a N-acetilglucosamina y no se unió al mismo compuesto si la galactosa terminal estaba cubierta con ácido siálico.Para probar el ácido siálico unido mediante enlace alfa 2-6, se utilizó la lectina SNA. Como se esperaba, SNA solo se unió a los ácidos siálicos unidos mediante enlace alfa 2-6, pero con diferencias notables en afinidad para repeticiones de lacNAc marcadas con colorante unidas a PAA frente a las no unidas a PAA. A continuación, se analizó una hemaglutinina H5 derivada de un virus Vietnam/1203/04 que solo reconoce ácidos siálicos unidos mediante enlace alfa 2-3.El perfil de unión de la hemaglutinina H5 mostró la especificidad esperada con una mayor afinidad por las estructuras ligadas a PAA. Finalmente, se analizó la hemaglutinina H1 de una cepa seasonal humana H1N1. Como era de esperar, esta hemaglutinina solo se unió a estructuras que contienen ácido siálico ligado alfa 2-6.Una vez dominada, esta técnica puede revelar las especificidades de unión y las avidades relativas de los virus de la influenza dentro de un solo ensayo. Esta técnica mejorará considerablemente la eficiencia de los ensayos de unión de la influenza, además de reducir el consumo de biológicos valiosos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método sencillo slot blot fue desarrollado para la cuantificación de la hemaglutinina y la neuraminidasa viral de la gripe utilizando anticuerpos universales dirigidas a sus secuencias más conservadas identificados a través de análisis de la bioinformática. Este enfoque innovador puede ofrecer una alternativa útil para la determinación cuantitativa de todos los hemaglutinina y la neuraminidasa viral.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

En este video, demostramos el proceso para detectar isotipos de anticuerpos en múltiples muestras de suero humano utilizando un portaobjetos de microarray impreso con subtipos antigénicos de cepas del virus de la influenza.

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Un ensayo para medir los títulos de anticuerpos de inhibición de la neuraminidasa de la influenza

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Este estudio describe una   -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

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Los protocolos presentados describen cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe de las muestras de suero de los receptores de la vacuna de influenza. El primer ensayo determina las concentraciones óptimas de antígeno viral por hemaglutinación. El segundo ensayo cuantifica los títulos de anticuerpos específicos de la gripe por inhibición de la hemaglutinación.

Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Presentamos un protocolo para el uso de un microarray proteico construido mediante la impresión de antígenos de la gripe en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa para sondear simultáneamente el suero de múltiples anótipos de anticuerpos contra más de 250 antígenos de diferentes cepas de virus, por lo tanto permitiendo la medición de la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus.

Uso de un microarreglo antigonagen antigripal para medir la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus

Aprende a utilizar microarrays de glicanos miniaturizados para evaluar la avidez y especificidad de hemaglutininas del virus influenza A. Este método permite analizar simultáneamente la unión a receptores y la avidez relativa en una sola prueba.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

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