Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

El objetivo general de esta matriz de glicanos miniaturizados es analizar la especificidad y la avidez de las hemaglutininas del virus de la gripe A. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la unión y la avidez del receptor del virus de la influenza A. La principal ventaja de esta técnica es que dentro de un solo ensayo podemos abordar la especificidad, así como la avidez de unión relativa, que normalmente no se logra dentro de los ensayos típicos de matrices de glicanos y basados en placas.

Este protocolo comienza con la preparación de las muestras de glicanos. La solución base para los glicanos es un tampón de impresión en stock que, una vez fabricado, debe ajustarse lentamente a un pH de 8,5 y luego se le debe agregar surfactante. Con el tampón de impresión preparado, diluya los glicanos conjugados con PAA a 100 microgramos por mililitro.

A continuación, diluya los glicanos monovalentes a 100 micromolares también en el tampón de impresión. Por último, haga existencias de trabajo de los tintes funcionalizados con aminas en un micromolar. Ahora cargue diez microlitros de cada muestra de glicano en un pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos.

Esta es una solución suficiente para imprimir cinco diapositivas. Transfiera también diez microlitros del marcador de tinte a un pocillo de la placa de impresión. Prepárese para imprimir las matrices colocando primero los pines de la matriz y el cabezal de impresión de acuerdo con el diseño.

En este caso, un pin puede imprimir todas las muestras. Las matrices de glicanos se imprimen en bloques de seis rodeados por un punto vacío en todos los lados. Ponte guantes para manejar los toboganes.

Desempaquételos y sople cualquier residuo de sus superficies con gas nitrógeno de ultra alta pureza. A continuación, coloque las diapositivas con el lado recubierto hacia arriba en la platina del arrayer. A continuación, programe el arrayer.

En este caso, programe 27 puntos por visita a la placa de origen. Se utilizan tres puntos previos colocados en el área no establecida de un portaobjetos recubierto de poli-L-lisina para eliminar el exceso de líquido en la punta del pasador. Los otros 24 puntos por visita de pin se utilizan para colocar seis puntos en cuatro matrices de réplicas.

Los detalles se proporcionan en el protocolo de texto. Ahora, cargue las placas de pocillos múltiples en la impresora y comience a imprimir las matrices. Durante la impresión, asegúrese de que la humedad se mantenga entre el 55 y el 65%Preste atención a la apariencia de las manchas previas en los portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina.

Después de imprimir, inspeccione visualmente cada diapositiva. Verifique la alineación correcta de las manchas dentro de los bordes de teflón, lo cual es vital, y verifique el número correcto de características manchadas. Para ayudar a homogeneizar la fijación de los puntos, coloque las diapositivas impresas en una cámara de humedad del 100% con el lado impreso hacia arriba inmediatamente después de hacerlas.

Use toallas de papel húmedas para forrar un recipiente y una rejilla improvisada. Envuelva la cámara en plástico para atrapar la humedad. Después de media hora, retire las diapositivas.

Luego, numere los portaobjetos con un marcador resistente a los solventes y guárdelos en una caja de desecación durante la noche. Al día siguiente, prepare una nueva reserva de tampón de bloqueo con agitación vigorosa. Ajuste el pH de 9.2 usando hidróxido de sodio concentrado.

A continuación, incuba los portaobjetos en el tampón durante una hora. Para quitar el bloque, enjuague los portaobjetos con agua destilada doble. Luego, transfiera los portaobjetos a los soportes para tintes de vidrio y cargue los soportes en un soporte de placa oscilante para secar los portaobjetos a 10 G durante cinco minutos.

Una vez secos, si es necesario, guarde los portaobjetos a menos 20 grados centígrados en bolsas de plástico selladas. En preparación, haga otra cámara de humidificación como antes. Para detectar los glicanos inmovilizados, prepare lectinas biotiniladas SNA y ECA a 10 microgramos por mililitro en tampón de sondeo y agregue dos microgramos por mililitro de estreptavidina 555 a cada dilución.

Para teñir con las hemaglutininas, haga una solución de 20 microgramos por mililitro de anticuerpo precomplejo en tampón de bloqueo en una proporción molar de cuatro a dos a uno como se describe en el protocolo de texto. Transfiera 20 microlitros de las soluciones preparadas a los pocillos de una placa de 384 pocillos. A continuación, diluya en serie las lectinas y hemaglutininas una a una en sus tampones adecuados.

Hacer ocho diluciones, llenando cada pocillo con 10 microlitros de muestra y 10 microlitros de tampón. Ahora, incuba la placa en hielo durante 30 minutos. Ahora agregue ocho microlitros de cada dilución a uno de los 48 micropocillos en un portaobjetos impreso.

A continuación, incube el portaobjetos preparado en la cámara de humidificación durante 90 minutos. Después de 90 minutos, lave el portaobjetos mientras lo sostiene desde el borde; sumérjalo en PBS-T cuatro veces, luego sumérjalo en PBS cuatro veces y, finalmente, sumérjalo en agua desionizada cuatro veces. Ahora, seca la corredera como antes.

Después de centrifugar, escanee inmediatamente el portaobjetos. Asegúrese de cargar cuidadosamente la diapositiva en el escáner en la orientación correcta. Usando una baja potencia láser de cinco milivatios, escanee iterativamente los portaobjetos, aumentando gradualmente la ganancia del 25 al 75%Mientras optimiza la configuración de escaneo, tenga en cuenta que los fluoróforos se blanquearán con escaneos repetidos.

Analice la imagen guardada en busca de señales de enlace utilizando el software asociado. Se puede cargar una lista de matrices que tenga el patrón de detección. Superpóngalo en el escaneo para ayudar a navegar por la ubicación de los marcadores de cuadrícula.

A continuación, utilice el software para analizar las intensidades puntuales y guarde los resultados como un archivo de texto delimitado por tabuladores para exportarlo a una hoja de cálculo u otro paquete estadístico. Analice los datos calculando la intensidad media de la señal menos el fondo. Tome un promedio de cuatro de los seis puntos replicados para cada muestra, dejando fuera la señal más alta y la señal más baja.

A continuación, elabore un gráfico lineal de la señal media media menos el fondo frente a las ocho concentraciones de proteínas. Suaviza la línea resultante mediante una regresión no lineal. La matriz PAA se utilizó para evaluar la especificidad de unión al receptor de las hemaglutininas del virus de la influenza A.

El conjunto incluía controles no sialilados en los mismos micropozos. Se utilizaron lectinas vegetales con especificidades conocidas para los compuestos impresos como controles positivos. La lectina ECA se unió a la galactosa terminal beta 1-4 se unió a la anacetilglucosamina y no se unió al mismo compuesto si la galactosa terminal se cubrió con ácido siálico.

Para probar el ácido siálico ligado alfa 2-6, se utilizó la lectina SNA. Como se esperaba, el SNA solo se unió a los ácidos siálicos alfa 2-6, pero con diferencias notables en la afinidad por las repeticiones de lacNAc ligadas a PAA frente a las no ligadas a PAA. A continuación, se probó una hemaglutinina H5 derivada de un virus Vietnam/1203/04 que solo reconoce los ácidos siálicos alfa 2-3 unidos.

El perfil de unión de la hemaglutinina H5 mostró la especificidad esperada con una mayor avidez para las estructuras ligadas a PAA. Por último, se analizó la hemaglutinina H1 de una cepa estacional humana de H1N1. Como era de esperar, esta hemaglutinina solo se unió a estructuras que contienen ácido siálico unido a alfa 2-6.

Una vez dominada, esta técnica puede revelar las especificidades de unión y las avidez relativa de los virus de la influenza dentro de un solo ensayo. Esta técnica mejorará en gran medida la eficiencia de los ensayos de unión a la influenza y reducirá el consumo de productos biológicos valiosos.