Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

El objetivo general de esta matriz de glicanos miniaturizada es analizar la especificidad y la avidez de las hemaglutininas del virus de la influenza A. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave sobre la unión de receptores y la avidez del virus de la influenza A. La principal ventaja de esta técnica es que, en un solo ensayo, podemos evaluar tanto la especificidad como la avidez relativa de unión, algo que normalmente no se logra en ensayos convencionales basados en matrices de glicanos o en placas.

Este protocolo comienza con los preparativos de las muestras de glicanos. La solución base para los glicanos es un tampón de impresión stock que, una vez preparado, debe titularse lentamente hasta un pH de 8,5 y luego agregársele un surfactante. Utilizando el tampón de impresión preparado, diluya los glicanos conjugados con PAA hasta 100 microgramos por mililitro.

Luego, diluya los glicanos monovalentes a 100 micromolares también en tampón de impresión. Finalmente, prepare alícuotas de trabajo de los colorantes funcionalizados con amina a un micromolar. Ahora, cargue diez microlitros de cada muestra de glicano en un pocillo de una placa microtituladora de 384 pocillos.

Esta cantidad de solución es suficiente para imprimir cinco portaobjetos. También transfiera diez microlitros del marcador de colorante a un pocillo de la placa de impresión. Prepárese para imprimir los arreglos posicionando primero las puntas del arrayer y la cabeza de impresión de acuerdo con la distribución.

En este caso, un pin puede imprimir todas las muestras. Las matrices de glicanos se imprimen en bloques de seis rodeados por un espacio vacío en todos los lados. Póngase guantes para manipular los portaobjetos.

Desempaquételos y sople cualquier residuo de sus superficies con gas de nitrógeno de ultra alta pureza. A continuación, coloque los portaobjetos con la cara recubierta hacia arriba en la plataforma del dispensador. Luego, programe el dispensador.

En este caso, el programa realiza 27 depósitos por visita a la placa de origen. Tres depósitos previos colocados en el área no destinada a la matriz sobre un portaobjetos recubierto con poli-L-lisina se utilizan para eliminar el exceso de líquido en la punta del pin. Los otros 24 depósitos por visita del pin se emplean para colocar seis depósitos en cuatro matrices replicadas.

Los detalles se proporcionan en el protocolo escrito. Ahora, cargue las placas de múltiples pocillos en la impresora e inicie la impresión de los arreglos. Durante la impresión, asegúrese de que la humedad se mantenga entre 55 y 65 %. Preste atención al aspecto de los puntos previos en los portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.

Después de la impresión, inspeccione visualmente cada portaobjetos. Verifique la alineación correcta de los puntos dentro de los bordes de teflón, lo cual es fundamental, y compruebe el número correcto de características impresas. Para ayudar a homogeneizar la fijación de los puntos, coloque los portaobjetos impresos inmediatamente después de su elaboración en una cámara de humedad al 100 %, con la cara impresa hacia arriba.

Utilice toallas de papel húmedas para forrar un recipiente y un estante improvisado. Envuelva la cámara con plástico para retener la humedad. Después de media hora, retire los portaobjetos.

Luego, numere los portaobjetos con un marcador resistente a disolventes y guárdelos en una caja de desecación durante la noche. Al día siguiente, prepare un stock fresco de tampón de bloqueo con agitación vigorosa. Ajuste el pH a 9,2 utilizando hidróxido de sodio concentrado.

Luego, incubar las laminillas en el tampón durante una hora. Para eliminar el bloqueo, enjuagar las laminillas con agua doblemente destilada. A continuación, transferir las laminillas a portaobjetos de vidrio para tinción y colocar los portaobjetos en un soporte giratorio para centrifugar las laminillas y secarlas a 10 G durante cinco minutos.

Una vez secos, si es necesario, guarde los portaobjetos a menos 20 grados Celsius en bolsas de plástico selladas. Como preparación, prepare otra cámara de humectación como antes. Para detectar los glicanos inmovilizados, prepare lectinas biotiniladas de SNA y ECA a 10 microgramos por mililitro en tampón de detección, y agregue dos microgramos por mililitro de estreptavidina 555 a cada dilución.

Para teñir con las hemaglutininas, prepare una solución de 20 microgramos por mililitro de anticuerpo previamente complejado en tampón bloqueador en una proporción molar de cuatro a dos a uno, como se describe en el protocolo del texto. Transfiera 20 microlitros de las soluciones preparadas a los pocillos de una placa de 384 pocillos. A continuación, diluya seriadamente las lectinas y hemaglutininas uno a uno en sus tampones respectivos.

Realice ocho diluciones, llenando cada pocillo con 10 microlitros de muestra y 10 microlitros de tampón. A continuación, incube la placa sobre hielo durante 30 minutos. Ahora agregue ocho microlitros de cada dilución a uno de los 48 micropocillos de una lámina impresa.

A continuación, incubar la preparación en la cámara de humectación durante 90 minutos. Después de 90 minutos, lavar la preparación sujetándola por el borde; sumergirla en PBS-T cuatro veces, luego sumergirla en PBS cuatro veces y finalmente, sumergirla en agua desionizada cuatro veces. Ahora, secar la preparación mediante centrifugación como antes.

Después de secar por centrifugado, escanee inmediatamente la laminilla. Asegúrese de cargar cuidadosamente la laminilla en el escáner en la orientación correcta. Escanee iterativamente las laminillas utilizando una potencia baja del láser de cinco milivatios, aumentando gradualmente la ganancia del 25 al 75 %. Al optimizar los parámetros de escaneo, tenga en cuenta que los fluoróforos se desvanecerán con escaneos repetidos.

Analice la imagen guardada para detectar señales de unión utilizando el software asociado. Puede cargarse una lista de matriz que contenga el patrón de impresión. Superponga esta lista sobre el escaneo para ayudar a navegar la colocación de los marcadores de cuadrícula.

Luego, utilice el software para analizar las intensidades de los puntos y guarde los resultados como un archivo de texto delimitado por tabulaciones para exportarlo a una hoja de cálculo o a otro paquete estadístico. Analice los datos calculando la intensidad media de la señal menos el fondo. Tome el promedio de cuatro de los seis puntos replicados para cada muestra, excluyendo la señal más alta y la señal más baja.

Luego, elabore un gráfico de líneas de la señal media promedio menos el fondo frente a las ocho concentraciones de proteína. Suavice la línea resultante utilizando regresión no lineal. La matriz de PAA se utilizó para evaluar la especificidad de unión al receptor de las hemaglutininas del virus de la influenza A.

El arreglo incluyó controles no sialilados en los mismos micropozos. Se utilizaron lectinas vegetales con especificidades conocidas para los compuestos impresos como controles positivos. La lectina ECA se unió a la galactosa terminal beta 1-4 unida a N-acetilglucosamina y no se unió al mismo compuesto si la galactosa terminal estaba cubierta con ácido siálico.

Para probar el ácido siálico unido mediante enlace alfa 2-6, se utilizó la lectina SNA. Como se esperaba, SNA solo se unió a los ácidos siálicos unidos mediante enlace alfa 2-6, pero con diferencias notables en afinidad para repeticiones de lacNAc marcadas con colorante unidas a PAA frente a las no unidas a PAA. A continuación, se analizó una hemaglutinina H5 derivada de un virus Vietnam/1203/04 que solo reconoce ácidos siálicos unidos mediante enlace alfa 2-3.

El perfil de unión de la hemaglutinina H5 mostró la especificidad esperada con una mayor afinidad por las estructuras ligadas a PAA. Finalmente, se analizó la hemaglutinina H1 de una cepa seasonal humana H1N1. Como era de esperar, esta hemaglutinina solo se unió a estructuras que contienen ácido siálico ligado alfa 2-6.

Una vez dominada, esta técnica puede revelar las especificidades de unión y las avidades relativas de los virus de la influenza dentro de un solo ensayo. Esta técnica mejorará considerablemente la eficiencia de los ensayos de unión de la influenza, además de reducir el consumo de biológicos valiosos.