Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

El objetivo general de este ensayo de microneutralización es caracterizar todos los tipos de virus de la influenza que circulan actualmente y la actividad de los anticuerpos y las mediciones antivirales de una manera cuantitativa, de alto rendimiento y altamente sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como la caracterización antigénica de los virus de la influenza, la neutralización cuantitativa de anticuerpos y las actividades antivirales. La principal ventaja de esta técnica es que caracterizó toda la población de células infectadas, incluidas las placas visibles e invisibles y las infecciones unicelulares.

El ensayo de microneutralización será demostrado por el Dr. Yipu Lin, director adjunto del Centro Colaborador de la OMS para la Gripe en Londres. El nivel de bioseguridad, o BSL, para el siguiente protocolo es BSL 2 para los virus de la influenza estacional y BSL 3+ para los posibles virus de la influenza pandémica. Para empezar, alícuota suficientes celdas en placas de 96 pocillos.

Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante dos o tres días para alcanzar la confluencia. Usando etanol al 70%, esterilice una lavadora de placas de pocillos múltiples y use PBS o VGM para enjuagarla. Luego, use 200 microlitros de medio de crecimiento del virus, o VGM, para lavar las células confluentes.

Aspire el VGM de las células e inmediatamente agregue 50 microlitros de VGM a cada pocillo. A continuación, agregue 900 microlitros de VGM a cada uno de los seis tubos estériles. A continuación, pipetear 100 microlitros de virus en el primer tubo y mezclar bien.

Prepare diluciones seriadas del virus comenzando con el primer tubo, cambiando las puntas entre cada dilución. Agregue 50 microlitros de cada dilución de virus, comenzando con la dilución más alta para duplicar pocillos de una placa de 96 pocillos. Luego, coloque la placa a 37 grados centígrados durante dos o tres horas para permitir que el virus infecte las células.

Después de preparar la superposición de acuerdo con el protocolo de texto, retire el inóculo de los pocillos. Luego, agregue 200 microlitros de superposición a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante la noche sin perturbaciones. Agregue 200 microlitros de PFA 4% frío en PBS A a los pocillos e incube a cuatro grados centígrados durante 30 minutos o a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de la incubación, aspire el PFA y use 200 microlitros por pocillo de PBS A para lavar la placa dos veces. Agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización a la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, use PBS A para lavar la placa dos veces.

A continuación, añada 50 microlitros por pocillo de un anticuerpo monoclonal de ratón contra la gripe tipo A a los pocillos, e incube a temperatura ambiente agitando durante una hora. Después de la incubación, use 300 microlitros de tampón de lavado para lavar el pocillo tres veces. A continuación, añada 50 microlitros de un anticuerpo secundario de cabra conjugado con HRP a las muestras e incube a temperatura ambiente durante una hora.

Después de lavar los pocillos tres veces como antes, agregue 50 microlitros de sustrato por pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta que el desarrollo de un color azul sea claramente visible. Para detener la reacción, use 200 microlitros de agua destilada para lavar los pozos dos veces. Luego, después de secar al aire la placa, guárdela en un lugar oscuro.

Coloque una placa de pocillo en el área de escaneo de un escáner plano, utilizando el límite de posición en forma de L para garantizar que se pueda obtener una ubicación de imagen óptima y repetible. Escanee la placa usando la configuración que se muestra aquí. A continuación, ejecute el software del lector de placas de pocillos para calcular la concentración de virus necesaria haciendo clic en el botón Cargar imagen para cargar una imagen.

A continuación, en la pestaña de umbral global, deslice la barra roja en el histograma para ajustar el umbral de muestreo. A continuación, haga clic en el botón de actualización para examinar el efecto en una imagen. Ahora, marque la casilla Calcular neutralización/valoración.

Haga clic en el botón Muestreo para cuantificar la población de células infectadas, o ICP. A continuación, cuando se le solicite, haga clic en el botón Guardar para guardar los resultados del muestreo. Para obtener los resultados de la valoración, cargue o ingrese el mapa de definición de la placa de pocillos.

En Titulación:Población óptima de virus, indique el umbral. Seleccione la pestaña Proceso de valoración para calcular los resultados de la valoración. A continuación, compruebe los resultados de la valoración antes de hacer clic en el botón Guardar y cerrar para guardar los resultados.

Consulte el suplemento S1 para obtener instrucciones más detalladas sobre el software. Para llevar a cabo la neutralización del virus, prepare la monocapa celular con dos o tres días de anticipación. A continuación, añade 50 microlitros de VGM a cada pocillo de la placa.

Utilice las columnas 11 y 12 para el control de virus y el control de células, respectivamente. Agregue alícuotas de 50 microlitros de una dilución de uno en 20 de suero tratado con enzima destructora de receptores, o RDE, a la primera fila de columnas del uno al 10. Realice diluciones en serie dobles transfiriendo 50 microlitros de la fila A a la fila H y desechando 50 microlitros de la fila H. Luego, agregue 50 microlitros de diluyente a cada pocillo de la columna de control de la celda.

Agregue 50 microlitros del virus a cada pocillo de la placa, a excepción de la columna de control de celdas. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos o tres horas. Luego, retire el inóculo y agregue la capa a cada pocillo.

Incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados sin tocarla. Luego, fije y tiña las placas como se muestra anteriormente en este video. Para cuantificar la neutralización, coloque una placa de pocillo en el área de escaneo de un escáner de superficie plana, como se demostró anteriormente en este video.

Escanee la placa y ejecute el software del lector de placas del pocillo para calcular los títulos virales requeridos como antes. Después de cargar o ingresar el mapa de placas de pocillos, en Neutralización:Deducción de infección indique el umbral. A continuación, seleccione Proceso de neutralización para calcular los títulos.

Finalmente, verifique los títulos y haga clic en el botón Guardar y cerrar para guardar los resultados de la neutralización. A continuación se muestran los resultados de titulación de experimentos recientes de caracterización antigénica de ocho virus de entrada con diluciones entre 1,0 veces 10 por 10 para el negativo y 1,0 por 10 para el menos seis. El gráfico ilustra que los PIC disminuyen con un aumento en la dilución del virus.

Las curvas se normalizaron frente a las ICP de los mismos virus que produjeron infecciones en todas las células dentro de un pocillo. En esta tabla se enumeran las diluciones de virus que produjeron un 30% de saturación de ICP que se eligieron como dilución de virus de entrada para la neutralización. Esta figura muestra los resultados de un experimento de neutralización utilizando un virus de entrada contra cinco antisueros.

El gráfico ilustra el proceso de infección con el aumento de la dilución sérica. La población positiva normalizada en el eje vertical representa la relación entre los ICP de la respuesta antisuera correspondiente y la ICP media del virus de referencia. Finalmente, se determinaron los títulos de neutralización como los recíprocos de las diluciones de antisuero correspondientes a una reducción del 50% de la PIC.

Este ensayo se centra en la consistencia, la velocidad y la sensibilidad de detección, incluida la valoración cuantificada de los virus de entrada, las imágenes de alto rendimiento y el procesamiento de datos. Es rentable, fácil de usar y se ha utilizado de forma rutinaria en estudios de antígenos virales.