Name: Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de micro-neutralización cuantitativo para caracterizar virus de influenza circulantes y evaluar la actividad de anticuerpos. Este método de alto rendimiento utiliza escáner plano para cuantificar poblaciones celulares infectadas.

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Los autores agradecen al Dr. M. Matrosovich por proporcionar las líneas celulares MDCK y MDCK-SIAT1 y a Roche Pharmaceuticals por suministrar el carboxilato de oseltamivir. También agradecemos a la Dra. Anne Weston por sus valiosas sugerencias sobre el manuscrito. Este estudio dependió de la valiosa colaboración de los Centros Nacionales de Influenza de la OMS y los CC de la OMS dentro del GISRS de la OMS, que proporcionaron los virus de la influenza utilizados. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Médica a través del Programa U117512723.

NOTA: El nivel de bioseguridad (BSL) para el siguiente protocolo es BSL 2 para los virus de la gripe estacional y BSL 3+ para los virus de influenza pandémica potenciales. se requiere la titulación viral antes de un experimento de neutralización para decidir la concentración viral del control viral (VC). Titulación 1. Virus NOTA: En función del número de virus y el número de duplicados, una placa se puede configurar con los siguientes flexibilidades: (1) La dilución viral puede ser arreglado a lo largo de las filas o las columnas (Figura 1). Cada virus debe ocupar una fila / columna separada. (2) El incremento de la dilución viral es flexible, pero debe comenzar con la más alta concentración viral en la esquina superior izquierda. (3) No hay ninguna restricción sobre el número de duplicados. NOTA: Madin Darby de riñón canino (MDCK) y MDCK-SIAT1 células (SIAT) fueron amablemente proporcionados por el Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germuchos 10. células SIAT son células MDCK transfectadas de forma estable con el CMP-N-acetilneuraminato humano: gen de la ß-galactósido α-2,6-sialiltransferasa para una mayor expresión de ácido siálico (SA) oligosacáridos α2-6Gal terminados en. <ol><li> Células alícuotas suficientes MDCK o células MDCK-SIAT 8 en placas de 96 pocillos (200 l / pocillo). Se incuban las células a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 o 3 días para llegar a la confluencia. Propagar las células en DMEM suplementado con suero inactivado por calor al 10% de ternera fetal (FCS) y antibióticos (100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). Se incuban las células SIAT a 37 ° C con 5% de CO 2 y 1 mg / ml de sulfato de G418. NOTA: El factor de dilución depende de la experiencia y la línea celular utilizada. La monocapa de células debe ser confluente (es decir, no de la pared celular o en un esquema visible para las células MDCK y una disposición apretada-para las células MDCK-SIAT1) en el momento de la inoculación del virus. Ejemplos de diluciones basan enla subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1 se dan en la Tabla 1. </li><li> Lavar las células 3 veces con 200 l de medio de crecimiento del virus (VGM) por pocillo. Esterilizar el lavador de placas de paredes múltiples con 70% de EtOH durante 30 minutos, y luego enjuague en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o VGM antes del lavado. </li><li> Aspirar el VGM y añadir inmediatamente 50 l de VGM a cada pocillo. </li><li> Añadir 900 l de VGM a cada uno de 6 tubos estériles (o menos, dependiendo del número de los virus de prueba y los duplicados). Pipetear 100 l de virus en el primer tubo, mezclar bien y diluir en serie, cambiando la punta entre cada dilución. Repita este procedimiento para cada virus a titular. NOTA: Esto le dará a diluciones de virus de 10 -1 a 10 -6. </li><li> Añadir 50 l de cada dilución de virus, a partir de la dilución más alta (1 x 10 -5 en la Figura 1), a los pocillos duplicados (columnas 9 y 10 en la figura 1) de un 9placa de 6 pocillos. </li><li> Coloque la placa a 37 ° C durante 2-3 horas para permitir que el virus infecte a las células. NOTA: una incubación de 2 a 3 horas es necesario para asegurar que los virus en el inóculo tienen tiempo suficiente para llegar a la monocapa. </li><li> Preparar la superposición (10 ml / placa) NOTA: La superposición consiste en 5 ml de DMEM 2x, tripsina (2 mg / ml de concentración final), 20 l de 1 mg / ml, social y 5 ml de borra de algodón de celulosa (véase la Lista de Materiales). </li><li> Retire el inóculo. </li><li> Añadir la superposición (200 l a cada pocillo). Incubar toda la noche a 37 ° C, sin ser molestado. NOTA: La gemación de virus se lleva a cabo después de aproximadamente 4 horas, lo que es importante que la placa no se altera después de este tiempo. </li><li> Aspirar la superposición de los pozos. </li><li> Añadir enfriado en hielo 4% de paraformaldehído en PBS A (200 l / pocillo). Colocarlos en 4 ° C durante 30 min o a temperatura ambiente durante 20 min. NOTA: PBS-A es el pH natural de solución salina tamponada con fosfato con 10 gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na 2 HPO 4, 0,25 g de KH 2 PO 4, y 1 litro de agua destilada (véase la Lista de Materiales). NOTA: El paraformaldehído es nocivo si se inhala y puede causar quemaduras si se ingiere. También hay evidencia limitada de un efecto carcinógeno, y puede causar sensibilización tras el contacto con la piel. </li><li> Aspirar el paraformaldehído y se lavan las placas dos veces con PBS A (200 l / pocillo). </li><li> Almacenar las placas en PBS A a 4 ° C para su uso futuro, o continuar con los pasos siguientes. </li><li> Añadir tampón de permeabilización (100 l / pocillo). Dejarlo a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar la placa dos veces con PBS A (200 l / pocillo). </li><li> Añadir 50 l de la primera anticuerpo, MAb de ratón contra la gripe de tipo A (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 4 ° C durante la noche), con agitación. </li><li> Lavar 3 veces en 100 l de tampón de lavado (0,05% de Tween 80 en PBS A, v / v) per bien. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min entre lavados. Como alternativa, se lava 3 veces sin incubación usando 300 l por pocillo. </li><li> Añadir 50 l de la segunda anticuerpo, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H + L) conjugado con HRP (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, con agitación. </li><li> Lavar 3 veces como se describe en el paso 1.17. </li><li> Añadir el sustrato (50 l / pocillo). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min o hasta que el desarrollo de un color azul es claramente visible. </li><li> Para detener la reacción, se lava la placa dos veces con 200 l de agua destilada por pocillo, incubando a temperatura ambiente durante 2 -3 min entre los lavados. </li><li> El aire seco de la placa y la almacena en un lugar oscuro (por ejemplo, envolver en papel de aluminio). </li></ol> 2. Cuantificación de titulación <ol><li> Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figura 2a. Utilice el límite de posición en forma de L deasegurar una ubicación óptima y repetible de imágenes. NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración. </li><li> Escanear una imagen. NOTA: Los ajustes se muestran en la Tabla 2. </li><li> Ejecutar el software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular la concentración de virus requerida (Figura 3). <ol><li> Haga clic en el botón &quot;Cargar imagen&quot; para cargar una imagen. Deslice la barra roja en el histograma de la pestaña &quot;Umbral Global&quot; para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón &quot;Actualizar&quot; para examinar el efecto en la imagen. </li><li> Marque la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot;. Haga clic en el botón de &quot;muestreo&quot; para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón &quot;Guardar&quot; para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite. NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada &quot;Neutralización y volumetría de cálculo&quot; aparece automáticamente si la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot; está marcada. </li><li>La carga o la entrada de la definición del mapa de placa de pocillos. Indicar el umbral (por ejemplo, 30%) en &quot;Titulación: población de virus óptima (%)&quot;. Seleccione la pestaña &quot;Proceso de Titulación&quot; para calcular los resultados de la titulación. Compruebe los resultados de la titulación. Haga clic en el botón &quot;Guardar y Cerrar&quot; para guardar los resultados de la titulación. NOTA: Consulte la S1 para la instrucción más detallada sobre el software. Una copia del software a medida, disponible bajo petición. NOTA: Por lo general, la dilución de virus para mejor el rendimiento del ensayo de reducción de placa alrededor de un 50% (20-85%) ICP del total de células dentro de cada pocillo 11. </li></ol></li></ol> La neutralización 3. Virus NOTA: Calcular el número de placas necesarias para el ensayo de neutralización. Cada placa puede acomodar un virus y un número de antisueros. NOTA: En función del número de antisueros y el número de duplicados, una placa se puede configurar con la famie siguiente flexibilidades: (1) La dilución de suero se pueden disponer a lo largo de la fila o la columna (Figura 4). Cada suero debe ocupar una fila o columna separada. (2) El incremento de la dilución del suero es flexible, pero debe comenzar con la concentración más alta de suero en la esquina superior izquierda de una placa. (3) El número de duplicados equilibra el número de antisueros. Más duplicados pueden ayudar a suavizar las variaciones experimentales. (4) El número de la VC y el número del control celular (CC) duplicados son flexibles, pero también deben estar en filas o columnas separadas. Se espera que el número de duplicados VC es significativamente mayor que la de los antisueros. <ol><li> Preparar la monocapa de células, como en los pasos 1.1-1.3, 2 o 3 días de antelación. </li><li> Añadir 50 l de VGM a cada pocillo de la placa. </li><li> Utilice las columnas 11 y 12 para VC y CC, respectivamente. Añadir 50 l de alícuotas de 01:20 enzima destructora del receptor (RDE) de suero tratado con a la primera fila (A) de Columns 1-10. NOTA: Para cada combinación de virus y el suero, el ensayo se realizó por duplicado, por lo que una placa puede, por ejemplo, contener probado un virus contra cinco antisueros. </li><li> Realizar 2 veces diluciones seriadas mediante la transferencia de 50 l de la fila A a la fila H (columnas 1-10 en la figura 4) y descartando 50 l de la fila H. </li><li> Añadir 50 l de diluyente a cada pocillo de la columna de la CC (columna 12 en la Figura 4). </li><li> Añadir 50 l de virus a cada pocillo de la placa, a excepción de la columna de la CC (columnas 1-11, filas AH en la Figura 4). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2-3 horas. Retire el inóculo. Añadir la superposición (200 l) a cada pocillo. Incubar durante la noche a 37 ° C, sin ser molestado. Fijar y teñir las placas en cuanto a la titulación del virus (pasos 1.11 a 1.22). </li></ol> 4. Neutralización Cuantificación <ol><li> Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figure 2a. Utilice el límite de posición en forma de L para asegurar una ubicación óptima de imagen y repetible. NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración. </li><li> Analiza la placa, como se describe en el paso 2.2. </li><li> Ejecutar el software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular los títulos virales requeridos (figura 3, paso 2.3). <ol><li> Haga clic en el botón &quot;Cargar imagen&quot; para cargar una imagen. Deslice la barra roja en &quot;Umbral Global&quot; para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón &quot;Actualizar&quot; para examinar el efecto. </li><li> Marque la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot;. Haga clic en el botón de &quot;muestreo&quot; para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón &quot;Guardar&quot; para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite. NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada &quot;Neutralización y volumetría de cálculo&quot; aparece automáticamente si la casilla &quot;Calcular Neutralización / Titulación&quot; está marcada. </li><li> De carga o la entrada al pozo-pmapa tarde. Indicar el umbral (por ejemplo, 50%) en &quot;Neutralización: Deducción Infección (%)&quot;. </li><li> Seleccione &quot;proceso de neutralización&quot; para el cálculo de los títulos. Compruebe los títulos y haga clic en el botón &quot;Guardar y Cerrar&quot; para guardar los resultados de neutralización. NOTA: La neutralización se expresa como el recíproco de la dilución más alta del suero con la predefinido reducción ICP (tal como 50% o 80%) en contra de la VC (la media de la columna 11 en la Figura 4). Una reducción ICP 50% se utilizó en los resultados representativos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, hemos descrito un ensayo de MN a base de formación de imágenes para cuantificar las verdaderas relaciones antigénicas entre los virus. En comparación con otros ensayos de reducción de placa, el método hace hincapié en la medición de la ICP de un bien todo, garantizar la cobertura completa de la población infecciosa. Su independencia de la formación de placa también se amplía la aplicación del ensayo a los virus que pueden formar pequeñas placas principalmente invisibles o que sólo pueden manejar la infección de una sola célula. Por lo tanto, el ensayo es capaz de examinar más virus y los efectos de una gama más amplia de anticuerpos que HI, y ayuda a reflejar de forma más exhaustiva las similitudes antigénicas o diferencias entre los virus 12. Por ejemplo, cuando se incluye carboxilato de oseltamivir, el ensayo de MN se ve menos afectada por NA unión dependiente, lo que refleja las diferencias antigénicas con más precisión. Durante el desarrollo del ensayo, se hicieron grandes esfuerzos para mejorar la consistencia experimento, la velocidad, y la detecciónsensibilidad, incluyendo mediante el control de los virus de entrada a través de la valoración cuantificada, de imágenes en un alto rendimiento con un escáner de superficie plana, y la implementación de una plataforma de procesamiento de datos fácil de usar. Los resultados han sido, en general consistentes con y confirmó las de HI. En particular, los resultados también revelaron diferencias antigénicas entre variantes de deriva antigénica de los virus recientes de tipo A y de la vacuna B, así como cambios antigénicos causados ​​por los cambios de cultivo seleccionada o esporádicos, tales como la sustitución G155E en HA1 de ciertos (H1N1) virus pdm09 A 12. El protocolo de juego con el tipo de virus o subtipo con la selección de líneas celulares que dieron la infección más fuerte, lo que permitió aumentar la señal de imagen. variación experimental se alisa con el diseño de duplicados que equilibrarse con el número de antisueros probado. Las incertidumbres también pueden provenir de la calidad de imagen, que está influenciada principalmente por el dispositivo de formación de imágenes. Una superficie plana de color del escáner decente puede signinificativamente mejorar el contraste de la imagen y reducir el ruido. La cantidad de virus de entrada en la neutralización debe ser determinado cuantitativamente por adelantado de la valoración correspondiente, mientras que los virus todavía mantienen un estado similar. Durante la neutralización, la respuesta a una infección antisuero se normaliza contra la diferencia entre el virus de referencia (VC) y el nivel de fondo (CC). Las mediciones precisas de VC y CC son esenciales para un experimento de neutralización. Se recomiendan más duplicados (ocho duplicados fueron utilizados en los resultados representativos). Por último, la comprensión de que el software es vital para el éxito de un experimento. El software ha sido probado para la caracterización del virus de la rutina en el Centro de la Gripe de la OMS, Reino Unido durante más de dos años. Las instrucciones detalladas para hacer frente a diversas situaciones se proporciona en el S1 complementario. Este ensayo MN es adecuado para aplicaciones en las que las muestras cubren una extremely gran campo de vista, pero sólo requieren de imágenes de resolución moderada. El bajo costo y fácil instalación hacen que el sistema fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios de virología. La variación en las mediciones de la misma muestra fue de menos de 3%, que define aproximadamente la incertidumbre introducida durante la exploración 11. Tal reproducibilidad es suficiente en muchos estudios virológicos y puede reducirse aún más el promedio de las imágenes de varias exploraciones. En conclusión, este estudio demuestra un ensayo de MN robusto que puede ser utilizado de forma rutinaria en estudio antigénico y para apoyar los datos HI de análisis detallados de virus de la gripe actualmente en circulación, en particular para la selección bianual de virus para su inclusión en las vacunas de la gripe humana.

Micro-neutralización (MN) ensayos se utilizan en virología para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes y de las actividades antivirales. Como una alternativa de inhibición de la hemaglutinación (HI), ensayos de MN pueden superar los efectos no antigénicos influenciados por los cambios de afinidad de unión al receptor en los virus de influenza, que puede complicar la interpretación de los resultados de HI 1,2,3. Hasta hace poco, la mayoría de los ensayos de MN se basaron en los efectos citopáticos (CPE) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) 4,5. MN ensayos basados en la reducción de enfoque y la placa se desarrollaron en 1990 6,7,8. ensayos de reducción de placas se basan en el recuento de placas visibles para cuantificar la infectividad. Sin embargo, los conteos visuales sólo cubren grandes placas que son resolubles por los ojos humanos, a pesar de que la mayoría de las placas son pequeños e invisibles para muchos virus circulantes actuales. Esta cobertura incompleta puede causar una variación significativa entre los examinadores y entre experimentos, lo que lleva a incomparable resultados. También es imposible utilizar el método cuando algunos virus muestran infección abortiva de células individuales o muy pequeñas placas. La resolución de contaje pobre se puede mejorar mediante la introducción de un protocolo basado en formación de imágenes. Con los avances en la tecnología, microscopía óptica y de alto rendimiento de los lectores de placas bien pueden proporcionar medios precisos para contar las células infectadas 9. Bajo el microscopio trans-iluminación, las células infectadas etiquetados con ciertos marcadores pueden ser visualizados por su absorción o fluorescencia contraste en la resolución subcelular. Una muestra puede ser analizada en una pantalla de ordenador. Desafortunadamente, debido a la limitación en el campo de vista, se requieren más de un centenar de imágenes en mosaico para cubrir un solo pozo. El análisis de una placa con 96 pozos requeriría la formación de imágenes y procesamiento de cerca de diez mil imágenes. Tal proceso laborioso es largo y costoso, y la resolución obtenida es en génerosl innecesario para la caracterización de rutina de infecciones virales. Laboratorios con un presupuesto limitado pueden encontrar que el enfoque en torno a un escáner de superficie plana ofrece una alternativa de alto rendimiento rentable. En este trabajo se describe un ensayo de reducción de placas MN mejorado que es adecuado para la caracterización antigénica de un gran número de virus y para medir cuantitativamente las actividades antivirales y anticuerpos de neutralización. El ensayo tiene varias ventajas: en primer lugar, es un ensayo basado en formación de imágenes que es capaz de medir las infecciones de virus en el nivel celular, independientemente del tamaño de la placa. Contando la población total de células infectadas (ICP) dentro de un bien aumenta en gran medida la sensibilidad de detección, por lo que es posible caracterizar el virus con baja infectividad. En segundo lugar, una valoración cuantitativa más precisa se introduce antes de la neutralización para determinar la cantidad de virus de entrada. El virus de entrada cuantitativa reduce significativamente la variación entre los diferentes experimentos y hace que los resultados sean más comparables entre los laboratorios. En tercer lugar, los títulos de neutralización pueden determinarse directamente mediante el análisis de imágenes, por lo que la cuantificación rápida y fácil de usar. Por último, el protocolo ofrece una alternativa rentable y de alto rendimiento con la resolución y la precisión requerida. La cuantificación se basa en un escáner de superficie plana y software de procesamiento de datos libre. Todo el conjunto tiene un tamaño reducido y se puede implementar en la mayoría de los laboratorios. El protocolo presentado en este documento consta de cuatro pasos importantes, incluyendo la titulación del virus, la cuantificación de titulación, la neutralización del virus, y la cuantificación de neutralización. Titulación del virus es un experimento de preparación que determina la cantidad de virus de entrada que se utilizará en la neutralización. Durante una titulación, una serie de concentraciones virales se aplican a las monocapas de células en una placa de 96 pocillos. Las células infectadas se cuantifican a continuación en la sección 2. El Dilu viralción que produce el 20% -85% ICP se aplica a su vez como virus de entrada correspondiente a la neutralización de 3. Los títulos de la sección del protocolo de neutralización se cuantifican utilizando la sección 4. Los experimentos que siguieron los protocolos anteriores se presentan en los resultados representativos. El ensayo ha sido probado a fondo durante los últimos dos años con la mayoría de los virus de la gripe que circulan corrientes, tales como A pdm09 (H1N1), A (H3N2), virus A y B. Los resultados de la caracterización virus de la gripe se incluyeron en los informes para la reunión de consulta de la OMS que dio recomendaciones sobre vacunas contra la gripe para su uso en el hemisferio sur en 2016 y en el Hemisferio Norte 2016-2017.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Solución salina tamponada con fosfato: NaCl 10&nbsp; g, KCl 0.25&nbsp; g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g, y Dist. Agua 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2,4 g en 100 ml de agua destilada disuelta por agitación en un agitador magnético durante 1 hora. Esterilizar en autoclave.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Superposición (10 ml/plato):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Tripsina 2&nbsp; &mu; concentración final de g/ml, Avicell 5&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td>Tampón de permeabilidad: 0,2% en PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Tampón de lavado: 0,05% Tween 80 en PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>Tampón ELISA: 10% en PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb contra la gripe tipo A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st Anticuerpo: 1:1.000 en ELISA Tampón</td></tr> de <tr><td>cabra anti-ratón IgG (H+L) HRP conjugado</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd Anticuerpo: 1:1.000 en ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidasa sustrato</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Sustrato: Azul verdadero +0.03% H2O2g (1:1,000 de solución al 30%)</td></tr><tr><td>Placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Arandela y colector de placas multipared de 8 canales</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>El software de imagen se puede descargar gratuitamente desde <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Descargas">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Descargas</a>.</td></tr><tr><td>Entorno operativo de software: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Basado en ventanas con el constructor NI Vision</td><td>Versión: LabVIEW2012 o superior</td></tr></tbody></table>

optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

El ensayo de microneutralización (MN) es una técnica estándar para medir la infectividad del virus de la influenza y la inhibición de la replicación del virus. En este estudio, presentamos el protocolo de un ensayo de MN basado en imágenes para cuantificar las verdaderas relaciones antigénicas entre virus. A diferencia de los ensayos típicos de reducción de placa que se basan en placas visibles, este ensayo cuantifica toda la población de células infectadas de cada pocillo. El protocolo hace coincidir el tipo o subtipo de virus con la selección de líneas celulares para lograr la máxima infectividad, lo que mejora el contraste de la muestra durante la obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes. La introducción de la valoración cuantitativa define la cantidad de virus de entrada de neutralización y permite que los resultados de diferentes experimentos sean comparables. La configuración de imágenes con un escáner plano y software descargable gratuito hace que el enfoque sea de alto rendimiento, rentable, fácil de usar y fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios. Nuestro estudio demuestra que el ensayo MN mejorado funciona bien con los virus de la influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2) y B que circulan actualmente, sin verse influenciado significativamente por las sustituciones de aminoácidos en la neuraminidasa (NA) de los virus A(H3N2). Es particularmente útil para la caracterización de virus que crecen hasta un título bajo de HA y/o sufren una infección abortiva que resulta en la incapacidad de formar placas en las células cultivadas.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se presentan algunos resultados de los últimos experimentos de caracterización antigénica. La configuración de valoración se diseñó para examinar ocho virus de entrada, con duplicados dobles para cada dilución. Las diluciones virales fueron probados entre 1,0 x 10 -1 y 1,0 x 1,0 -6 para cubrir las variaciones entre los virus. Los virus de ensayo fueron del subtipo H3N2, incluyendo A / Camerún / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, y A / Bratislava / 437/2015. Los resultados de la valoración se ilustran en la Figura 5. La figura 5d demuestra la disminución de la ICP con el aumento de la dilución de virus. Las curvas se normalizaron contra los ICP de los mismos virus que produjeron infecciones en todas las células dentro de un pozo 12 (que se define como la saturación de ICP). Si el ICP no alcanzó la saturación con la hiGhest concentración de virus, se utilizó la media de ICP correspondientes duplicados en lugar (A / Moscow / 103/2015 en la Figura 5d). Las diluciones de virus que producen 30% de la saturación de ICP fueron elegidos como la dilución de virus de entrada para la neutralización (Tabla 3). La neutralización del virus destinado a tener una entrada contra cinco antisueros, con duplicados dobles en cada placa. El virus H3N2 de referencia mostrado es A / Estocolmo / 63 / año 2015. Los cinco antisueros son A / HK 4801/14 F12 huevo / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sudáfrica r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, y A / 525/14 SIAT holandés F23 / 15. Los resultados de neutralización se ilustran en la Figura 6. La figura 6d muestra el progreso de la infección con el aumento de la dilución de suero. La población positiva normalizada en el eje vertical representa la proporción de ICP de la respuesta correspondiente antisueros frente a la media ICPdel virus de referencia 12. El ICP fondo de los controles de células no infectadas se restó durante la normalización. Los títulos de neutralización se determinaron como los recíprocos de las diluciones de antisuero correspondientes a la reducción de ICP% 50 (Tabla 4). La interpolación lineal se utilizó para estimar los títulos que caen entre dos diluciones de suero adyacentes. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de una configuración de placa de pocillos en un experimento de titulación del virus. virus de prueba se asignan a las filas separadas (A a H). Columnas están diseñados para diferentes diluciones virales (1 a 12). Dos columnas se utilizaron como duplicados para cada dilución viral. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2: Esquema de un sistema de barrido de la muestra. (A) Una placa de 96 pocillos en la posición de formación de imágenes de un escáner de superficie plana (republicado de referencia 11 con permiso de Elsevier), y (b) las dimensiones de la posición final en forma de L que se muestran en (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figura 3: Diagrama de escritorio del software de cuantificación &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figura 4: Ejemplo de una configuración de placa de pocillos en un experimento de neutralización. Cada antisuero se asigna a dos columnas con duplicados (1 a 10). Las filas están diseñados para diferentes diluciones de suero (A a H). El control de virus toma la columna 11, con ocho duplicados (A11 a H11). El control de células está en la columna 12, con ocho duplicados (A12 a H12). Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figura 5: Resultados de un experimento de valoración. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) escanea bien la placa radiográfica, (c) la ilustraciónde la, se cuantificó, población celular infectado con virus de color codificada, y (d) normalizados poblaciones de células infectadas por virus contra diluciones de virus. 30% ICP se utilizó como umbral. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figura 6: Resultados de un experimento de neutralización. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) bien la placa radiográfica, (c) la ilustración de la, población de células infectados con virus se cuantificó, y (d) la población de células infectadas por virus normalizada frente a la dilución de suero escaneada. La vi de entradarus (VC) es A / Estocolmo / 63 / año 2015. 50% ICP se utilizó para calcular los títulos. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> S1 complementario: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> dilución típica </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 días </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 días </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Número típico de células por ml </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 días </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 días </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: diluciones típicas en una subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modo </td><td> Modo profesional </td></tr><tr><td> Tipo de Documento </td><td> Película (con guía de área) </td></tr><tr><td> Tipo de exposición automática </td><td> Foto </td></tr><tr><td> EstoyTipo de edad </td><td> Color de 24 bits </td></tr><tr><td> Resolución </td><td> 1.200 dpi </td></tr><tr><td> Formato de imagen guardada </td><td> PELEA </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Configuración típica de un escáner de superficie plana. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fila </td><td> Virus </td><td> Se recomienda la dilución </td></tr><tr><td> UN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> segundo </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> do </td><td> A / Moscow / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> re </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5,9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> mi </td><td> A / Moscow / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moscow / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> GRAMO </td><td> A / Moscow / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> MARIDO </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabla 3: diluciones virales calculados a partir de una población de 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Columna </td><td> antisueros </td><td> título recomendada </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> Un / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 En </td><td> A / Sudáfrica / r2665 / 2015 </td><td> 2155.8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Suiza / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Países Bajos / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Los títulos a 50% de ICP A / Estocolmo / 63/2015 frente a antisueros.

Este estudio describe una -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

El objetivo general de este ensayo de micro-neutralización es caracterizar todos los tipos de virus de la influenza actualmente circulantes, así como la actividad de los anticuerpos y las mediciones antivirales, de manera cuantitativa, de alto rendimiento y altamente sensible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como la caracterización antigénica de los virus de la influenza, la neutralización cuantitativa de los anticuerpos y las actividades antivirales. La principal ventaja de esta técnica es que caracteriza a toda la población de células infectadas, incluyendo placas visibles e invisibles, así como infecciones a nivel de célula individual.El ensayo de micro-neutralización será demostrado por el Dr. Yipu Lin, director adjunto del Centro Colaborador de la OMS para la Influenza en Londres. El nivel de bioseguridad, o BSL, para el siguiente protocolo es BSL 2 para virus de influenza estacional y BSL 3+ para virus de influenza con potencial pandémico. Para comenzar, alícuote células suficientes en placas de 96 pocillos.Incube las células a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante dos o tres días para alcanzar confluencia. Con etanol al 70%, esterilice un lavador de placas multipozo y enjuáguelo con PBS o medio de crecimiento viral (VGM). Luego, use 200 microlitros de medio de crecimiento viral, o VGM, para lavar las células confluentes.Aspire el MGM de las células y agregue inmediatamente 50 microlitros de MGM a cada pocillo. A continuación, agregue 900 microlitros de MGM a cada uno de seis tubos estériles. Luego, pipetee 100 microlitros de virus en el primer tubo y mezcle bien.Prepare diluciones seriadas del virus comenzando con el primer tubo, cambiando las puntas entre cada dilución. Añada 50 microlitros de cada dilución del virus, comenzando con la dilución más alta, a pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos. A continuación, coloque la placa a 37 grados Celsius durante dos o tres horas para permitir que el virus infecte las células.Después de preparar la cobertura según el protocolo descrito, retire el inóculo de los pocillos. A continuación, agregue 200 microlitros de cobertura a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante la noche sin perturbar. Añada 200 microlitros de PFA al 4 % frío en PBS A a los pocillos e incube a cuatro grados Celsius durante 30 minutos o a temperatura ambiente durante 20 minutos.Después de la incubación, aspire el PFA y use 200 microlitros por pocillo de PBS A para lavar la placa dos veces. Añada 100 microlitros de tampón de permeabilización a la placa e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, use PBS A para lavar la placa dos veces.A continuación, agregue 50 microlitros por pocillo de un anticuerpo monoclonal de ratón contra el tipo A de la influenza a los pocillos e incube a temperatura ambiente con agitación durante una hora. Tras la incubación, use 300 microlitros de tampón de lavado para lavar el pocillo tres veces. Luego, agregue 50 microlitros de un anticuerpo secundario de cabra conjugado con HRP a las muestras e incube a temperatura ambiente durante una hora.Después de lavar los pozos tres veces como antes, añada 50 microlitros de sustrato por pozo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta que el desarrollo de un color azul sea claramente visible. Para detener la reacción, lave los pozos dos veces con 200 microlitros de agua destilada. Luego, después de secar la placa al aire, guárdela en un lugar oscuro.Coloque una placa de pocillos en el área de escaneo de un escáner plano, utilizando el límite de posición en forma de L para asegurar una ubicación óptima y repetible de la imagen. Escanee la placa utilizando los ajustes mostrados aquí. Luego, ejecute el software del lector de placas de pocillos para calcular la concentración requerida del virus haciendo clic en el botón Cargar imagen para cargar una imagen.A continuación, en la pestaña de umbral global, deslice la barra roja en el histograma para ajustar el umbral de muestreo. Luego, haga clic en el botón actualizar para examinar el efecto sobre la imagen. Ahora, marque la casilla Calcular neutralización/titulación.Haga clic en el botón Muestreo para cuantificar la población de células infectadas, o ICP. Luego, cuando se le solicite, haga clic en el botón Guardar para guardar los resultados del muestreo. Para obtener los resultados de la titulación, cargue o introduzca el mapa de definición de la placa de pocillos.En Titulación: Población óptima de virus, indique el umbral. Seleccione la pestaña Proceso de titulación para calcular los resultados de la titulación. Luego, revise los resultados de la titulación antes de hacer clic en el botón Guardar y cerrar para guardar los resultados.Consulte el suplemento S1 para obtener instrucciones más detalladas del software. Para llevar a cabo la neutralización viral, prepare la monocapa celular con dos o tres días de anticipación. Luego, agregue 50 microlitros de VGM a cada pocillo de la placa.Utilice las columnas 11 y 12 para el control de virus y el control de células, respectivamente. Añada alícuotas de 50 microlitros de una dilución 1:20 de suero tratado con enzima destructora de receptores, o RDE, a la primera fila de las columnas uno a diez. Realice diluciones seriadas al doble transfiriendo 50 microlitros de la fila A a la fila H y descartando 50 microlitros de la fila H. Luego, añada 50 microlitros de diluyente a cada pocillo de la columna de control de células.Añada 50 microlitros del virus a cada pocillo de la placa, excepto en la columna de control de células. Incube la placa a 37 grados Celsius durante dos o tres horas. Luego, retire el inóculo y añada la capa superior a cada pocillo.Incube la placa durante toda la noche a 37 grados Celsius sin perturbarla. Luego, fije y tiña las placas como se demostró anteriormente en este video. Para cuantificar la neutralización, coloque una placa de pocillos en el área de escaneo de un escáner plano como se demostró anteriormente en este video.Escaneé la placa y ejecute el software del lector de placas de pocillos para calcular las titulaciones virales requeridas como antes. Después de cargar o ingresar el mapa de la placa de pocillos, en Neutralización:Deducción de Infección indique el umbral. Luego, seleccione Proceso de Neutralización para calcular las titulaciones.Finalmente, revise las titulaciones y haga clic en el botón Guardar y cerrar para guardar los resultados de neutralización. Aquí se muestran los resultados de titulación de experimentos recientes de caracterización antigénica de ocho virus de entrada con diluciones entre 1,0 veces 10 a la menos uno y 1,0 veces 10 a la menos seis. El gráfico ilustra que los PIC disminuyen con un aumento en la dilución del virus.Las curvas se normalizaron respecto a las PCIs de los mismos virus que produjeron infecciones en todas las células dentro de un pocillo. En esta tabla se enumeran las diluciones de virus que produjeron el 30% de saturación de la PCI y que se seleccionaron como la dilución de virus de entrada para la neutralización. Esta figura muestra los resultados de un experimento de neutralización utilizando un virus de entrada frente a cinco sueros antisueros.El gráfico ilustra el proceso de infección con el aumento de la dilución del suero. La población positiva normalizada en el eje vertical representa la relación de los PIC provenientes de la respuesta de los sueros correspondientes frente al PIC promedio del virus de referencia. Finalmente, los títulos de neutralización se determinaron como los recíprocos de las diluciones de los sueros que correspondían a una reducción del 50 %PIC.Este ensayo se centra en la consistencia, la velocidad y la sensibilidad de detección, incluyendo la titulación cuantificada de virus de entrada, imágenes de alto rendimiento y procesamiento de datos. Es rentable, fácil de usar y se ha empleado rutinariamente en estudios antigénicos virales.

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Inmunología e Infección

Este video muestra ensayos de microneutralización para medir anticuerpos neutralizantes utilizando células de riñón canino Madin-Darby que sobreexpresan ácido siálico ligado a α2,6 en sueros humanos. Este ensayo se utiliza a menudo para la serología humana de la...

Un ensayo de microneutralización para medir los títulos de anticuerpos neutralizantes en el suero humano

Este video muestra el ensayo de microneutralización basado en imágenes para analizar las relaciones antigénicas entre los virus de la influenza A y B. Proporciona una forma cuantitativa y visual de evaluar la eficacia de los anticuerpos u otros tratamientos en la prevención de la infección viral.

Análisis de la relación antigénica entre virus mediante un ensayo de microneutralización basado en imágenes

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Aquí se presenta un protocolo para la determinación de la actividad anti-apoptótica relativa de un mAb anti-TNFα mediante un mecanismo de neutralización con células WEHI 164. Este protocolo es útil para comparar la fuerza de la neutralización de diferentes moléculas con la misma funcionalidad biológica.

Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

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Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.

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Aquí presentamos un protocolo para describir el desarrollo y validación de un sola molécula matriz digital ensayo ELISA, que permite la detección ultrasensible de todos los subtipos de IFN-α en muestras humanas.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

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Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

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Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Aprende a realizar un ensayo de micro-neutralización cuantitativo para caracterizar virus de influenza circulantes y evaluar la actividad de anticuerpos. Este método de alto rendimiento utiliza escáner plano para cuantificar poblaciones celulares infectadas.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

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