Preparación y análisis de In Vitro Tres de mama Carcinoma de dimensiones Surrogates

El objetivo general de este conjunto de procedimientos es generar cultivos celulares tridimensionales para que funcionen como sustitutos del cáncer de mama in vitro, y presentar un método para medir el crecimiento celular en secciones histológicas de los sustitutos. El cultivo celular tridimensional es un método fisiológicamente más relevante para modelar el comportamiento celular in vitro que el cultivo celular bidimensional. Al alterar la composición celular en condiciones experimentales, este conjunto de procedimientos se puede adaptar para abordar una variedad de preguntas biológicas y para evaluar la eficacia de las terapias candidatas.

Para incorporar las células en el ECM, en hielo, agregue las células y los primeros cuatro componentes relacionados enumerados en la tabla uno del manuscrito adjunto, en un tubo de microcentrífuga de dos milímetros. A continuación, mézclalos suavemente pipeteando y evita que se formen burbujas. Controle el nivel de pH utilizando el rojo de fenol en el MEM 10XD para asegurarse de que la mezcla muestre un color rosa anaranjado, lo que indica un pH de siete.

Si la mezcla se ve amarilla y el pH es demasiado bajo, agregue lentamente bicarbonato de sodio al 7.5 por ciento, una gota a la vez, hasta alcanzar el color apropiado. Recuerde mantener la mezcla en hielo y trabajar rápidamente para evitar la polimerización prematura de la ECM. En el caso de los cultivos 3D sólidos, mantenga la cámara deslizante sobre hielo para evitar la polimerización prematura de la MEC.

Pipetee lentamente 100 microlitros de la mezcla de ECM de celda en cada pocillo del portaobjetos de la cámara de ocho pocillos y pipetee la mezcla de ECM de celda alrededor de los bordes del pocillo para ayudar a distribuir mejor la mezcla. A continuación, incube los sustitutos a 37 grados centígrados, cinco por ciento de CO2, durante 45 minutos para permitir la polimerización de la ECM. Después de cuarenta y cinco minutos, agregue 100 microlitros de los medios de cultivo a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 durante la duración del experimento.

Cambie el medio de cultivo cada dos días. Una limitación del cultivo 3D es que la difusión de oxígeno y nutrientes en el volumen puede ser inadecuada para apoyar la viabilidad celular. La adición de un sistema de biorreactor puede ayudar a superar esta limitación y mejorar el crecimiento.

Para profusar cultivos en 3D en un sistema de biorreactores, prepare y ensamble estérilmente la parte del sistema de biorreactor que alberga a los sustitutos. En una campana de cultivo celular, utilizando una jeringa con una aguja de calibre 26, inyecte la mezcla de ECM celular en el área del biorreactor de perfusión diseñado para contener células, y proceda rápidamente al siguiente paso. Para garantizar una distribución más uniforme de las células dentro de los sustitutos, coloque el componente del biorreactor que alberga a los sustitutos en un tubo cónico de 50 mililitros.

Gire continuamente los sustitutos a 18 rpm mientras incuba a 37 grados centígrados en un horno de hibridación in situ o una incubadora durante 45 minutos para permitir la polimerización de ECM. Después de la polimerización y la adición de medio, conecte el conjunto del biorreactor a la bomba. Iniciar la perfusión media en una incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de CO2.

Continúe la perfusión del medio durante la duración del experimento y cambie el medio de cultivo según sea necesario para el diseño experimental específico. Al final del experimento, envuelva a las madres sustitutas en un gel de procesamiento de muestras para mantener a las madres sustitutas intactas durante el procesamiento y facilitar el corte histológico. Para hacerlo, derrita el gel de procesamiento de muestras en un baño de agua a 60 grados centígrados hasta que esté listo para usar.

Luego, pipetee aproximadamente 300 microlitros de gel de procesamiento de muestras en el fondo de un criomolde etiquetado. Con una hoja de bisturí y pinzas, retire con cuidado un sustituto del biorreactor o del pocillo de un portaobjetos de una cámara de ocho pocillos, y colóquelo en los criomoldes que contienen el gel de procesamiento de muestras. Pipetear aproximadamente 300 microlitros de gel de procesamiento de muestras para cubrir al sustituto en el criomolde.

Luego, incubarlo a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Una vez que el gel de procesamiento de muestras se haya solidificado, retire el gel de procesamiento de muestras que contiene el sustituto del criomold y colóquelo en un casete de pañuelos. Si se va a colocar más de un sustituto en el mismo casete de tejido, se pueden utilizar tintes de marcado de tejido para distinguir las muestras después de la fijación y el procesamiento.

Posteriormente, coloque el casete de pañuelos que contiene el sustituto en una fórmula tamponada neutra al diez por ciento durante diez a doce horas a temperatura ambiente para permitir una fijación completa. Después de la fijación, transfiera el casete de tejido que contiene el sustituto a etanol al 70 por ciento. El sustituto fijo ya está listo para su procesamiento en parafina y el posterior corte histológico.

Para medir la densidad celular y las imágenes fotomicroscópicas de las secciones teñidas con H y E, abra un archivo de imagen de la madre sustituta. Utilizando la herramienta Polígono de ImageJ y los bordes del ECM como guía, delinee el área del sustituto arrastrando el ratón y haciendo clic para crear puntos de anclaje. Una vez esbozado, seleccione Medir en la pestaña Analizar.

A continuación, cargue los archivos de imagen utilizados para medir el área sustituta en Cell Profiler arrastrando los archivos de imagen a la lista de archivos. A continuación, asigne un nombre a cada imagen importada en el módulo Importar nombres y tipos y seleccione el tipo de imagen. Una vez generada la canalización de análisis, inicie el modo de prueba y haga clic en Ejecutar en el generador de perfiles de celdas.

Y evalúe los objetos filtrados para asegurarse de que la mayoría de los núcleos de la imagen de prueba se identifiquen correctamente y se elijan los parámetros óptimos para identificar las células. Los núcleos incluidos aparecerán encerrados en un círculo verde. A continuación, guarde el proyecto, salga del modo de prueba y haga clic en Analizar imágenes.

Aquí se muestra una imagen representativa de la sección teñida con H y E de un sustituto perfundido cultivado durante siete días. Y esta es una imagen representativa de la sección teñida H y E de un sustituto sólido cultivado durante siete días con cambio de medio cada dos días. La celularidad es mucho menor en los sustitutos sólidos.

Este gráfico muestra la comparación del número medio de células nucleadas por área después de siete días de crecimiento. Un sustituto perfundido y sólido. Estos datos numéricos apoyan la celularidad en las fotomicrografías de las secciones teñidas H y E.

Y este gráfico muestra la comparación del índice de etiquetado Ki-67, que es la medida de la proliferación celular después de siete días de crecimiento de sustitutos perfundidos y sólidos. Una vez más, estos datos respaldan un mayor crecimiento de las madres sustitutas perfundidas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la hibridación in situ y la histoquímica de aminoácidos, en secciones histológicas de los sustitutos para responder a preguntas como la expresión de ARN y proteínas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar y procesar sustitutos de tejido in vitro tridimensionales y realizar análisis de sustitutos en secciones histológicas teñidas con H y E.