La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Este artículo incluye protocolos detallados para el marcaje genético de la piel del ratón, la denervación quirúrgica, la biopsia de piel y la visualización de epitelios marcados mediante tinción de β-galactosidasa de montaje completo. Estos métodos se pueden utilizar para probar el requerimiento de nervios en modelos de ratón de piel normal y patológica.

El objetivo general de este procedimiento es examinar la influencia de los nervios en la piel normal y patológica. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en la biología normal de la piel, como si los nervios cutáneos afectan la homeostasis y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden comparar muestras de piel intactas y denervadas del mismo animal.

La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los nervios pueden ser difíciles de reconocer y extirpar con un daño mínimo a los tejidos circundantes. En primer lugar, anestesia al ratón y comprueba que ha alcanzado el plano adecuado de sedación con un pellizco en el dedo del pie. Además, confirme que el ratón exhibe una respiración y latidos cardíacos normales.

Ahora coloque al animal en una almohadilla térmica en un área quirúrgica aséptica. Con una maquinilla eléctrica, retire con cuidado el vello de la cara dorsal donde se tomará la biopsia. A continuación, limpie la zona afeitada con Betadyne y toallitas con alcohol.

Asegúrese de que todos los recortes de cabello se eliminen del sitio. Ahora delinee el sitio de la biopsia con un marcador negro. Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia debe discurrir en dirección anterior a posterior, parasetidal a la línea media dorsal.

Con un bisturí, realice una escisión de espesor completo sin dañar la fascia muscular subyacente. Por lo general, el sangrado es mínimo. La muestra de biopsia debe incluir la epidermis, la dermis, la grasa subcutánea y el panículo carnoso.

Aplana la muestra de piel extirpada sobre una toalla de papel seca, con la dermis hacia abajo. Recorte el exceso de toalla de papel y guarde la muestra en TBS fría hasta por una hora si es necesario recolectar otras muestras. Volviendo al ratón, sutura el sitio de la biopsia con 60 suturas de nailon separadas por unos tres milímetros.

A continuación, vigile al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia. Use analgésicos de acuerdo con el cuidado de animales institucional designado y siga sus pautas si el ratón parece angustiado. Dentro de los siete a 10 días posteriores a la cirugía, retire las suturas.

Proceda con el procesamiento de las biopsias para la histología o la tinción de montaje completo. Anestesiar al animal, afeitar toda la piel dorsal y limpiar el área de manera similar al procedimiento de biopsia. Ahora haga una incisión con un bisturí estéril a lo largo de la línea media dorsal desde la base del cuello hasta aproximadamente medio centímetro por encima de la cola.

Con pinzas romas estériles, retraiga suavemente la piel del lado izquierdo lejos del flanco para visualizar el tejido subyacente desde las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello hasta justo por encima de la extremidad trasera. Ahora identifique el nervio cutáneo dorsal bajo un microscopio óptico de disección. Estos aparecen como hebras blancas que viajan caudalmente a través de la fascia translúcida de la pared del tronco antes de hacer curvas cerradas y entrar en el tejido conectivo suelto debajo de la piel.

A continuación, con pinzas ultrafinas, extraiga el nervio exclusivamente del lado izquierdo del animal situado en los sitios anatómicos T3 a T12 arrancándolos desde donde sus segmentos se doblan en la pared del tronco hasta sus sitios de entrada en la piel. Oriente las pinzas verticalmente y agarre los nervios aproximadamente medio centímetro por debajo de sus sitios de flexión. Una vez agarrado, tire hacia arriba para hacer que los nervios se estiren y se separen del tejido circundante para eliminarlos.

Evite dañar los vasos sanguíneos adyacentes. Asegúrese de mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento aplicando periódicamente gotas de solución salina al 0,9%. Continúe extirpando todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco hasta la piel, pero no altere los nervios dentro de la fascia densa de la pared del tronco.

A continuación, retire los nervios del colgajo de piel expuesto. Estas fibras comprenden las ramas distales del nervio cutáneo dorsal y aparecen como hebras ramificadas blancas ubicadas esporádicamente dentro del tejido conectivo en el lado dérmico del colgajo cutáneo. Para eliminar estas ramas finas, coloque las pinzas aproximadamente paralelas a la superficie dérmica, agarre el nervio y arranque hacia arriba.

Elimina todos los nervios visibles de esta manera. No perfore los vasos sanguíneos ni la piel. Durante este paso, es importante evitar romper los vasos sanguíneos vecinos.

Si encuentra un nervio con un vaso sanguíneo adyacente, sígalo eventualmente hasta un área donde no haya ningún vaso adyacente y elimínelo arrancando. Ahora, afloje la piel del lado derecho de la incisión de la línea media dorsal, pero no extirpe ningún nervio. Esto servirá como el control operativo simulado contralateral.

Por último, suturar al animal y monitorizar postoperatoriamente como antes. Posteriormente, para confirmar la pérdida estable de los nervios, semanas después de la cirugía, se pincha suavemente la zona denervada con una aguja hipodérmica estéril. Observa si el animal responde, por lo general estremeciéndose o girando la cabeza.

Si el área de la piel se ha denervado de manera estable, el animal mostrará poca o ninguna respuesta. Recoja biopsias de piel del área sin respuesta y del lado simulado contralateral para muestras experimentales y de control compatibles. A partir de las biopsias, es importante tomar muestras de múltiples secciones histológicas para identificar posibles diferencias en la abundancia o morfología de la cúpula táctil entre los especímenes simulados y los denervados.

La cepa de ratón ERT2 glebe one cree permite dirigirse a la recombinación genética inducida por tamoxifeno en áreas de la piel que muestran una alta actividad de la vía del erizo, como el epitelio de la cúpula táctil. Estos ratones se cruzaron para inducir a los ratones reporteros abolaxi a visualizar los epitelios de la cúpula táctil. Los nodos son cruciales para mantener tanto las cúpulas táctiles normales como sus células de Merkel asociadas.

Esto se demuestra experimentalmente por la pérdida gradual de la morfología normal de la cúpula táctil, así como la pérdida de las ocho células depositadas de queratina después de la denervación. Los nervios también son cruciales para promover la señalización del erizo en la cúpula táctil según lo monitoreado por las expresiones de Glebe one cree ERE2, y la tinción lateral colectiva beta montada en el hogar de la piel simulada y denervada. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extirpar quirúrgicamente los nervios cutáneos dorsales para probar si estos nervios están involucrados en la función normal de la piel o si modulan la enfermedad.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar de forma rutinaria y fiable con un estrés mínimo para el animal. Después de este procedimiento, se pueden utilizar métodos como la tinción aminofluorescente para confirmar si los nervios están completamente ablacionados de la piel y si la expresión génica se está viendo afectada.