Name: La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende la denervación quirúrgica cutánea en ratones para estudiar el papel de los nervios en la homeostasis y patología de la piel. Este método permite comparar muestras intactas y denervadas del mismo animal.

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Los autores desean agradecer a Autumn Peterson por su ayuda con la fotografía con ratones, a Daniel Thoresen por su ayuda con los ratones, y a los Dres. Nicole Ward y Abdelmadjid Belkadi por su ayuda con la denervación quirúrgica. Estos estudios fueron financiados por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (subvenciones R00AR059796 y R01AR065409); el Departamento de Dermatología de la Universidad de Michigan; el Programa de Becarios en Ciencias Biológicas; el Centro de Organogénesis; el Centro Oncológico Integral de la Universidad de Michigan; y el Fondo Oncológico John S. y Suzanne C. Munn. S.C.P. contó con el apoyo financiero del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (subvención T32 GM007315). Este trabajo también contó con el apoyo del Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer.

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de acuerdo con las normas establecidas por la Universidad de Michigan Unidad de Medicina de Laboratorio Animal. 1. Inducir la recombinación genética en ratones Nota: El Gli1 TM3 (CRE / ERT2) Alj / J cepa de ratón (Gli1-CreERT2) 13 permite la orientación de la recombinación genética inducida por tamoxifeno a TD epitelios. Cruzar esta cepa con B6.129S4-Gt (ROSA) reportero ratones 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 para generar Gli1; ​​LacZ animales para visualizar las células TD por todo el montaje en la tinción de abajo. <ol><li> Preparar la solución de tamoxifeno a una concentración de 12,5 mg / ml en aceite de maíz. <ol><li> En un tubo de 1,5 ml, añadir hasta 20 mg de tamoxifeno cristalinas, y luego 1 ml de aceite de maíz. Firmemente con cinta adhesiva el tubo a un mezclador de vórtice, y agitar de forma continua a la configuración más alta a temperatura ambiente hasta que el tamoxifeno se ha disuelto completamente (2-4 h), comoconfirmado mediante el examen del tubo en un microscopio de disección por la ausencia de partículas tamoxifeno. </li><li> Transferir la solución a un tubo de 15 ml y diluir el tamoxifeno a una concentración final de 12,5 mg / ml con aceite de maíz adicional. Mezclar mediante agitación la solución viscosa durante 30 sec adicional. Almacenar esta solución durante un máximo de 1 semana a 4 ° C en la oscuridad. </li></ol></li><li> Se inyecta la solución tamoxifeno por vía intraperitoneal en Gli1; ​​ratones lacZ, en un volumen de 200 l por 20 g de peso corporal de ratón, para una dosis eficaz de tamoxifeno 2,5 mg por 20 g de peso del ratón. </li></ol> 2. Cosecha biopsias de piel Nota: Dependiendo del experimento, las biopsias de piel cosecha de varios días o semanas después de la inducción tamoxifeno. Para todas las cirugías, seguir los protocolos estándar para la cirugía de roedores, incluyendo el uso de guantes estériles, con una máscara quirúrgica o el pelo red, y que cubre al animal con un paño quirúrgico estéril durante el procedimiento. <ol><li> Preparar la solución madre 10x anestesia mediante la mezcla de 90 mg / ml de ketamina y 6,5 mg / ml en agua xilacina. Diluir esta solución madre 1:10 en PBS estéril justo antes de su uso, y almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad durante un máximo de 8 meses. <ol><li> Alternativamente, anestesiar los ratones por inhalación de isoflurano, comenzando con una concentración de gas de 4% con el oxígeno para anestesiar completamente el animal, y, posteriormente, la reducción de este a 1-2% durante la duración del procedimiento. </li></ol></li><li> Se inyecta la solución anestésica por vía intraperitoneal a una dosis de 200 l por 20 g de peso corporal del ratón. Compruebe que el animal ha alcanzado el plano adecuado de sedación mediante el ensayo del dedo del pie de presión, y confirme que ritmo cardíaco y respiratorio son normales (aproximadamente 600 latidos y 160 respiraciones por minuto, respectivamente). </li><li> Utilice una maquinilla eléctrica para eliminar el vello desde el sitio de la biopsia en la piel dorsal de nuevo, teniendo cuidado de no cortar ni dañar la piel subyacente. </li><li> Preparar la zona quirúrgica limpiando la afeitadazona d en una dirección anterior-a-posterior utilizando Betadine y alcohol toallitas. Asegurar que todos los recortes de pelo se retiran del sitio. </li><li> Esquema de la zona de la biopsia usando un marcador negro, colocar al animal en un cojín de calentamiento en un área quirúrgica aséptica, y cubrir con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad). Nota: Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia (el borde que se seccionó para histología, ~ 1 cm) debería correr en una dirección anterior-posterior (paralelo a la dirección de los folículos pilosos), parasagital a la línea media dorsal (Figura 1A). </li><li> Use un estéril # 11 bisturí para realizar una escisión de espesor total a lo largo del área marcada sin dañar la fascia muscular de subyacente. Nota: El tejido de piel extirpada incluye la epidermis, dermis, grasa subcutánea y panículo carnoso. El sangrado suele ser mínima. </li><li> Acoplar tse escindió muestra de piel en una toalla de papel seca, la dermis lado negativo, recortar el exceso de papel de cocina, y almacenar la muestra en PBS frío para un máximo de 1 hora si otras muestras tienen que ser recogidos. Cuando esté listo, continúe con los pasos 3.1 o 3.2 para procesar las muestras para histología, o el paso 4 para β-galactosidasa tinción de todo el montaje (LacZ). </li><li> Sutura cerrar el sitio de la biopsia usando suturas de nylon 6-0, en un patrón interrumpido sencilla espaciadas más o menos 3 mm. </li><li> No devuelva los ratones que se han sometido a una cirugía en la misma jaula como los otros animales hasta después de la recuperación completa. </li><li> Observar a los animales inmediatamente después de la cirugía hasta recuperar la conciencia, y también todos los días hasta el área quirúrgica se ha curado, por lo general dentro de 1 semana. Utilizar analgésicos de acuerdo con pautas para el cuidado y uso de animales institucionales designados si ratones muestran signos de dolor o angustia. Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía. Nota: Si es necesario, preparar la solución analgésica mediante la dilución de carprofeno (50 mg / ml de solución madre solution) 1: 100 en agua estéril. Se inyecta la solución por vía subcutánea entre los omóplatos, cerca de la piel del cuello, a una dosis de 200 l por cada 20 g de peso corporal (5 mg / kg de peso corporal del ratón). </li></ol> 3. Las muestras de proceso para Histología Nota: para fijar y procesar el tejido extirpado, utilice uno de estos métodos dependiendo de la aplicación. <ol><li> Para generar muestras histológicas embebidas en parafina, fijar la piel en el 3,7% de formalina en PBS O / N a temperatura ambiente y almacenar en un 70% de etanol durante un máximo de 2 semanas. Retire la toalla de papel antes de clavarse en parafina. </li><li> Para la generación de muestras histológicas congeladas, sumergir el tejido en frío de paraformaldehído al 4% en PBS y agitar suavemente durante 1 hora. Retire la solución y se lava la muestra con 3 cambios de PBS, más o menos 5 minutos cada uno. A continuación, sumergir la muestra en 30% de sacarosa en PBS para cryoprotect el tejido ( &quot;hundimiento sacarosa&quot;). </li><li> Incubar con agitación suave O / N a 4 ° C. Al día siguiente, retire el papel o toallaEL y recorte el exceso de tejido adiposo de la cara dérmica de la piel. Incrustar el tejido directamente en PTU y almacenar el bloque congelado a -80 ° C. Nota: Después de seccionar, ya sea de parafina o las muestras congeladas se pueden teñir mediante técnicas de inmunohistoquímica para identificar anotaciones, las células de Merkel y los nervios usando anticuerpos contra queratina 17, queratina 8 y neurofilamentos, respectivamente, como se describió previamente 5,19. </li></ol> 4. Las muestras Visualizar por Todo el montaje lacZ La tinción <ol><li> Preparar la solución de tinción X-gal. <ol><li> Combinar 0,94 g fosfato de sodio monobásico, y 2,6 g de fosfato de sodio dibásico en 250 ml de agua estéril. Ajustar el pH a 7,3. A esto, añadir 0,5 ml de cloruro de 1 M de magnesio, 0,528 g de ferrocianuro de potasio, y 0,412 g de ferricianuro de potasio. Añadir 250 ml de glicol de polietileno-octilfenılico y 125 mg de desoxicolato. La solución de base se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses en la oscuridad. </li><li> Preparar 50x acciones soluti X-galen mediante la adición de dimetilformamida a la botella de X-gal de stock para generar una solución 50 mg / ml. Almacenar esta solución a -20 ° C en la oscuridad. </li><li> Justo antes de usar, diluir la solución madre de X-gal 1:50 en solución de base X-gal para generar solución de tinción. Para biopsias más pequeños (&lt;1 cm 2), alícuotas 1-2 ml de solución de tinción por muestra. </li></ol></li><li> Fijar la muestra de piel obtenidos en la etapa 2.7 en una solución que contiene 2% de paraformaldehído / 0,2% de glutaraldehído en PBS frío durante 30 minutos, agitando suavemente en hielo. Para biopsias más pequeños (&lt;1 cm 2), utilizar 1-2 ml de solución de fijación por muestra. Nota: Como alternativa, fijar las muestras en 2-4% de paraformaldehído solamente, o sólo en glutaraldehído al 0,5%. condiciones de fijación óptima dependen del tejido, el grado de expresión de LacZ y aplicación. </li><li> Eliminar la solución de fijación, y enjuagar las muestras con 3 cambios de PBS, 5 minutos cada uno, en un agitador a temperatura ambiente. </li><li> Retire la toalla de papel debajo de la muestra y cortar exces tejido adiposo de la cara dérmica de la piel agarrando la grasa con unas pinzas romas y el recorte con las tijeras de disección. </li><li> Sumergir la muestra en solución de tinción X-gal, y se incuba a 37 ° CO / N. La expresión de LacZ será visible como una mancha azul debajo de un microscopio de disección (Figura 1B). Nota: Si la intensidad de la señal es débil, reemplace la solución de tinción al día siguiente y repetir la incubación O N /. Si la tinción de fondo es demasiado intenso, reducir el tiempo de tinción, o incubar la muestra a temperatura ambiente en lugar de 37 ° C. </li><li> Eliminar la solución de tinción y lavar las muestras en 3 cambios de PBS que contenía 3% de DMSO durante aproximadamente 5 min, agitando suavemente a TA. </li><li> muestras de lavado de 2-3 cambios de etanol al 70% durante 5 minutos cada uno. Almacenar las muestras en etanol al 70%. </li></ol> 5. La denervación quirúrgica <ol><li> Anestesiar al animal como en el paso 2.2 y afeitar toda la piel dorsal. </li><li> Preparar el área quirúrgica of la piel de la espalda usando Betadine y toallitas con alcohol, y cubrir al animal con un paño quirúrgico estéril (con fines de demostración, se omitió campo estéril para aumentar la visibilidad). Mantenga el animal caliente utilizando una almohadilla caliente mientras se opera en un área quirúrgica aséptica. </li><li> Hacer una incisión con un escalpelo estéril # 11 a lo largo de la línea media dorsal de la base del cuello a aproximadamente 0,5 cm por encima de la cola. </li><li> El uso de pinzas romas, reflejar suavemente la piel en el lado izquierdo de distancia desde el flanco de visualizar el tejido subyacente de las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello a justo por encima de la extremidad posterior. Nota: los nervios cutáneos dorsales aparecen como hebras blancas que viajan en sentido caudal a través de la fascia de la pared translúcida tronco antes de hacer curvas cerradas y entrar en el tejido conectivo suelto debajo de la piel (Figura 2). </li><li> El uso de pinzas ultrafinas con un microscopio de disección luz, quitar los nervios exclusivamente desde el lado izquierdo del ánimal situados en sitios anatómicos T3-12 Desplumando desde donde los segmentos de curva en la pared del tronco a sus sitios de entrada en la piel (Figura 2). <ol><li> Fórceps Orient verticalmente y eliminar los nervios agarrando aproximadamente 0,5 cm por debajo de sus sitios de flexión y tirando hacia arriba, haciendo que el nervio para estirar y separar del tejido circundante (Figura 2C - E). Tenga cuidado para evitar la ruptura de los vasos sanguíneos adyacentes. </li><li> Continuar hasta que se eliminen todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco a la piel. No alterar los nervios dentro de la densa fascia de la pared del tronco. Mantenga el tejido húmedo durante todo el procedimiento mediante la aplicación periódicamente gotas de solución salina estéril al 0,9%. </li><li> Como alternativa, retire los nervios sujetando sus extremos proximal cerca de la pared del tronco con unas pinzas y cortando con unas tijeras finas. Después, cortar los extremos distales cerca de la piel (Figuras 2F - H). Por último, retire el intervening segmentos de nervio (figura 2I). </li></ol></li><li> Retire cualquier nervios del colgajo de piel expuesta en el paso 5.4. Estas fibras comprenden las ramas distales de los nervios cutáneos dorsales y aparecen como blancos hebras de ramificación situados de forma esporádica dentro del tejido conectivo en el lado dérmico de la tapa de piel (figuras 2J - K). <ol><li> Para eliminar estas ramas finas, se posicionan las pinzas finas más o menos paralelos a la superficie dérmica, agarran los nervios y arrancar hacia arriba para evitar la interrupción de los vasos sanguíneos y punción de la piel. Continúe hasta que todos los nervios visibles han sido eliminados. </li></ol></li><li> Utilizando disección roma, reflejar la piel en el lado derecho de la incisión en la línea media dorsal, pero no quite los nervios. Esto servirá como el control contralateral con operación simulada. </li><li> Sutura a lo largo de la línea media dorsal en un patrón interrumpido sencilla para cerrar la incisión. Vigilar el animal durante la recuperación y post-opertivamente como se ha demostrado anteriormente (Pasos 2,8-10). Retirar las suturas dentro de 7-10 días después de la cirugía. </li><li> Para evaluar funcionalmente estables denervación hasta varias semanas después de la cirugía, eliminar el vello de la piel dorsal usando una maquinilla eléctrica. </li><li> pinchar suavemente la zona de piel denervado mediante una aguja hipodérmica, y tenga en cuenta si el animal responde, por lo general estremeciéndose o girar la cabeza. Si el área de la piel se ha denervado de forma estable, el animal exhibir poca o ninguna respuesta. </li><li> El uso de un marcador negro, delinear el área de no respuesta, así como un área de tamaño y ubicación similar en el lado contralateral sham. </li><li> Recoger las biopsias de estos sitios que en los pasos 2.1-2.9 para el análisis. Nota: Como alternativa, toda la espalda dorsal de la piel, incluyendo las regiones sin nervios y con operación simulada, se puede quitar como una sola hoja para todo el montaje de la tinción, similar a como se describe en el paso 4. </li></ol>

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<li>Lau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+deletion+in+sensory+ganglia+using+a+tamoxifen-inducible+Advillin-Cre-ERT2+recombinase+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse.</a> Mol Pain. 7, 100(2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los nervios sirven para funciones cruciales no sólo en la sensación, sino también en el desarrollo de órganos de mamíferos, mantenimiento y regeneración 13,24-27. Como nervios recientemente se han implicado en diversos trastornos de la piel, las técnicas descritas aquí se pueden utilizar para estudiar el requisito de inervación en una variedad de modelos de enfermedad animal. De hecho, la técnica de denervación unilateral permite la comparación directa de la piel, ya sea con nervios intactos o alterados desde...

En los últimos años, ha habido una apreciación cada vez mayor de la influencia de los nervios en enfermedades que normalmente no se consideran neuropatías clásicas1-4. En la piel, la evidencia experimental reciente ha sugerido que los nervios sensoriales pueden modular diversas patologías que van desde la psoriasis hasta el cáncer5-9. Esto se ha demostrado utilizando técnicas como la denervación quirúrgica y la inhibición farmacológica de la función neuronal en roedores. En el caso de la psoriasis, estos estudios han proporcionado un marco mecanicista para comprender por qué las placas psoriásicas humanas retroceden después de la pérdida de la función neuronal7,10-12.
Los nervios cutáneos también pueden afectar la expresión génica13,14 y son críticos para la mecanodetección en la piel normal15. En particular, los epitelios de cúpula táctil (TD) están formados por un parche de células epidérmicas columnares en yuxtaposición con células de Merkel neuroendocrinas inervadas por fibras nerviosas de tipo 1 (SA1) de adaptación lenta16-18. Los TD median la sensación de tacto ligero y se ha demostrado que muestran la actividad de la vía del erizo5,19. El mantenimiento de la TD depende de la inervación20,21, ya que los nervios secretan ligandos de erizo para mantener las TD normales y sus células de Merkel asociadas19. Además, la inervación promueve la formación de tumores dependientes de Hedgehog a partir de epitelios TD5. En conjunto, estos estudios refuerzan la noción de que las intrincadas interacciones moleculares que ocurren entre los nervios y las células circundantes en su nicho son cruciales para la fisiología normal de la TD, así como para la enfermedad.
Para interrogar la naturaleza de estas interacciones, describimos aquí una serie de técnicas in vivo para manipular la expresión génica en el TD, así como para recolectar biopsias de piel para la visualización de TD después del rastreo del linaje. Finalmente, describimos los procedimientos para realizar la denervación quirúrgica unilateral, en la que se extirpan los nervios de un lado de la piel dorsal del ratón, mientras se deja intacto el lado contralateral como un control interno simulado. Varias semanas después de la cirugía, se comparan la piel denervada y la piel de control simulada para evaluar los cambios que ocurren cuando se ablacionan los nervios. Aunque estas técnicas se describen en el contexto de las TD normales, el procedimiento de denervación se ha utilizado para examinar la necesidad de nervios en modelos murinos de psoriasis6, cicatrización de heridas13 y tumorigénesis5. Por último, dado que la piel es susceptible a biopsias repetidas, esto brinda la oportunidad de monitorear el destino a largo plazo de las células marcadas o de evaluar la progresión de la enfermedad en múltiples puntos de tiempo.

<table><tbody><tr><td>Almohadillas de preparación de alcohol</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed (xilacina)</td><td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, anti-queratina 8</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridoma</td><td>TROMA-I</td><td>anticuerpo de rata, uso a una concentración de 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo, anti-queratina 17</td><td>Señalización celular</td><td>#4543</td><td>anticuerpo de conejo, uso a una concentración de 1:1,000</td></tr><tr><td>Anticuerpo, anti-neurofilamento</td><td>Señalización celular</td><td>C28E10</td><td>anticuerpo de conejo, uso a una concentración de 1:500</td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación Betadine</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortapete inalámbrico recargable Recortadora</td><td>Wahl</td><td>modelo 8900</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de maíz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>uso a una concentración de 1:1.000</td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Crema Depilatoria</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilforamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pluma</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micro cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaobjetos</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Suturas de nylon</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>Octilfenil-polietilenglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro de</td> <td>potasioSigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>Disuelva en dimetilforamida para crear un caldo 50x antes de usar</td></tr></tbody></table>

la denervación quirúrgica cutánea: un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Los nervios somatosensoriales cutáneos funcionan para detectar diversos estímulos que actúan sobre la piel. Además de sus funciones sensoriales establecidas, estudios recientes han sugerido que los nervios también pueden modular los trastornos de la piel, como la dermatitis atópica, la psoriasis y el cáncer. Aquí, describimos los protocolos para probar los requisitos de los nervios en el mantenimiento de un órgano mecanosensorial cutáneo, la cúpula táctil (TD). Específicamente, discutimos métodos para el etiquetado genético, la recolección y la visualización de TDs mediante tinción de montaje completo, y para realizar la denervación quirúrgica unilateral en la piel dorsal del dorso del ratón. Juntos, estos enfoques se pueden utilizar para comparar directamente la morfología de TD y la expresión génica en piel denervada y operada simuladamente del mismo animal. Estos métodos también se pueden adaptar fácilmente para examinar el requisito de nervios en modelos de ratón de patología de la piel. Por último, la capacidad de tomar muestras repetidas de la piel brinda la oportunidad de monitorear la progresión de la enfermedad en diferentes etapas y momentos después del inicio.

Por ratones que expresan la generación de tamoxifeno inducible Gli1-CreERT2 y un alelo reportero LacZ, es posible visualizar los epitelios TD y rastrear el destino de estas células en el tiempo. Todo el procedimiento de denervación normalmente se puede completar en 1 hr por ratón y debe causar angustia mínimo para el animal. Nuestros estudios previos han indicado que los nervios son cruciales para el mantenim...

Este artículo incluye protocolos detallados para el marcaje genético de la piel del ratón, la denervación quirúrgica, la biopsia de piel y la visualización de epitelios marcados mediante tinción de β-galactosidasa de montaje completo. Estos métodos se pueden utilizar para probar el requerimiento de nervios en modelos de ratón de piel normal y patológica.

La denervación quirúrgica cutánea: Un método para probar el requisito de nervios en el ratón modelos de enfermedad de la piel

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar la influencia de los nervios en la piel normal y patológica. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en la biología de la piel normal, como si los nervios cutáneos afectan la homeostasis y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite comparar muestras de piel intacta y desinervada obtenidas del mismo animal.La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los nervios pueden ser difíciles de reconocer y extraer con daño mínimo a los tejidos circundantes. Primero, anestesie al ratón y verifique que haya alcanzado el nivel adecuado de sedación mediante una compresión del dedo del pie. Asimismo, confirme que el ratón presente respiración y latido cardíaco normales.Ahora coloque al animal sobre una almohadilla térmica en un área quirúrgica aséptica. Con una afeitadora eléctrica, retire cuidadosamente el vello del lado dorsal donde se tomará la biopsia. Luego limpie el área afeitada utilizando toallitas con Betadine y alcohol.Asegúrese de que todos los recortes de cabello se hayan eliminado del sitio. Ahora, delinee el sitio de biopsia utilizando un marcador negro. Para obtener secciones longitudinales de los folículos pilosos, el borde más largo de la biopsia debe extenderse en dirección anterior a posterior, parasetidal a la línea media dorsal.Con un escalpelo, realice una escisión de espesor completo sin dañar la fascia muscular subyacente. Habitualmente, la hemorragia es mínima. La muestra de biopsia debe incluir la epidermis, la dermis, la grasa subcutánea y el pánico carnoso.Aplane la muestra de piel extirpada sobre una toalla de papel seca, con el lado de la dermis hacia abajo. Recorte el exceso de toalla de papel y almacene la muestra en TBS frío durante hasta una hora si es necesario recolectar otras muestras. Regresando al ratón, sutúre el sitio de biopsia utilizando 60 suturas de nylon separadas aproximadamente tres milímetros entre sí.Luego, supervise al ratón en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia. Utilice analgésicos de acuerdo con las normas institucionales designadas de cuidado animal y siga sus directrices si el ratón muestra signos de malestar. Entre siete y 10 días después de la cirugía, retire los puntos de sutura.Continúe con el procesamiento de las biopsias para histología o tinción en montaje completo. Anestesie al animal, afeite toda la piel dorsal y limpie el área de manera similar al procedimiento de biopsia. A continuación, realice una incisión usando un escalpelo estéril a lo largo de la línea media dorsal, desde la base del cuello hasta aproximadamente medio centímetro por encima de la cola.Con pinzas estériles romas, retire suavemente la piel del lado izquierdo alejándola del flanco para visualizar el tejido subyacente desde las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello hasta justo por encima de la extremidad trasera. Ahora identifique el nervio cutáneo dorsal bajo un microscopio estereoscópico. Estos aparecen como haces blancos que discurren en dirección caudal a través de la fascia translúcida de la pared del tronco antes de realizar giros bruscos y penetrar en el tejido conectivo laxo situado debajo de la piel.A continuación, utilizando pinzas ultrafinas, retire el nervio exclusivamente del lado izquierdo del animal ubicado en los sitios anatómicos T3 a T12, extrayéndolos desde donde sus segmentos se doblan en la pared del tronco hasta sus puntos de entrada en la piel. Oriente las pinzas verticalmente y sujete los nervios aproximadamente medio centímetro por debajo de sus puntos de doblez. Una vez sujetos, tire hacia arriba para estirar los nervios y separarlos del tejido circundante y así extraerlos.Evite dañar los vasos sanguíneos adyacentes. Asegúrese de mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento aplicando periódicamente gotas de solución salina al 0,9%. Continúe eliminando todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco hasta la piel, pero no interrumpa los nervios dentro de la fascia densa de la pared del tronco.A continuación, retire todos los nervios del colgajo de piel expuesto. Estas fibras comprenden las ramas distales del nervio cutáneo dorsal y aparecen como filamentos blancos ramificados ubicados de forma esporádica dentro del tejido conectivo en el lado dérmico del colgajo de piel. Para eliminar estas ramas finas, coloque la pinza aproximadamente paralela a la superficie dérmica, agarre el nervio y extraiga hacia arriba.Elimine todos los nervios visibles de esta manera. No perfore los vasos sanguíneos ni la piel. Durante este paso, es importante evitar romper los vasos sanguíneos adyacentes.Si encuentra un nervio con un vaso sanguíneo adyacente, sígalo hasta una zona donde no haya un vaso adyacente y elimínelo arrancándolo. Ahora, afloje la piel en el lado derecho de la incisión en la línea media dorsal, pero no elimine ningún nervio. Esto servirá como control operatorio simulado contralateral.Finalmente, suturar al animal y monitorear postoperatoriamente como antes. Posteriormente, para confirmar la pérdida estable de los nervios, semanas después de la cirugía, pinchar suavemente el área deservada utilizando una aguja hipodérmica estéril. Observar si el animal responde, típicamente estremeciéndose o girando la cabeza.Si el área de la piel ha sido deservada de forma estable, el animal presentará poca o ninguna respuesta. Obtenga biopsias de piel del área sin respuesta y del lado contralateral simulado para obtener muestras apareadas experimentales y de control. De las biopsias, es importante tomar varias secciones histológicas para identificar posibles diferencias en la abundancia o morfología de las cúpulas táctiles entre las muestras simuladas y las deservadas.La cepa de ratón glebe one cree ERT2 permite dirigir la recombinación genética inducida por tamoxifeno a áreas de la piel que muestran una alta actividad de la vía hedgehog, como los epitelios de las cúpulas táctiles. Estos ratones se cruzaron con ratones indicadores inducibles abolaxi para visualizar los epitelios de las cúpulas táctiles. Los nódulos son cruciales para mantener tanto las cúpulas táctiles normales como sus células de Merkel asociadas.Esto se demuestra experimentalmente mediante la pérdida gradual de la morfología normal de la cúpula táctil, así como por la pérdida de células depositadas de queratina ocho tras la desinervación. Los nervios también son cruciales para promover la señalización hedgehog en la cúpula táctil, tal como se monitorea mediante la expresión de Glebe one cree ERE2 y la tinción colectiva de beta lateral en montajes de piel tanto simulada como desinervada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ablacionar quirúrgicamente los nervios cutáneos dorsales para probar si estos nervios participan en la función normal de la piel o si modulan alguna enfermedad.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse de forma rutinaria y confiable con un estrés mínimo para el animal. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos como la tinción fluorescente amino para confirmar si los nervios han sido completamente ablacionados de la piel y si la expresión génica se está viendo afectada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La lesión del nervio Salvados modelo animal es descrito aquí como un modelo de ratón del dolor neuropático periférico después de denervación parcial del nervio ciático por lesionar las ramas tibial y peroneo común del nervio, dejando el nervio sural se mantiene intacta. Modificación de la conducta resultante de la alodinia mecánica se cuantifica por filamentos de von Frey.

La lesión del nervio Salvados (SNI) Modelo de alodinia mecánica inducida en ratones

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Prueba de la función nerviosa sensorial en un modelo de ratón denervado quirúrgicamente

El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético. El modelo de protocolo quirúrgico se describe y se demuestra en C57Black6 ratones.

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Aprende la denervación quirúrgica cutánea en ratones para estudiar el papel de los nervios en la homeostasis y patología de la piel. Este método permite comparar muestras intactas y denervadas del mismo animal.

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