Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el Pseudomonas aeruginosa

El objetivo general de este procedimiento es identificar pequeñas moléculas que modulen los niveles intracelulares del segundo mensajero cíclico-di-GMP en el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa mediante un cribado bio-reportero de alto rendimiento. Este método puede ayudar a descubrir pequeñas moléculas que interfieren con la bioinformación de Pseudomonas aeruginosa y otras partículas mediante modulación cíclica de di-GMP. La principal ventaja de esta técnica es que es muy robusta y versátil, lo que permite el cribado de más de 3.500 compuestos en 48 horas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de nuevas terapias que potencialmente sensibilizen a Pseudomonas aeruginosa, al sistema inmune o a los antibióticos existentes, ejerciendo una presión menor y selectiva sobre las bacterias. Inocular cinco milímetros de caldo de lisogén, o medio LB, con una sola colonia de P. aeruginosa, a siete grados centígrados, con agitación a 200 rpm. Luego, transfiera dos mililitros del cultivo durante la noche a 200 mililitros de medio LB fresco en un matraz de un litro e incube a 37 grados centígrados con agitación a 200 rpm.

Controle la densidad óptica a 600 nanómetros o DO 600, cada 30 minutos tomando una muestra de 1 mililitro del matraz y examinándola con un espectrofotómetro. Cuando el diámetro exterior de 600 alcance entre 0,3 y 0,5, coloque 40 mililitros del cultivo en un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros. Granular las celdas centrifugando a 8000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 40 mililitros de solución estéril helada de sacarosa de 300 milimolares. Después de centrifugar las células por segunda vez, vuelva a suspender en 20 mililitros de solución estéril helada de sacarosa de 300 milimolares Centrifugue las células nuevamente y vuelva a suspender en 400 microlitros de la solución de sacarosa de 300 milimolares. Enfríe las celdas en hielo durante 30 minutos, después de lo cual estarán listas para la electroporación.

A continuación, agregue un microlitro de una solución de 0,2 microgramos por microlitro de plásmido que codifica el promotor CdrA al gen que codifica la proteína verde fluorescente a 40 microlitros de las células electrocompetentes P. Aeruginosa preparadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que se ha enfriado previamente en hielo. Mezcle la suspensión y transfiérala a una cubeta de electroporación preenfriada de 2 milímetros con espacio entre electrodos. Elimine la humedad del exterior de la cubeta con papel de seda y coloque la cubeta en la cámara de muestras del electroporador.

Pulse la solución con un voltaje de 2,5 kilovoltios, capacitantes de 25 microfaradios y una resistencia de 200 ohmios. Retire la cubeta y agregue un mililitro de LB medium. A continuación, transfiera las células a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros e incube durante dos horas a 37 grados centígrados con agitación a 200 rpm.

Después de la incubación, esparcir alícuotas de 10 microlitros, 50 microlitros y 100 microlitros del cultivo en placas estériles de agar LB suministradas con ampicilina e incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Confirme la expresión de GFP examinando la placa bajo un microscopio de fluorescencia con un canal GFP estándar. Escoge una sola colonia e inocula en cinco mililitros de LB. Después de la incubación durante la noche, mezcle 0,5 mililitros del cultivo nocturno con 0,5 mililitros de glicerol al 50% en un tubo de rosca de 2 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados.

Dos días antes de la cribado, coloque la cepa de P. aeruginosa preparada del caldo a menos 80 grados centígrados en una placa de agar LB esparciendo suavemente las bacterias sobre la placa utilizando un circuito de inoculación estéril. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. La noche anterior a la proyección, inocule una sola colonia de P. aeruginosa de la placa en 10 mililitros de medio LB en un tubo.

Incubar el precultivo durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 200 rpm. El día de la cribado, prepare un subcultivo a partir del precultivo nocturno diluyéndolo primero con medio LB fresco hasta un OD 600 de 1,0 y, a continuación, diluyendo aún más con un 5%LB hasta un DO 600 de 04. Agregue una barra de agitación magnética estéril en el recipiente y agite el cultivo a velocidad mínima en un agitador magnético durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Esto permite que las bacterias se aclimaten a los medios antes de que se dispensen en placas de 384 pocillos. Para preparar el control positivo, agregue 20 microlitros de Sulfato de Tobramicina a 10 mililitros del subcultivo preparado y mezcle suavemente. Pipetear 40 microlitros del cultivo de control positivo en los pocillos A23 a P23.

Para preparar el control negativo, agregue 30 microlitros de dimetilsulfóxido a 10 mililitros del subcultivo preparado y mezcle suavemente. Pipetear 40 microlitros del cultivo de control negativo en los pocillos A24 a P24. Para cada una de las placas humedecidas con las moléculas pequeñas, inocular un volumen de 40 microlitros de los cultivos diluidos durante la noche en los pocillos A1 a P22.

Selle las placas con una cubierta permeable al aire, selle e incube durante seis horas a 37 grados centígrados. Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados para evitar la condensación. Retire suavemente el sello de la cubierta permeable al aire de la placa antes de leer.

A continuación, mida la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos. Antes de medir la fluorescencia, realice un ajuste automático de ganancia y focal basado en el pozo de control negativo A24 y establezca el valor objetivo de ganancia en 75%Seleccione el ajuste de enfoque y el canal A a la derecha de la ventana. Mida la fluorescencia del indicador GFP a una excitación máxima de 485 nanómetros y una emisión máxima de 520 nanómetros con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos.

Recopile datos de todas las placas examinadas. Las lecturas de datos se guardan automáticamente de forma predeterminada mediante el software de control del lector de placas. Para analizar los datos, vea las lecturas haciendo clic en el icono de Marte dentro del software de control para abrir el paquete de análisis estadístico.

Recupere los datos haciendo doble clic en el número de placa de interés para acceder a los datos para su análisis. Evalúe la uniformidad y la reproducibilidad del ensayo mediante un análisis sólido de números primos Z. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento y evalúe el porcentaje de inhibición del nivel intracelular de c-di-GMP como se detalla en el protocolo de texto.

Esta figura describe los datos brutos representativos para OD 600 y GFP de la pantalla de alto rendimiento. Se ha aplicado a los valores del pozo un mapa de calor de gradiente de color con colores calientes a fríos que indican valores bajos a altos. Los datos generados se analizan para determinar el porcentaje de inhibición y se representan aquí para las lecturas OD 600 y GFP.

Las moléculas pequeñas que potencialmente inhiben el crecimiento y el c-di-GMP intracelular tenderán a estar en verde, mientras que las moléculas pequeñas que potencialmente promueven el crecimiento y los niveles intracelulares de c-di-GMP tenderán a estar en rojo. Se utilizan diagramas de dispersión para comparar el porcentaje de inhibición obtenido de cada molécula pequeña probada. Cada molécula pequeña está representada por un pequeño punto y se muestra la distribución porcentual de inhibición para cada una de las lecturas de OD 600 y GFP.

Se selecciona un límite de más o menos 50% para la identificación de aciertos. Los posibles éxitos se resaltan en rojo. Se llevan a cabo ensayos de dosis-respuesta en cada compuesto interesante.

Aquí, se prueban dos compuestos identificados en un ensayo de dosis-respuesta de 10 puntos con una concentración máxima de dos milimolares y una serie de dilución doble. Al ajustar una función logística de cuatro parámetros a los datos, se obtuvieron valores de concentración inhibitoria semimáxima para cada compuesto de 158 micromolares y 193 micromolares. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para cribar más de 3.500 compuestos en 48 horas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar de manera robusta Pseudomonas aeruginosa compuestos que interfieren con la señalización cíclica de di-GMP. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones de detección deben ser comparables cuando se realicen pruebas de detección durante varios días. Después de una pantalla de un solo punto, la ejecución de una pantalla de respuesta de dirsk utilizando el mismo protocolo puede validar las visitas.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores identifiquen posibles moléculas pequeñas que interfieren con la información básica de Pseudomonas aeruginosa y la resistencia a los antibióticos. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para ser utilizada por cualquier bacteria de interés y se puede modificar para examinar otros resultados o entradas, como el impacto en la viabilidad bacteriana. Por último, no olvide que trabajar con Pseudomonas aeruginosa puede ser peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.