Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el

El objetivo general de este procedimiento es identificar moléculas pequeñas que modulen los niveles intracelulares del segundo mensajero ciclodiguano monofosfato cíclico (c-di-GMP) en el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, mediante una pantalla de bioindicador de alto rendimiento. Este método puede ayudar a descubrir moléculas pequeñas que interfieran con la bioformación de Pseudomonas aeruginosa y otras partículas mediante la modulación del c-di-GMP. La principal ventaja de esta técnica es que es muy robusta y versátil, permitiendo la evaluación de más de 3.500 compuestos en un período de 48 horas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de nuevas terapias que potencialmente sensibilicen a Pseudomonas aeruginosa frente al sistema inmunitario o frente a antibióticos existentes, ejerciendo al mismo tiempo una presión selectiva menor sobre la bacteria. Inocular cinco mililitros de caldo lisogénico, o medio LB, con una colonia individual de P. aeruginosa, a siete grados Celsius, con agitación a 200 rpm. A continuación, transferir dos mililitros de la cultura nocturna a 200 mililitros de medio LB fresco en un matraz de un litro, e incubar a 37 grados Celsius con agitación a 200 rpm.

Monitore la densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600 cada 30 minutos tomando una muestra de 1 mililitro del matraz y analizándola mediante un espectrofotómetro. Cuando el OD 600 alcance entre 0,3 y 0,5, coloque 40 mililitros del cultivo en un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros. Pelote las células centrifugando a 8000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 40 mililitros de solución estéril de sacarosa al 300 milimolar fría con hielo. Después de centrifugar las células por segunda vez, resuspenda en 20 mililitros de solución estéril de sacarosa al 300 milimolar fría con hielo. Vuelva a centrifugar las células y resuspenda en 400 microlitros de la solución de sacarosa al 300 milimolar. Enfríe las células en hielo durante 30 minutos, tras lo cual estarán listas para la electroforesis.

A continuación, agregue un microlitro de una solución de 0,2 microgramos por microlitro de plásmido que codifica el promotor CdrA junto con el gen que codifica la proteína verde fluorescente a 40 microlitros de células electrocompetentes de P. aeruginosa preparadas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros previamente enfriado en hielo. Mezcle la suspensión y transfiera la mezcla a una cubeta de electroforesis con una separación de electrodos de 2 milímetros previamente enfriada. Retire la humedad de la superficie externa de la cubeta con papel absorbente y coloque la cubeta en la cámara de muestra del electroforador.

Someta la solución a un impulso eléctrico con un voltaje de 2,5 kilovoltios, capacitancia de 25 microfaradios y una resistencia de 200 ohmios. Retire la cubeta y agregue un mililitro de medio LB. Luego, transfiera las células a un tubo microcentrífugo estéril de 1,5 mililitros e incube durante dos horas a 37 grados Celsius con agitación a 200 rpm.

Después de la incubación, distribuya alícuotas de 10 microlitros, 50 microlitros y 100 microlitros del cultivo sobre placas de agar LB estériles suplementadas con ampicilina e incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche. Confirme la expresión de GFP examinando la placa bajo un microscopio de fluorescencia con un canal estándar para GFP. Seleccione una colonia individual e inocúlela en cinco mililitros de LB. Después de la incubación nocturna, mezcle 0,5 mililitros del cultivo nocturno con 0,5 mililitros de glicerol al 50 % en un tubo de rosca de 2 mililitros y almacénelo a menos 80 grados Celsius.

Dos días antes del ensayo, siembre la cepa preparada de P.aeruginosa del stock a menos 80 grados Celsius en una placa de agar LB, distribuyendo suavemente las bacterias sobre la placa utilizando un asa de inoculación estéril. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius. La tarde anterior al ensayo, inocule una colonia individual de P.aeruginosa de la placa en 10 mililitros de medio LB en un tubo.

Incube la precultura durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 200 rpm. El día del ensayo, prepare una subcultura a partir de la precultura nocturna diluyéndola primero con medio LB fresco hasta una DO 600 de 1,0, y luego diluya adicionalmente con LB al 5 % hasta una DO 600 de 0,4. Añada una barra magnética estéril al recipiente y agite la cultivo a velocidad mínima en un agitador magnético durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Esto permite que las bacterias se aclimaten al medio antes de ser dispensadas en placas de 384 pozos. Para preparar el control positivo, agregue 20 microlitros de Sulfato de Tobramicina a 10 mililitros de la subcultivo preparado y mezcle suavemente. Pipetee 40 microlitros de la cultura del control positivo en los pozos A23 a P23.

Para preparar el control negativo, agregue 30 microlitros de dimetilsulfóxido a 10 mililitros de la subcultivo preparado y mezcle suavemente. Pipetee 40 microlitros de la cultura control negativo en los pocillos A24 hasta P24. Para cada una de las placas tratadas con las moléculas pequeñas, inocule un volumen de 40 microlitros de las cultivos nocturnos diluidos en los pocillos A1 hasta P22.

Selle las placas con un sello de cubierta permeable al aire e incúbelas durante seis horas a 37 grados Celsius. Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, precaliente el lector de placas a 37 grados Celsius para evitar la condensación. Retire suavemente el sello de cubierta permeable al aire de la placa antes de la lectura.

Luego, mida la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos. Antes de medir la fluorescencia, realice un ajuste automático de ganancia y enfoque basado en el pocillo de control negativo A24 y establezca el valor objetivo de ganancia en 75 %. Seleccione el ajuste de enfoque y el canal A en el lado derecho de la ventana. Mida la fluorescencia del reportero GFP con un máximo de excitación de 485 nanómetros y un máximo de emisión de 520 nanómetros, con un ajuste de 10 destellos por pocillo y un tiempo de estabilización de 0,2 segundos.

Recopile datos de todas las placas examinadas. Las lecturas de datos se guardan automáticamente por defecto mediante el software de control del lector de placas. Para analizar los datos, visualice las lecturas haciendo clic en el ícono de Marte dentro del software de control para abrir el paquete de análisis estadístico.

Recupere los datos haciendo doble clic en el número de placa de interés para acceder a los datos para su análisis. Evalúe la uniformidad y la reproducibilidad del ensayo mediante un análisis robusto del valor Z primo. Luego, calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento y evalúe el porcentaje de inhibición del nivel intracelular de c-di-GMP según se detalla en el protocolo del texto.

Esta figura describe datos brutos representativos de OD 600 y GFP provenientes del cribado de alto rendimiento. Se ha aplicado un mapa de calor con un gradiente de color, donde los tonos cálidos a fríos indican valores bajos a altos, a los valores de cada pocillo. Los datos generados se analizaron en términos del porcentaje de inhibición y se representan aquí tanto para las lecturas de OD 600 como de GFP.

Las moléculas pequeñas que potencialmente inhiben el crecimiento y los niveles intracelulares de c-di-GMP tienden a aparecer en color verde, mientras que las moléculas pequeñas que potencialmente promueven el crecimiento y los niveles intracelulares de c-di-GMP tienden a aparecer en rojo. Se utilizan gráficos de dispersión para comparar el porcentaje de inhibición obtenido de cada molécula pequeña ensayada. Cada molécula pequeña está representada por un punto pequeño, y se muestra la distribución del porcentaje de inhibición para cada una de las lecturas de DO 600 y GFP.

Se selecciona un corte de más o menos el 50 % para la identificación de resultados positivos. Los posibles resultados positivos se resaltan en rojo. Se realizan ensayos de respuesta frente a dosis en cada compuesto interesante.

Aquí, se evaluaron dos compuestos identificados en un ensayo de respuesta a la dosis de 10 puntos con una concentración máxima de dos milimolares y una serie de diluciones de dos veces. El ajuste de una función logística de cuatro parámetros a los datos arrojó valores de concentración inhibitoria media para cada compuesto de 158 micromolares y 193 micromolares. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para analizar más de 3.500 compuestos en menos de 48 horas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar de manera robusta un cribado de Pseudomonas aeruginosa para identificar compuestos que interfieran en la señalización de di-GMP cíclico. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las condiciones de cribado comparables cuando se realice el ensayo durante varios días. Tras un cribado de punto único, llevar a cabo un ensayo de respuesta en placa utilizando el mismo protocolo puede validar los resultados positivos.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores identifiquen posibles moléculas pequeñas que interfieran con la formación de biopelículas y la resistencia a antibióticos de Pseudomonas aeruginosa. Es importante destacar que esta técnica puede adaptarse para utilizarse con cualquier bacteria de interés y puede modificarse para examinar otras entradas o salidas, como el impacto en la viabilidad bacteriana. Por último, no olvide que trabajar con Pseudomonas aeruginosa puede ser peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.