Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Este método puede responder a preguntas sobre la interacción huésped-patógeno y el descubrimiento de fármacos, como la importancia de varios factores de virulencia y la capacidad de las moléculas pequeñas para mejorar con la génesis. La principal ventaja de esta técnica es que se realiza en formato líquido con pequeños volúmenes. Para empezar, mientras trabaja dentro de un gabinete de bioseguridad BSL 2, raye P.aeruginosa de un caldo congelado en una placa de agar LB.

Incube la placa a 37 grados C durante 16 a 24 horas, luego almacene la placa a cuatro grados Celsius hasta por una semana. Dos días antes de colocar las placas de ensayo, use una sola colonia de la placa para inocular de tres a cinco mililitros de caldo LB estéril. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas.

Después de preparar el medio de muerte lenta o SK de acuerdo con el protocolo de texto, con 350 mililitros de p. Aeruginosa del cultivo LB fresco durante la noche, siembre cada placa de SK de 10 centímetros. Use un esparcidor de bacterias estéril para esparcir uniformemente las bacterias y permita que las placas se sequen en el gabinete de bioseguridad.

Luego, incuba las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para probar múltiples cepas bacterianas de ARNi en paralelo en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos de profundidad, inocule una sola colonia de cada clon de bacterias que contengan ARNi previamente preparado en cuatro mililitros de LB suplementado con carbenicilina. Coloque las placas en una incubadora agitadora optimizada para placas de varios pocillos a 37 grados Celsius y 950 rpm durante 16 horas, luego recoja las bacterias por centrifugación a 2.000 g durante 5 minutos. Decantar el sobrenadante invirtiendo la placa y agitándola vigorosamente.

Usando 100 microlitros de S Basal resuspender las bacterias RNAi. Pipetear las bacterias resuspendidas en un número adecuado de pocillos de una placa NGM multipocillo suplementada con IPTG y carbenicilina y dejar que la placa se seque. Después de preparar gusanos L1 de acuerdo con el protocolo de texto, prepare las placas para experimentos básicos pipeteando aproximadamente 5.000 gusanos por placa de 10 centímetros, sembrados con ARNi o superalimento OP50.

Para configurar una pantalla de ARNi, pipetee aproximadamente 300 lombrices por pocillo en una placa de 24 pocillos sembrada con ARNi. Si la cepa que se utiliza es estéril a temperatura, incube los gusanos a 15 grados centígrados durante aproximadamente 16 horas y luego transfiéralos a 25 grados centígrados durante 44 horas para completar el desarrollo y evitar la embriogénesis. Para llevar a cabo un ensayo de eliminación de líquidos, utilice un raspador de células para eliminar la P. aeruginosa de una placa SK y resuspender las bacterias en aproximadamente 5 mililitros de S. Basal.

Con un espectrofotómetro, mida el diámetro exterior 600 de la suspensión bacteriana. Prepare 24 mililitros de caldo diluido de P. Aeruginosa en S. Basal a un diámetro exterior de 600 igual a 09, luego agregue 21 mililitros de medio SK líquido y, con una pipeta multicanal, transfiera 45 microlitros de bacterias y medios a cada pocillo de una placa de 384 pocillos. Lave las lombrices desde su origen en un tubo cónico de 50 mililitros y deje que se asienten bajo la fuerza gravitatoria.

Aspire el sobrenadante a 5 mililitros, luego use un total de 50 mililitros de S.Basal para resuspender los gusanos y repita el lavado dos veces más. Usando un clasificador de gusanos, clasifique aproximadamente 22 gusanos en cada pocillo de una placa de 384 pocillos, de acuerdo con el protocolo de texto, luego use una película permeable al gas para sellar la placa e incubarla a 25 grados Celsius durante 24 a 48 horas. En el momento deseado, use una lavadora de microplacas y S.Basal para lavar la placa de 384 pocillos un total de 5 veces.

Uno de los errores más fáciles de cometer es aspirar la placa de 384 pocillos antes de que los gusanos se hayan asentado por completo. Se necesita práctica para ver con precisión si los gusanos se han asentado por completo. Después del lavado final, aspirar el sobrenadante hasta 20 microlitros.

A continuación, añada 50 microlitros de tinción de ácido nucleico de 98 micromolares por pocillo, para una concentración final de 0,7 micromolares. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 12 a 16 horas. Después del período de incubación deseado, use la lavadora de microplacas para lavar las placas un mínimo de tres veces.

Para la adquisición de datos, utilice un espectrofotómetro o un microscopio automatizado para obtener imágenes de la luz transmitida y la fluorescencia. Agregue un mililitro de S Basal por pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 300 gusanos por pocillo. Agite suavemente las lombrices agitando la placa, luego transfiera las lombrices a una placa vacía y estéril de 24 pocillos profundos.

Deje que los gusanos se asienten gravitacionalmente, unos cinco minutos. Aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro por pocillo, luego agregar 7 mililitros de S Basal a cada pocillo. Repita el lavado dos veces más, y luego, después del lavado final, aspire todo menos aproximadamente 400 microlitros de sobrenadante.

Después de pipetear las bacterias en placas de 384 pocillos para evitar la inanición, utilizando la función de remuestreador del clasificador de lombrices, clasifique 22 lombrices en cada pocillo de una placa de 384 pocillos. Finalmente, después de la clasificación, agregue moléculas pequeñas u otros materiales específicos del experimento. Como se ilustra en este gráfico, cuando se siguen los pasos descritos en este video, se observará una matanza dependiente del tiempo de C. elegans solo en presencia de P. aeruginosa.

Por el contrario, en ausencia de suplementos nutricionales bacterianos clave, se observará poca o ninguna muerte. Como se muestra aquí, la incubación de dos pasos de P. aeruginosa a 37 grados Celsius y luego a 25 grados Celsius, que es crítica para los ensayos convencionales de muerte lenta, y que se implementó originalmente en la matanza líquida, es prescindible en este ensayo. El protocolo tolera una amplia gama de concentraciones bacterianas iniciales, desde tan solo un OD 600 igual a 0025, y aún exhibe una muerte dependiente del tiempo y la concentración, aunque el momento cambia.

Además, tan solo cuatro pozos suelen ser suficientes para obtener datos estadísticamente significativos. Aquí se muestra un ejemplo de la utilidad del procesamiento cuando la relación señal-ruido es alta, como en este ejemplo, el análisis es simple y discriminar entre condiciones positivas y negativas es trivial. En estos casos, incluso los golpes débiles se pueden identificar fácilmente.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 60 a 75 minutos de tiempo de mano por placa de 384 pocillos, sin incluir la clasificación. Al intentar este procedimiento, es fundamental recordar que debe agregar todos los componentes a sus medios o la virulencia se verá comprometida. Este ensayo simplifica la aplicación del cribado basado en el fenotipo de todo el organismo al descubrimiento de fármacos en la investigación de patógenos huéspedes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar ensayos de patogénesis de C. elegans a base de líquidos. Este procedimiento puede modificarse sustituyendo con otros patógenos, como E.Faecalis por P.Aeruginosa, facilitando la búsqueda de tratamientos para otras infecciones bacterianas. No olvides que trabajar con bacterias infecciosas como P.Aeruginosa o E.Faecalis puede ser peligroso.

Siempre se deben tomar las precauciones adecuadas, como la capacitación adecuada, un buen equipo de protección personal y la técnica adecuada, al realizar este procedimiento.