Name: Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a aislar polisomas y monosomas de tejidos vegetales para identificar ARNm activamente traducidos en Arabidopsis thaliana. Este método permite estudiar la regulación de la traducción en plantas.

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Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Investigación (ANR-14-CE02-0010). Se agradece al Dr. Benjamin campo y el Dr. Elodie Lanet para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos al Sr. Michel Terese por su ayuda con la edición de vídeo.

1. Preparación de 20 a 50% (p / v) de sacarosa gradientes Nota: Los gradientes son de 4 capas de sacarosa (50%, 35% y el 2 capas de 20%) en un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml. En nuestra experiencia, el vertido de la sacarosa al 20% en dos capas separadas mejora en gran medida la calidad de las preparaciones polisomas. <ol><li> Preparar las soluciones madre. Asegúrese de que todas las soluciones son de RNAsa y DNAsa. <ol><li> Preparar 10X Solución Salina: mM Tris-HCl pH 8,4 400, KCl 200 mM y MgCl 100 mM 2. </li><li> Preparar la solución 2 M de sacarosa: Por 200 ml, se disuelven 137 g de sacarosa en 1X solución salina. </li></ol></li><li> Diluir la solución de sacarosa en Salt Solution, como se describe en la Tabla 1, para preparar los gradientes. Los volúmenes indicados se refieren a seis gradientes. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> La concentración de sacarosa final </td><td> sacarosa 2M (ml) </td><td> La solución salina que 1X (ml) </td><td> Vol Final. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las diluciones de la solución de sacarosa para preparar seis gradientes. <ol start="3"><li> Verter las capas según la Tabla 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> capa de sacarosa </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Volumen de la solución de sacarosa por capa. <ol start="4"><li> Después de verter cada capa, mantener los tubos en un -40 ° C o -80 ° C congelador hasta congelación completa antes de añadir la siguiente capa de sacarosa. La congelación se consigue normalmente después de 2 horas a -40 ° C, pero esperando sobre 6 hr antes de verter la siguiente capa se recomienda. La última capa 20% se puede congelar o añadido recientemente en el día del experimento. Nota: Congelación cada capa antes de añadir el siguiente impide cualquier mezcla o perturbación de las capas. Los gradientes se pueden mantener en un -40 ° C o -80 ° C congelador durante al menos seis meses. </li><li> Si ya no se ha hecho, añadir la última capa 20% a los gradientes en el día del experimento. A continuación, dejar que los gradientes se descongelan en una habitación fría o una nevera. </li></ol> 2. Preparación de extractos citosólicos Nota: Se recomterminar utilizando dos gradientes por muestra biológica. 300 mg es la cantidad óptima de material vegetal para preparar dos gradientes cuando se trabaja con 6 días plántulas de Arabidopsis thaliana. Cuando se trabaja con tejidos menos translationally activos, la cantidad de material de la planta se puede incrementar hasta 600 mg. <ol><li> Cosecha de seis días de edad plántulas cultivadas en ½ Murashige y Skoog 8 medio suplementado con 1% de sacarosa o medios equivalentes por congelación rápida en nitrógeno líquido </li><li> material vegetal molido en un mortero y una maja previamente enfriada con nitrógeno líquido. </li><li> Pesar 300 mg de material en polvo en un plato de pesada previamente enfriado. Realice este paso rápidamente para evitar la descongelación de la muestra. Nota: Mantenga las muestras congeladas por no más de una semana en un congelador a -80 °. </li><li> Añadir 2,4 ml de tampón de polisomas preenfriada (sal Solución 4X, EGTA 5,26 mM, 0,5% (v / v) octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol, ramificados, 50 ìg.mL -1 cicloheximida, 50 ìg.mL 1cloranfenicol) y homogeneizar mediante la mezcla con la punta de la pipeta. Transferir 1,5 ml en dos tubos. Trabajar con rapidez para evitar que las muestras de calentamiento. </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C en una microcentrífuga para sedimentar los desechos. Nota: Para evitar la degradación del ARN, mantener siempre las muestras a 4 ° C, utilizar las soluciones y de trabajo libre de RNasa / DNasa en RNasa / DNasa condiciones libres. La heparina puede ser añadido a la memoria intermedia de polisomas, a una concentración final de 300 ìg.mL -1, para mejorar la protección de ARN. Sin embargo, ya que la heparina puede interferir con análisis de aguas abajo, que tendrá que ser retirado durante la etapa de precipitación del ARN mediante la realización de la precipitación de cloruro de litio en lugar de la precipitación con etanol (cf. nota 4,7). </li></ol> 3. Perfiles de polisomas <ol><li> Con cuidado la pipeta el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Si los fragmentos de plantas han sido con pipeta, repita el paso 2.5. Cargar el sobrenadante en la parte superior del gradiente por pipettin suavementeg sobre la pared lateral del tubo en una corriente constante. Utilice uno de gradiente para cada tubo de 1,5 ml. </li><li> Transferencia a preenfriado cubos y se centrifuga a 175.000 xg durante 2 hr 45 min a 4 ° C, en una ultracentrífuga (por ejemplo 32.000 rpm utilizando un rotor SW41). </li><li> Configurar el sistema de recolección de gradiente tal como se describe en la Figura 1. La cubeta UV tiene una longitud de trayectoria de 1 mm. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Figura 1. sistema de recogida de gradiente. La cubeta UV está conectado mediante un tubo de cloruro de polivinilo a un tubo capilar de vidrio que desciende hasta el fondo del gradiente. El gradiente avanza en el sistema gracias a una bomba peristáltica. DO 260 es leído de forma continua y se recogen fracciones de 2 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>esta figura. <ol start="4"><li> Ajuste el colector de muestras hasta la temperatura ambiente, y establecer el carrusel a una velocidad que permita la recogida de fracciones de 2 ml. Use tubos pre-enfriado de recogida. </li><li> Reunir las fracciones de abajo hacia arriba usando un tubo capilar de vidrio conectada mediante un tubo de cloruro de polivinilo al sistema de recolección de gradiente. Utilizar una película de parafina de plástico para asegurar la conexión entre el tubo de cloruro de polivinilo y el tubo capilar de vidrio. </li><li> Leer la absorbancia a 260 nm de la parte inferior a la parte superior del gradiente. Cuando se recoge todo el degradado, colocar los tubos de recogida en el hielo antes de la extracción de RNA. </li></ol> 4. La extracción de RNA <ol><li> Reunir las fracciones recogidas a partir de dos gradientes, en tapón de 50 ml tubos de centrífuga, como sigue: Polisomas: fracciones 1 a 3 (12 ml) Monosomas: fracción 4 (4 ml) De sobrenadante: fracciones 5 y 6 (8 ml) </li><li> Para cada fracción, se añade 1 vol. hidrocloruro de guanidina 8M,50 g de soporte acrílicas y de 1,5 vol. isopropanol. Nota: portador Acryl es acrilamida lineal, que se utiliza como un coprecipitante de mejorar la recuperación de ácidos nucleicos durante la precipitación de alcohol. </li><li> Mezclar invirtiendo los tubos y precipitar O / N a -20 ° C. </li><li> Centrifugar a 175.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, en una ultracentrífuga (32.000 rpm en un rotor SW32). Si la etapa de precipitación se lleva a cabo en un tubo que no es compatible con la ultracentrifugación, transferir a un tubo adecuado. </li><li> Desechar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 l de tampón TE libre de ARNasa (Tris-HCl 10 mM pH 7,5 a 1 mM de EDTA). Transferir a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Extracto de ARN mediante la adición de 1 vol. fenol saturado de agua (pH 6,6) y 1 vol. cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1). Mezclar vigorosamente. Centrifugar a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 ml. Nota: fenol ácido (pH 4.5) se puede utilizar con el fin de minimizar la contaminación de ADN. </li><li>Precipitar el ARN mediante la adición de un décimo vol. acetato de sodio 3 M y 3 vol. 100% de etanol. Permitir la precipitación a -80 ° C durante 20 minutos o O / N a -20 ° C. Centrifugar a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Nota: Si se utiliza heparina en el tampón de polisomas (véase la nota 2.5), realizar una precipitación de cloruro de litio (LiCl) en lugar de la precipitación con etanol para eliminar adecuadamente cualquier rastro de heparina que pueda interferir con el análisis de aguas abajo 9. Después de la extracción, añadir LiCl a una concentración final de 2,5 M. permitir la precipitación durante 30 min a -20 ° C o O / N a 4 ° C. Centrifugar a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar el precipitado con 500 l 75% de etanol. Deje secar al aire el precipitado y se disuelve en 30 l de tampón TE. Evaluar la calidad del RNA por electroforesis en un gel de agarosa libre de 1,2% de ARNasa (100 V, 15 min) o por métodos de electroforesis capilar. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Exportar datos en bruto a un software gráfico y análisis de datos. Nota: Como se muestra en la Figura 2A y B, los perfiles primas dan información cualitativa: el número de picos polisomas que se puede ver, la altura del pico de monosome, y la presencia de un hombro correspondiente a las subunidades de ribosomas libres. </li><li> Combinar perfiles para permitir la comparación de los perfiles entre las muestras. Utilice la herramienta de lector de pantalla para determinar el valor X del pico monosome para cada muestra y alinear los picos monosome mediante la eliminación de puntos de datos adicionales en el inicio de las curvas. Identificar el punto más bajo de la curva y determinar su valor de Y (con la función de lector de pantalla). Establecer el valor de Y punto más bajo a 0 mediante el uso de la función &quot;valor de columnas del conjunto&quot;. </li><li> Determine la relación polisomas / monosomas integrando el área bajo la curva a partir de perfiles en bruto (Figura 3C). Utilice la herramienta de selección de datos para definir la frontera de la zona a integrarse. A continuación, utilice la función de integrar (Análisis-Matemáticas). </li><li> Normalizarlas curvas a la cima monosome dividiendo todos los puntos de datos de una curva por el valor Y de la cumbre del pico monosome (determinaron utilizando la herramienta de lector de pantalla). Seleccione la columna, a continuación, en Análisis-Matemáticas, seleccione Normalizar y elegir las &quot;dividido por un valor especificado&quot; métodos. Este paso permite la comparación del nivel relativo de polisomas (Figura 3D). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Figura 2. Perfiles de polisomas representativos. Arabidopsis thaliana de tipo silvestre (wt, ecotipo Col-0) y plántulas mutantes se cultivaron durante seis días en ½ Murashige y Skoog bajo fotoperiodos el día (16 horas de luz, 8 horas de oscuridad). R: perfiles de polisomas primas procedentes de las plantas de semillero en peso. B: Los perfiles de polisomas primas de plántulas mutantes. C: Determinación del porcentaje de polisomas y monosomas por integración de la área bajo la curva D: Profi polisomasles normalizó al pico monosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El protocolo que presentamos aquí es un método fácil y económico para generar perfiles de polisomas y aislar ARNm asociados a polisomas, ribosomas individuales o libres de ribosomas. En la literatura se describe una amplia gama de diferentes métodos de fraccionamiento de polisomas. El método que hemos descrito aquí se ha optimizado para mantener solo los compuestos necesarios y se ha adaptado para material vegetal. En particular, redujimos la cantidad de detergente11 y agregamos cloranfenicol al tampón para fi...

La síntesis de proteínas es un proceso esencial y energéticamente costoso en todas las células 1. En primer lugar, las células deben invertir energía en la producción de la maquinaria de traducción, los ribosomas. Por ejemplo, una célula de levadura dividiendo activamente produce tanto como 2000 ribosomas por minuto. Una producción de este tipo requiere de hasta 60% de la actividad transcripcional total y hasta 90% de la actividad total de empalme de la célula 2. Además, se requiere energía para la síntesis de aminoácidos, aminoacil-tRNA y enlaces peptídicos. En las plantas, la adición de un aminoácido a un costos de la cadena de péptido de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP 3. Por lo tanto, no es sorprendente que la traducción de ARNm de la proteína es un sitio importante de la regulación, en particular cuando se trata de lidiar con el cambio de las condiciones ambientales. La etapa de iniciación de la traducción, que es la asociación de un ARNm con el ribosoma, es el principal objetivo de la regulación deTraducción 4. Como consecuencia de la regulación de la traducción, así como otras medidas de regulación post-transcripcional, sólo el 40% de las variaciones en la concentración de proteína se puede explicar por la abundancia de ARNm 5,6. Por lo tanto, el estudio de ARNm total de da relativamente pobre información sobre la abundancia de proteínas. Por otra parte, la asociación de ARNm con ribosomas da una mejor penetración en la abundancia de proteínas, dando acceso a esos mRNAs implicados en la traducción. mRNAs traducidos de forma activa se asocian con varios ribosomas en estructuras llamadas polisomas. Por el contrario, los ARNm mal traducidas estarán asociadas con un solo ribosoma (monosome). En consecuencia, el estado de la traducción de un ARNm puede ser evaluada mediante el control de su asociación con ribosomas 7. Este protocolo describe el aislamiento de polisomas procedentes de seis días plántulas de Arabidopsis thaliana, el posterior aislamiento de RNA, y el análisis de los resultados. Correoslysomes y monosomas se separan a través de un gradiente de densidad de sacarosa. Los gradientes se recogen en seis fracciones. Algunas de las fracciones se agrupan para obtener tres fracciones separadas así: polisomas, monosomas y la fracción ligera (de aquí en adelante llamado sobrenadante), que contiene los libres 60S y 40S ribosomal subunidades y mRNAs que no están asociados con los ribosomas. actividad de traducción Global se puede estimar mediante la generación de un / relación de polisomas monosome, que se determina por la integración del área bajo la curva, y mediante la comparación de los perfiles de polisomas. mRNAs y proteínas se extraen a partir de las diferentes fracciones y se utilizaron para el análisis por RT-PCR, QRT-PCR, transferencia de Northern, microarray, Western blot o la proteómica. Este protocolo ha sido validado para otras plantas y tejidos. El equipo necesario para llevar a cabo este protocolo se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios: No hay necesidad de un fabricante de gradiente. Congelación de cada capa antes de añadir el siguiente prevenirs de cualquier mezcla o perturbación de las capas. No perforador tubo se utiliza para la recogida de gradiente que puede lograrse mediante la inmersión de un tubo capilar de vidrio en el gradiente. Por lo tanto, los tubos de ultracentrífuga costosos permanecen sin daños y se pueden volver a utilizar muchas veces. En conjunto, esto hace que el presente protocolo de un método sencillo y barato para los perfiles de polisomas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ultracentrífuga, pared fina, polialómero - 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga, pared fina, polialómero - 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga&nbsp;</td>Rotor ultracentrífugo de <td>la serie</td><td></td> <td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>Optima SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de cloruro de polivinilo Tygon R3607&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Tubo de cloruro de polivinilo, 2,29 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Colector de fracciones Modelo 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta UV</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Cubeta de flujo continuo de cuarzo</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Leer cada 0,0125 seg</td></tr><tr><td>Todos los productos químicos</td><td>Solo cualquier</td><td></td><td>uso Grado de biología molecular Mezcla</td></tr> de <tr><td>sales basales de Murashige y Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida lineal (portador de acrílico)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>portador de precipitación de ARN</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software de análisis</td></tr></tbody></table>

un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

La traducción del ARNm a proteína es un proceso biológico fundamental y altamente regulado. El perfil de polisomas se considera un estándar de oro para el análisis de la regulación traslacional. El método descrito aquí es una forma fácil y económica de fraccionar polisomas a partir de diversos tejidos vegetales. Se realiza un degradado de sacarosa sin necesidad de un creador de degradados mediante la congelación secuencial de cada capa. A continuación, los extractos citosólicos se preparan en un tampón que contiene cicloheximida y cloranfenicol para inmovilizar los ribosomas citosólicos y cloroplásticos a ARNm y se cargan en el gradiente de sacarosa. Después de la centrifugación, se recogen seis fracciones directamente desde la parte inferior hasta la parte superior del gradiente, sin perforar el tubo de ultracentrifugación. Durante la recolección, la absorbancia a 260 nm se lee continuamente para generar un perfil de polisomas que proporciona una instantánea de la actividad traslacional global. A continuación, las fracciones se agrupan para preparar tres poblaciones de ARNm diferentes: los polisomas, ARNm unidos a varios ribosomas; los monosomas, ARNm unidos a un ribosoma; y ARNm que no están unidos a los ribosomas. A continuación, se extraen los ARNm. Este protocolo ha sido validado para diferentes plantas y tejidos, incluyendo plántulas y plantas adultas de Arabidopsis thaliana, hojas de Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersecum y Oryza sativa.

En la literatura, los perfiles de polisomas a menudo se muestran a partir de la fracción ligera de la fracción pesada como resultado de la forma en que se recogen los gradientes, es decir, desde la parte superior a la parte inferior. Dado que en el protocolo descrito aquí los gradientes son recogidos desde el fondo hasta la parte superior, los perfiles mostrados comienzan con la fracción pesada (los polisomas) e ir a la fracción ligera (subunidades de ribosomas libres y ARN) (Fig...

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Hola, soy Cecile. Trabajo en el LGBP en Marsella. El protocolo que vamos a describir en este video es un método sencillo para aislar polisomas y monosomas de diversos tejidos vegetales con el fin de identificar ARNm que se traducen activamente y estudiar la regulación de la traducción.Como ejemplo, vamos a mostrarle el aislamiento de polisomas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana de seis días, el aislamiento subsiguiente de ARN y el análisis de los resultados. Siembre las semillas en una placa y déjelas dos días a cuatro grados. Luego, cultive las plantas durante seis días.Recolecte la plántula y tritúrela en nitrógeno líquido. Pese 300 miligramos de polvo vegetal y agregue 2,4 mililitros de tampón de polisomas. Centrifugue para recolectar los fragmentos vegetales y cargue el sobrenadante en la parte superior de un gradiente de sacarosa.Realice una gradiente en ultracentrífuga y luego recójala de abajo hacia arriba con lectura continua de la DO. Recoja la fracción en una fracción de polisoma, monosoma y sobrenadante, y precipite el ARN durante la noche. Ultracentrifugue, re suspenda el precipitado y extraiga el ARN para su análisis posterior. Unos días antes de realizar el perfilado de polisomas, prepare la gradiente de sacarosa.Prepare soluciones de sacarosa al 50, 35 y 20% y manténgalas a cuatro grados. Vierta la capa de sacarosa al 50%. Congélela en un congelador a menos 40.Después de seis horas, agregue la capa de 35% y congélela durante la noche en un congelador a menos 40. Vierta la primera capa de 20% y congélela. El día del experimento, retire el número necesario de gradientes del congelador.Añada la última capa de sacarosa al 20% y deje que los gradientes se descongelen en un cuarto frío. Prepare la muestra a partir de la planta que recogimos recientemente. Aquí, estamos utilizando plántulas de seis días de edad de Arabidopsis thaliana.Recolecte las plantas congeladas en nitrógeno líquido y tritúrelas completamente. Pese 300 miligramos de polvo vegetal. Añada rápidamente 2,4 mililitros de tampón de polisoma fresco y homogenice.Transferir la solución a dos tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar el extracto citosólico. Transferir el sobrenadante.Tenga cuidado para evitar el fragmento vegetal. Esto alteraría el perfil en el siguiente paso. Cargue el sobrenadante en el gradiente de sacarosa sin alterar el gradiente.Coloque el gradiente en un cubo de rotor SW 41. Centrifugue. Para visualizar el perfil de polisomas y recoger la fracción, utilizamos un sistema sencillo compuesto por un tubo capilar que se introduce en el gradiente. Este está conectado a una cubeta de UV.Está conectado internamente a una bomba peristáltica. Un espectrofotómetro UV registra continuamente la DO a medida que el gradiente avanza a través de la cubeta. El recolector de fracciones permite la recolección de fracciones de dos mililitros.Limpie la cubeta y colóquela en el espectrofotómetro. Retire el gradiente del recipiente sin perturbarlo. Los clorofilas deben concentrarse en la parte superior del gradiente.Introduzca los tubos capilares hasta el fondo del gradiente. Inicie la bomba peristáltica. El gradiente se recoge de abajo hacia arriba y la DO se lee continuamente.Se recogen fracciones de dos mililitros. A continuación se muestra la forma de un perfil clásico. La precipitación del ARN se realiza utilizando clorhidrato de guanidinio e isopropanol.Primero, vierta un volumen de clorhidrato de guanidinio en un tubo de 50 mililitros y luego agregue la fracción. A continuación, añada 1,5 volúmenes de isopropanol y 50 microgramos de portador equitativo. Precipite el ARN durante la noche a menos 20 grados.Transfiera las fracciones a tubos de ultracentrífuga de 40 mililitros y equilibre el tubo con isopropanol. Centrifugue. Retire el sobrenadante y seque el precipitado al aire. Reuspenda el precipitado en 200 microlitros de tampón TE tibio.Extraiga adicionalmente el ARN realizando una extracción clásica con fenol-cloroformo. Aquí se muestra un perfil representativo de extracto de polisomas de plántulas de Arabidopsis de seis días de edad. El pico principal corresponde al monosoma, es decir, al ARNm asociado con un único ribosoma.La primera parte del perfil corresponde a las fracciones polisómicas, es decir, el ARNm asociado con muchos ribosomas. Cada pico coincide con la asociación de un nuevo ribosoma al ARNm. La última parte del perfil corresponde a la llamada fracción de sobrenadante, que contiene los subunidades ribosomales libres y el ARN.Una gran cantidad de subunidades 60S forma un hombro junto al pico del monosoma. Para evaluar su integridad, los ARN extraídos de las fracciones se pueden separar en un gel clásico de agarosa antes de utilizarlos en experimentos posteriores. Hemos utilizado este protocolo para aislar polisomas de plántulas de Arabidopsis thaliana, así como de rosetas jóvenes y viejas, y también de hojas de Nicotiana benthamiana, tomate y arroz, por lo que debería funcionar con una amplia variedad de plantas y tejidos.Los ARN purificados son compatibles con análisis de microarreglos, así como con la identificación de ARN pequeños asociados con fracciones polisomales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.

Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Aprenda a aislar polisomas y monosomas de tejidos vegetales para identificar ARNm activamente traducidos en Arabidopsis thaliana. Este método permite estudiar la regulación de la traducción en plantas.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

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