Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas
28 de agosto de 2016
Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.
Hola, soy Cecile. Trabajo en el LGBP en Marsella. El protocolo que vamos a describir en este video es un método sencillo para aislar polisomas y monosomas de diversos tejidos vegetales con el fin de identificar ARNm que se traducen activamente y estudiar la regulación de la traducción.
Como ejemplo, vamos a mostrarle el aislamiento de polisomas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana de seis días, el aislamiento subsiguiente de ARN y el análisis de los resultados. Siembre las semillas en una placa y déjelas dos días a cuatro grados. Luego, cultive las plantas durante seis días.
Recolecte la plántula y tritúrela en nitrógeno líquido. Pese 300 miligramos de polvo vegetal y agregue 2,4 mililitros de tampón de polisomas. Centrifugue para recolectar los fragmentos vegetales y cargue el sobrenadante en la parte superior de un gradiente de sacarosa.
Realice una gradiente en ultracentrífuga y luego recójala de abajo hacia arriba con lectura continua de la DO. Recoja la fracción en una fracción de polisoma, monosoma y sobrenadante, y precipite el ARN durante la noche. Ultracentrifugue, re suspenda el precipitado y extraiga el ARN para su análisis posterior. Unos días antes de realizar el perfilado de polisomas, prepare la gradiente de sacarosa.
Prepare soluciones de sacarosa al 50, 35 y 20% y manténgalas a cuatro grados. Vierta la capa de sacarosa al 50%. Congélela en un congelador a menos 40.
Después de seis horas, agregue la capa de 35% y congélela durante la noche en un congelador a menos 40. Vierta la primera capa de 20% y congélela. El día del experimento, retire el número necesario de gradientes del congelador.
Añada la última capa de sacarosa al 20% y deje que los gradientes se descongelen en un cuarto frío. Prepare la muestra a partir de la planta que recogimos recientemente. Aquí, estamos utilizando plántulas de seis días de edad de Arabidopsis thaliana.
Recolecte las plantas congeladas en nitrógeno líquido y tritúrelas completamente. Pese 300 miligramos de polvo vegetal. Añada rápidamente 2,4 mililitros de tampón de polisoma fresco y homogenice.
Transferir la solución a dos tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar el extracto citosólico. Transferir el sobrenadante.
Tenga cuidado para evitar el fragmento vegetal. Esto alteraría el perfil en el siguiente paso. Cargue el sobrenadante en el gradiente de sacarosa sin alterar el gradiente.
Coloque el gradiente en un cubo de rotor SW 41. Centrifugue. Para visualizar el perfil de polisomas y recoger la fracción, utilizamos un sistema sencillo compuesto por un tubo capilar que se introduce en el gradiente. Este está conectado a una cubeta de UV.
Está conectado internamente a una bomba peristáltica. Un espectrofotómetro UV registra continuamente la DO a medida que el gradiente avanza a través de la cubeta. El recolector de fracciones permite la recolección de fracciones de dos mililitros.
Limpie la cubeta y colóquela en el espectrofotómetro. Retire el gradiente del recipiente sin perturbarlo. Los clorofilas deben concentrarse en la parte superior del gradiente.
Introduzca los tubos capilares hasta el fondo del gradiente. Inicie la bomba peristáltica. El gradiente se recoge de abajo hacia arriba y la DO se lee continuamente.
Se recogen fracciones de dos mililitros. A continuación se muestra la forma de un perfil clásico. La precipitación del ARN se realiza utilizando clorhidrato de guanidinio e isopropanol.
Primero, vierta un volumen de clorhidrato de guanidinio en un tubo de 50 mililitros y luego agregue la fracción. A continuación, añada 1,5 volúmenes de isopropanol y 50 microgramos de portador equitativo. Precipite el ARN durante la noche a menos 20 grados.
Transfiera las fracciones a tubos de ultracentrífuga de 40 mililitros y equilibre el tubo con isopropanol. Centrifugue. Retire el sobrenadante y seque el precipitado al aire. Reuspenda el precipitado en 200 microlitros de tampón TE tibio.
Extraiga adicionalmente el ARN realizando una extracción clásica con fenol-cloroformo. Aquí se muestra un perfil representativo de extracto de polisomas de plántulas de Arabidopsis de seis días de edad. El pico principal corresponde al monosoma, es decir, al ARNm asociado con un único ribosoma.
La primera parte del perfil corresponde a las fracciones polisómicas, es decir, el ARNm asociado con muchos ribosomas. Cada pico coincide con la asociación de un nuevo ribosoma al ARNm. La última parte del perfil corresponde a la llamada fracción de sobrenadante, que contiene los subunidades ribosomales libres y el ARN.
Una gran cantidad de subunidades 60S forma un hombro junto al pico del monosoma. Para evaluar su integridad, los ARN extraídos de las fracciones se pueden separar en un gel clásico de agarosa antes de utilizarlos en experimentos posteriores. Hemos utilizado este protocolo para aislar polisomas de plántulas de Arabidopsis thaliana, así como de rosetas jóvenes y viejas, y también de hojas de Nicotiana benthamiana, tomate y arroz, por lo que debería funcionar con una amplia variedad de plantas y tejidos.
Los ARN purificados son compatibles con análisis de microarreglos, así como con la identificación de ARN pequeños asociados con fracciones polisomales.
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Descripción general
Este protocolo describe un método sencillo para aislar polisomas y monosomas a partir de tejidos vegetales, lo que permite la identificación de ARNm que se traducen activamente y el estudio de la regulación de la traducción. El ejemplo proporcionado se centra en el aislamiento de polisomas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana de seis días de edad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Regulación de la traducción
- Análisis de ARNm
Antecedentes
- Comprender la actividad de traducción es fundamental para estudiar la expresión génica.
- Los polisomas son agrupaciones de ribosomas que traducen el ARNm, mientras que los monosomas son ribosomas individuales.
- Este método proporciona información sobre el estado traduccional de ARNm específicos.
- Arabidopsis thaliana sirve como organismo modelo en la investigación vegetal.
Objetivo del estudio
- Aislar polisomas y monosomas de tejidos vegetales.
- Identificar ARNm que se traducen activamente.
- Estudiar la regulación de la traducción en plantas.
Métodos Utilizados
- Siembra de semillas en placas y estratificación fría durante dos días.
- Crecimiento de plántulas durante seis días en condiciones óptimas.
- Aislamiento de polisomas y monosomas a partir de los tejidos vegetales.
- Análisis de ARN para determinar la actividad de traducción.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de polisomas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana.
- Identificación de ARNm que se traducen activamente.
- Información sobre la regulación de la traducción en tejidos vegetales.
- Demuestra la eficacia del método para estudiar la traducción.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para estudiar la traducción en plantas.
- Mejora la comprensión de la regulación de la expresión génica.
- El enfoque puede aplicarse a diversas especies vegetales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El perfilado de polisomas proporciona una instantánea directa de la actividad traduccional, permitiendo la reducción mecanicista de riesgos en las hipótesis sobre dianas en el descubrimiento de biofármacos basados en plantas. Al distinguir los grupos de ARNm que se traducen activamente, el método apoya la validación de dianas y el cribado fenotípico en sistemas relevantes para la agricultura. Este enfoque mejora la confianza predictiva al priorizar candidatos para la mejora de cultivos o aplicaciones en agricultura molecular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la abundancia de ARNm con el rendimiento traduccional.
- Valor operativo: Clarifica la actividad de las vías a través de métricas de participación ribosómica.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar dianas con participación traduccional sostenida.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos en plataformas de expresión vegetal.
- Valor operativo: Permite la estandarización de ensayos mediante el perfilado cuantitativo de OD260 y la reproducibilidad de fracciones.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en tejidos de Arabidopsis, Nicotiana, tomate y arroz.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta la validación de dianas en fase de descubrimiento con la evaluación preclínica de biomarcadores en sistemas vegetales.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Se centra en el valor predictivo mediante el aislamiento de poblaciones de ARNm definidas por la carga de ribosomas.
- Sistema Relevantes para Enfermedades: Aplicable a modelos de cultivos utilizados en agricultura molecular y producción de biofármacos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, apoyando la comprobación de hipótesis antes de la identificación de compuestos activos y permitiendo una continuidad traslacional hacia la evaluación preclínica en sistemas basados en plantas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la interacción con el blanco mediante la medición de cambios en las relaciones polisoma/monosoma bajo condiciones experimentales.
- Tamizaje: Proporciona lecturas de perfilado de ribosomas que ayudan a comparar los efectos de compuestos o perturbaciones genéticas.
- Análisis: Genera trazados cuantitativos de OD260 y rendimientos de ARN fraccionado para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se alinea con el descubrimiento de biomarcadores en los procesos de producción molecular vegetal.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de fraccionamiento aplicable a diversos tejidos y especies vegetales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al resolver los estados traductivos de los ARNm diana.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la fraccionación estandarizada en gradientes de sacarosa y la monitorización continua de la DO.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia directa de la modulación del objetivo a nivel traduccional.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en datos de actividad traduccional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos vegetales y en la preparación de tampones de polisomas.
- Depende de equipos de ultracentrifugación y sistemas de recolección de fracciones con monitoreo UV.
- Necesita una estandarización entre equipos para los protocolos de preparación de gradientes y agrupación de fracciones.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a sistemas vegetales no modelo.
- Incluye limitaciones prácticas relacionadas con la integridad del ARN durante las etapas de fraccionamiento y extracción.
