Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Hola, soy Cecile. Trabajo en la LGBP de Marsella. El protocolo que vamos a describir en este vídeo es un método sencillo para aislar polisomas y monosomas de diversos tejidos vegetales con el fin de identificar los ARNm que se traducen activamente y estudiar la regulación de la traducción.

A modo de ejemplo, vamos a mostrar el aislamiento de polisomas de plántulas de Arabidopsis thaliana de seis días de edad, el posterior aislamiento del ARN y el análisis de los resultados. Siembra las semillas en plato y déjalas dos días a cuatro grados. A continuación, cultiva las plantas durante seis días.

Coseche las plántulas y muélalas en nitrógeno líquido. Pesar 300 miligramos de polvo vegetal y añadir 2,4 mililitros de tampón de polisomas. Centrífuga para recoger fragmentos de plantas y cargar el sobrenadante en la parte superior de un gradiente de sacarosa.

Gradiente ultracentrífugo y luego recójalo de abajo hacia arriba con lectura continua del diámetro exterior. Tire de la fracción en un polisoma, un monosoma y una fracción sobrenadante y precipite el ARN durante la noche. Ultracentrífuga, resuspender el pellet y extraer el ARN para su posterior análisis. Unos días antes de realizar el perfil de polisomas, prepare el gradiente de sacarosa.

Prepare una solución de sacarosa al 50, 35 y 20% y manténgalos a cuatro grados. Vierta la capa de sacarosa al 50%. Congélalo en un congelador a menos 40

Después de seis horas, agregue la capa al 35% y congélela en un congelador a menos 40 durante la noche. Vierta el primer 20% de la capa y congélela. El día del experimento, retire el número necesario de degradados del congelador.

Agregue la última capa de sacarosa al 20% y deje que los degradados se descongelen en una habitación fría. Preparamos la muestra de planta recién recolectada. En este caso, estamos utilizando plántulas de Arabidopsis thaliana de seis días de edad.

Coseche las plantas congeladas con nitrógeno líquido y muélalas bien. Peso: 300 miligramos de polvo vegetal. Añadir rápidamente 2,4 mililitros de tampón de polisoma fresco y homogeneizar.

Pipetea la solución en dos tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar el extracto citosólico. Pipetear el sobrenadante.

Tenga cuidado de evitar fragmentos de plantas. Estropearían el perfil en el siguiente paso. Cargue el sobrenadante en el gradiente de sacarosa sin interrumpir el gradiente.

Coloque el gradiente en un cucharón de rotor SW 41. Centrífuga. Para visualizar el perfil del polisoma y recoger la fracción, utilizamos un sistema sencillo formado por un tubo capilar que se sumerge en el gradiente. Está conectado a una cubeta UV.

Está autoconectado a una bomba peristáltica. Un espectrofotómetro UV registra continuamente el diámetro exterior a medida que el gradiente avanza a través de la cubeta. El colector de fracciones permite la recolección de fracciones de dos mililitros.

Limpie la cubeta y colóquela en el espectrofotómetro. Elimine el degradado del cubo sin alterarlo. Las clorofilas deben concentrarse en la parte superior del gradiente.

Sumerja los tubos capilares hasta la parte inferior del gradiente. Ponga en marcha la bomba peristáltica. El gradiente se recoge de abajo hacia arriba y el OD se lee continuamente.

Se recogen fracciones de dos mililitros. Aquí está la forma de un perfil clásico. La precipitación del ARN se realiza mediante el uso de clorhidrato de guanidinio e isopropanol.

Primero, vierta un volumen de clorhidrato de guanidinio en un tubo de 50 mililitros y luego agregue la fracción. A continuación, añadir 1,5 de volumen de isopropanol y 50 microgramos de mensajero igual. Precipite el ARN durante la noche a menos 20 grados.

Transfiera las fracciones a tubos ultracentrífugos de 40 mililitros y equilibre el tubo con isopropanol. Centrífuga. Retire el sobrenadante y seque al aire el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón TE tibio.

Extraiga aún más el ARN realizando una extracción clásica de fenol cloroformo. Aquí se muestra un perfil representativo del extracto de polisomas de la plántula de seis días de Arabidopsis. El pico principal corresponde al monosoma, el ARNm que se asocia a un solo ribosoma.

La primera parte del perfil corresponde a las fracciones polisomales, es decir, el ARNm asociado a muchos ribosomas. Cada pico coincide con la asociación del nuevo ribosoma con el ARNm. La última parte del perfil corresponde a la llamada fracción sobrenadante que contiene las subunidades ribosómicas libres y el ARN.

Una gran cantidad de subunidades 60S forman un hombro junto al pico del monosoma. Para evaluar su integridad, los ARN extraídos de las fracciones pueden analizarse en un gel clásico de Aragose antes de ser utilizados para otros experimentos. Hemos utilizado este protocolo para aislar polisomas de plántulas de Arabidopsis thaliana, pero también de rosetas jóvenes y viejas, así como de hojas de Nicotiana benthamiana, tomate y arroz, por lo que debería funcionar con una amplia gama de plantas y tejidos.

Los ARN purificados son compatibles con el análisis de microarrays, así como para la identificación de pequeños ARN asociados a fracciones polisomales.