Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

El objetivo general de este protocolo es demostrar el crecimiento de vellosidades de células intestinales humanas bajo movimientos y flujo similares al peristaltismo en un dispositivo microfluídico tipo intestino-en-un-chip, así como mostrar cómo co-cultivar estas células con microbioma intestinal vivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología, la microbiología clínica y las ciencias farmacéuticas para identificar los mecanismos de las enfermedades y validar la eficacia y toxicidad de nuevos compuestos farmacéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden establecer in vitro un ecosistema viable y funcional del intestino humano posmicrobioma mediante un sistema microfisiológico.

Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse a enfermedades como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn, ya que el cultivo celular estable en co-cultivo con el microbioma puede emular las complejidades de estas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar una visión detallada de las interacciones complejas entre el microbioma intestinal y el sistema inmunitario en el intestino, también puede aplicarse a otros sistemas orgánicos donde existen interacciones entre el hospedador y los microorganismos, como la piel, el tracto genital o la cavidad oral. Para comenzar, prepare el dispositivo microfluídico tipo intestino-en-un-chip según se describe en el protocolo de texto adjunto.

El dispositivo consta de un polímero de silicio transparente permeable a los gases que contiene dos microcanales paralelos, separados por una membrana porosa de PDMS flexible. En cada lado de los canales hay cámaras de vacío, que pueden utilizarse para aplicar tensión mecánica cíclica. Esterilice el dispositivo utilizando una jeringa de un mililitro para hacer pasar etanol al 70 % a través de los canales.

A continuación, seque el dispositivo en un horno seco a 60 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, exponga el microsistema de intestino-sobre-un-chip, junto con sus tubos conectados, simultáneamente a luz UV y ozono durante 40 minutos. Enfrié el dispositivo manteniéndolo bajo la luz UV de una cabina de seguridad biológica durante 15 minutos.

A continuación, cargue 100 microlitros de una solución codificante de matriz extracelular en una jeringa de un mililitro y dispénsela en el microcanal superior del dispositivo. Repita este proceso para recubrir también el microcanal inferior. Coloque todo el montaje en un incubador humidificado con 5%CO2 a 37 grados Celsius durante una hora.

Durante la incubación, desgasifique el medio de cultivo completo precalentado pasándolo a través de un filtro de 0,45 micrones en un sistema de filtración de 50 mililitros durante un minuto. Toque suavemente el medio filtrado durante un minuto para eliminar cualquier burbuja o gas disuelto en el medio. Luego, transfiera el medio completo desgasificado a dos jeringas desechables de tres mililitros e incube las jeringas durante una hora.

A continuación, conecte las jeringas a los microcanales superior e inferior del dispositivo tipo intestino-en-un-chip y elimine la solución de codificación haciendo pasar medio completo a través de los microcanales superior e inferior con un pulso suave. Luego, utilice una bomba de jeringa para hacer fluir medio de cultivo celular completo desgasificado hacia el microcanal superior del dispositivo, mientras incuba el chip durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂. Recoleccione células epiteliales intestinales Caco-2 de un frasco T75 completamente confluyente, primero lavando las células con 10 mililitros de PBS sin calcio ni magnesio.

Luego, aspire el PBS y repita el lavado otras dos veces. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina-EDTA al 0,05 % e incube el frasco durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular completo precalentado y pipetee la suspensión celular de arriba abajo entre tres y cinco veces antes de transferirla a un tubo de centrífuga.

Centrifugar la suspensión celular. Luego, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células a 150.000 células por centímetro cuadrado en medio completo precalentado. Aspirar 500 microlitros de la suspensión celular en una jeringa desechable de un mililitro, equipada con una aguja de 25 gauge, 5/8 de pulgada.

A continuación, dispense 100 microlitros de la suspensión celular en el microcanal superior a través del tubo de salida. Luego, cierre con pinzas de oficina todas las entradas y salidas conectadas a los microcanales superior e inferior. Incube todo el montaje durante una hora para permitir que las células epiteliales intestinales se adhieran a la superficie de la membrana porosa.

A continuación, retire las pinzas y conecte el tubo del canal superior a una jeringa llena de medio de cultivo que haya sido colocada en una bomba de jeringa. Reanude el flujo de medio de cultivo hacia el microcanal superior a 30 microlitros por hora hasta que las células formen una monocapa intacta. Una vez que las células formen una monocapa, conecte el canal inferior a la segunda jeringa y perfunda el medio de cultivo en ambos microcanales, el luminal superior y el capilar inferior, al mismo flujo de 30 microlitros por hora.

Para crear un movimiento similar al peristáltico en el chip, primero encienda la bomba de vacío. Conecte las cámaras de vacío del dispositivo al controlador de vacío mediante tubos con un conector de acero inoxidable. Luego, configure el controlador para que proporcione un movimiento cíclico de estiramiento del 10 % de la deformación media de la célula a una frecuencia de 0,15 hercios y, a continuación, haga clic en iniciar.

Mantenga el flujo de medio de cultivo hacia los microcanales superior e inferior en presencia de deformaciones mecánicas durante al menos 80 horas para inducir el crecimiento de vellosidades. Prepare una mezcla 50/50 de caldo MRS para Lactobacilos autoclaveado y medio clostridial reforzado. Luego, re-suspenda una mezcla bacteriana probiótica liofilizada en 10 mililitros de la mezcla.

Mida la densidad óptica de la mezcla a 600 nanómetros y ajuste la densidad celular final a aproximadamente 0,2 unidades de densidad óptica. Ali-cuote tres mililitros de la suspensión celular microbiana ajustada en tubos estériles desechables de 10 mililitros. Coloque los alícuotas en un recipiente anaerobio y agregue dos sobres de generación de gas anaerobio en el recipiente.

Cierre herméticamente la tapa del recipiente e incube el conjunto sin agitar en una incubadora durante la noche. A continuación, prepare medio de cultivo celular sin antibióticos y desgasificado, y llénelo en jeringas desechables de tres mililitros. Transfiera el dispositivo de intestino-en-un-chip que contiene vellosidades microingenierizadas al gabinete de seguridad biológica.

Retire las jeringas conectadas a los microcanales superior e inferior del dispositivo y sustitúyalas por jeringas que contengan medio de cultivo celular sin antibióticos y desgasificado. Una vez finalizado, coloque el dispositivo nuevamente en el incubador de CO₂. A continuación, haga fluir el medio de cultivo sin antibióticos a través del dispositivo durante 12 horas antes de inocular el microbioma.

A continuación, centrifugue la mezcla de células bacterianas probióticas previamente cultivadas. Aspire el sobrenadante y luego re-suspenda las bacterias en DMEM sin antibióticos. Cargue aproximadamente 100 microlitros de esta suspensión celular en una jeringa de un mililitro acoplada a una aguja de calibre 25, de 5/8 de pulgada.

Infunda las bacterias en el lado luminal del microcanal que contiene las vellosidades intestinales previamente libres de gérmenes. Permita que las células microbianas se adhieran a la superficie apical de las vellosidades intestinales durante una hora y media sin flujo, mediante el pinzamiento del tubo. Luego, perfunda el medio de cultivo sin antibióticos previamente calentado en ambos microcanales, superior e inferior, a 40 microlitros por hora con deformaciones rítmicas cíclicas.

Este protocolo de co-cultivo permite la colonización estable de múltiples especies de bacterias probióticas en el espacio intervelloso. Las microcolonias bacterianas viables pueden mantenerse durante hasta dos semanas en co-cultivo. Se muestra aquí una co-cultivo diferente que consta de E. coli marcado con GFP y vellosidades intestinales.

La ampliación de alto poder muestra claramente la ubicación de las microcolonias bacterianas en el punto temporal de 72 horas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar suavemente y lentamente el medio de cultivo en los canales microfluídicos para evitar dañar la monocapa de células epiteliales en las primeras etapas del cultivo. A partir de este método, un método de co-cultivo con células inmunitarias humanas también puede proporcionar algunas pistas sobre cómo el microbioma puede interactuar con el sistema inmunológico y sus influencias en la homeostasis y la salud intestinal óptima.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstituir el microentorno del intestino humano y demostrar el cultivo conjunto del microbioma y las vellosidades intestinales humanas in vitro. Trabajar con bacterias patógenas y células humanas es extremadamente peligroso, así que no olvide trabajar dentro de una cabina de seguridad biológica.