Name: Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a co-cultivar microbioma intestinal y células epiteliales usando un dispositivo microfluídico gut-on-a-chip. Este método permite estudiar interacciones huésped-microbioma y avanzar en investigación gastroenterológica y desarrollo de fármacos.

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Agradecemos a Sri Kosuri (Instituto Wyss de la Universidad de Harvard) por proporcionar la cepa de E. coli marcada con GFP. Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa bajo el Acuerdo de Cooperación Número W911NF-12-2-0036, la Administración de Alimentos y Medicamentos bajo contrato #HHSF223201310079C y el Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard. Los puntos de vista y conclusiones contenidos en este documento son los de los autores y no deben interpretarse como representativos de las políticas oficiales, ya sean expresas o implícitas, de la Oficina de Investigación del Ejército, el Laboratorio de Investigación del Ejército, la Administración de Alimentos y Medicamentos o el Gobierno de los EE. UU. El Gobierno de los EE. UU. está autorizado a reproducir y distribuir reimpresiones para fines gubernamentales, a pesar de cualquier anotación de derechos de autor en este documento.

1. La microfabricación de un dispositivo Gut-on-a-chip Nota: El a-chip gut-en-es un dispositivo de microfluidos hecho por, polímero de silicona permeable al gas transparente (polidimetilsiloxano, PDMS), que contiene dos microcanales paralelos (1 mm de ancho x 150 m de altura x 1 cm de longitud) separados por una flexibilidad porosa (10 micras de diámetro de poro, de 25 micras de poro de separación de poro) PDMS membrana de 5,9. Fabricar el (Figura 1A, izquierda) gut-on-a-chip siguiendo los pasos que se indican. <ol><li> Microfabricación Procedimiento del 5,9 Gut-on-a-chip. <ol><li> Preparar PDMS, desgasificados sin curar mezclando el prepolímero de PDMS y el agente de curado (15: 1 w / w), y colocarla en el desecador de vacío durante 30 minutos. </li><li> Verter 30 g y 3 g de PDMS sin curar, se desgasificó en cada molde de silicona que tiene SU-8 micropatterns base de la pala y los micro-canales inferiores del intestino a-chip-on-, respectivamente. A continuación, el curado a 60 ° C en un horno seco durante al lal este de 4 horas. </li><li> Desmoldar las capas PDMS superior e inferior de cada molde de silicona cortando alrededor de los bordes utilizando un bisturí quirúrgico. 6 perforar agujeros (dos entradas, dos salidas y dos cámaras de vacío) usando un golpeador biopsia (2,0 mm de diámetro del agujero). </li><li> Prepare la membrana porosa vertiendo 10 g de PDMS sin curar y se desgasifica en una oblea de silicio silanizado que contiene las matrices de correos con columnas circulares (10 m de diámetro, 25 micras de altura) superpuestas con un piso, silanizada capa de soporte PDMS (15: 1, w / w; 1 cm de espesor). Coloque un prensatelas 3 kg de peso en la configuración y curar el polímero a 60 ° C durante 12 horas o más. </li><li> Desmoldear la configuración de una membrana de PDMS poroso adherido a la losa de soporte de PDMS de la oblea de silicio levantando con cuidado la esquina de la losa de la oblea, y pelando hasta que la membrana de PDMS poroso está completamente separado de la oblea. </li><li> Exponer el lado de canal de una capa superior (PDMS, 15: 1, w / w) y el lado de la membrana porosa a la plasma generada por un tratador de corona de mano durante 1 minuto, y 3 seg, respectivamente. </li><li> Colocar las superficies tratadas con plasma de la membrana de PDMS porosa y la capa superior de microcanal en un contacto conforme colocando cada pieza en paralelo sin burbujas de aire. </li><li> Incubar toda la configuración a 80 ° CO / N para la unión irreversible de las dos capas de PDMS. </li><li> Despegar la capa de soporte de PDMS de la asamblea de una capa superior con una membrana porosa levantando con cuidado la esquina de la capa de soporte, y pelando hasta que la capa de soporte está completamente separado de la capa superior con la membrana. </li><li> Corte las porciones de esta membrana situada sobre las cámaras de vacío (las dos cámaras situadas a cada lado del canal principal) utilizando unas pinzas de punta fina para hacer cámaras de vacío huecas. </li><li> Exponer el lado de la membrana unida a la pieza superior y el lado con los canales grabados en la pieza inferior al plasma en una misma manera como se describe in paso 1.1.6 durante 1 minuto. </li><li> Alinear la capa de microcanal superior con una membrana porosa y la capa inferior con un contacto conforme colocando cada pieza en paralelo sin burbujas de aire bajo un estereoscopio. </li><li> Curar toda la configuración en un horno seco a 80 ° CO / N para producir una escala gut-on-a-chip dispositivo de microfluidos completo que contiene dos cámaras de vacío hueco al lado del canal de la célula de microfluidos. </li></ol></li><li> Conectar los tubos a la entrada y salida de cada puerto vinculada a la parte superior o inferior de los microcanales en un a-chip gut-on-a través de una aguja de acero inoxidable de extremos romos doblada 90 °. </li><li> Conectar los tubos a los agujeros vinculados a las cámaras de vacío utilizando una aguja de acero inoxidable de extremos romos doblada 90 °. </li><li> Esterilizar los microcanales y tubos por corrientes de etanol 70% (v / v) usando un 1 ml esterilizados jeringa desechable. </li><li> Secar los microcanales y tubos en un horno a 60 ° C en seco O / N. </li></ol> 2. Crecimiento de micromotorEred intestinal Villi en el dispositivo Gut-on-a-chip <ol><li> Las células epiteliales intestinales de semillas (por ejemplo, células Caco-2BBE) en un 5,9 Microdevice Gut-on-a-Chip. <ol><li> Esterilizar el dispositivo con 70% (v / v) de etanol (véase el paso 1.4), utilizando una jeringa desechable esterilizado 1 ml seguido de secado en un horno seco O 60 ° C / N (véase el paso 1.5) antes de la activación de la superficie. </li><li> Exponer la configuración completa de un microsistema gut-on-a-chip (es decir, un cuerpo de la tripa-on-a-chip conectado a la tubería) a la luz UV (253,7 nm) y el ozono de forma simultánea durante 40 minutos. </li><li> Enfriar el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos bajo luz UV en un gabinete de seguridad biológica (BSC). </li><li> Introducir 100 l de la capa de ECM Solución una mezcla de 50 g / ml Tipo de colágeno I y 300 mg / ml de mezcla de matriz extracelular diluido en la modificación de Dulbecco de Eagle medio libre de suero (DMEM) - en los dos microcanales superior e inferior utilizando un desechable , jeringa de 1 ml estéril. </li><li> Incubadorasdel te todo el montaje en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 1 hora. </li><li> Degas 50 ml de pre-calentado (37 ° C) medio de cultivo completo (DMEM, 20%, v / v, suero fetal bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina; alícuotas en un 3 ml jeringa desechable) utilizando un sistema de filtración de 50 ml (0,45 micras de tamaño de poro) en el BSC para 1 min. <ol><li> Pasar el medio pre-calentado a través del sistema de filtración y golpear suavemente en el medio se filtró durante 1 minuto para eliminar las burbujas de gas o disuelto en el medio. </li></ol></li><li> Coloque la alícuota de medio completo desgasificado en una jeringa desechable de 3 ml y se incuba en un 37 ° C al 5% humidificada de CO 2 incubadora durante 1 hr. </li><li> Conectar dos jeringas desechables 3 ml que contiene desgasificaron, medio de cultivo completo pre-calentado a los microcanales superior e inferior. </li><li> El flujo del medio de cultivo celular completo desgasificado en el microcanal superior utilizando una bomba de jeringa en el volumétricavelocidad de 30 l / h de flujo (equivalente al esfuerzo cortante en 0,02 dinas / cm2) en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> Microconstruidos formación de células Caco-2 en el Villi un chip Gut-on-Sea. <ol><li> Utilice células Caco-2BBE con el número de pases entre 50 y 65. </li><li> Crecer células Caco-2 en un matraz T75 que contiene medio de cultivo completo en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 4-5 días para obtener células completamente confluentes. </li><li> Añadir 10 ml de Ca 2+ y Mg 2 + libre de PBS para completamente confluentes Caco-2 células cultivadas en un matraz T75, se lavan las células, a continuación, Aspirar PBS. Repita este paso dos veces. </li><li> Añadir 1 ml de solución de tripsina / EDTA al 0,05% y se incuba en un 37 ° C al 5% humidificada de CO 2 incubadora durante 5 min. </li><li> Resuspender las células disociadas con 10 ml de medio de cultivo celular completo pre-calentado (con FBS) pipeteando arriba y abajo tres a cinco veces. </li><li> Centrifugar la suspensión celular por centrifugation a 500 xg durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante. </li><li> Resuspender de nuevo con 1 ml pre-calentado medio completo para ajustar la densidad celular en ~ 1,5 x 10 5 células / cm 2 en el dispositivo. Utilice hemocitómetro para estimar la densidad celular. </li><li> Infundir 100 l de las células resuspendidas Caco-2 en el microcanal superior (lumen lateral) mediante la colocación de una jeringa de 1 ml desechable unido a un 25 G5 / 8 de la aguja en la salida del tubo conectado a la microcanal superior. </li><li> Sujetar todas las entradas y salidas de los tubos conectados a los micro-canales superior e inferior utilizando clips de la carpeta. </li><li> Incubar toda la instalación en un 37 ° C, 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 1 hora para permitir disociarse células Caco-2 se adhiera a la superficie de la membrana porosa. </li><li> Retire las abrazaderas y reanudar el flujo de medio de cultivo sólo para el microcanal superior a 30 l / hr utilizando una bomba de jeringa hasta que las células forman una monocapa intacta de 24 a 36 hr. Usa los contras de faseT o microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para confirmar las uniones célula-célula en una monocapa de células. </li><li> Cuando las células forman una monocapa, perfundir el medio de cultivo en ambos superiores (lumen) y microcanales (capilares) inferiores a la misma velocidad de flujo de 30 l / hr. </li><li> La aplicación de deformaciones mecánicas que imitan los movimientos peristálticos-como 5,9. <ol><li> Encienda la bomba de vacío equipado con el equipo de la tensión. </li><li> Conectar las cámaras de vacío al controlador de vacío a través de la tubería con un conector de acero inoxidable. </li><li> Establecer el movimiento de estiramiento de la cepa de células media del 10% a una frecuencia de 0,15 Hz con el modo de función sinusoidal cíclica por el software de control de vacío, a continuación, haga clic en &quot;Inicio&quot;. </li></ol></li><li> Mantener el flujo constante de medio de cultivo (30 l / h) en ambos microcanal superior e inferior para la confluencia Caco-2 monocapa bajo deformaciones mecánicas (10%, 0,15 Hz) para ~ 100 hr. Nota: Las células Caco-2 Sponneamente someterse a la morfogénesis de las vellosidades con proyecciones en 3D onduladas extendidos hacia el lumen del microcanal epitelial 5,8-10. </li></ol></li><li> Para emular las funciones a nivel de órganos del intestino humano vivo con interfaz tejido-lumen capilar en el intestino-on-a-chip 10, siga los pasos descritos. <ol><li> Microconstruidos crecer células Caco-2 vellosidades repitiendo los pasos de 2.1 a 2.2. </li><li> El flujo del medio pre-calentado de co-cultivo (una mezcla de medio de cultivo celular completo Caco-2 y el medio completo de cultivo HMVECs, 1: 1 v / v) a los microcanales superior e inferior en 30 l / hr. </li><li> Introducir 100 l de células disociadas normales microvasculares capilar humana endoteliales (HMVECs; densidad celular final, ~ 5,0 x 10 5 células / cm 2) en el microcanal inferior por el método idéntico descrito en los pasos de 2.2.3 a 2.2.9. </li><li> Coloque un pedazo rectangular de PDMS curado (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; ancho x largo x; 15: 1, w/ w elastómero: agente de curado) en la parte superior del dispositivo gut-on-a-chip, y luego la vuelta a toda la configuración del dispositivo al revés (es decir, el microcanal superior se enfrenta a la baja, y el microcanal menor se enfrenta al alza). </li><li> Incubar la instalación en un 37 ° C, humidificado 5% de CO 2 incubadora durante 1 hora para permitir HMVECs disociadas a que se adhieran a la superficie de la membrana porosa en el microcanal inferior. </li><li> Saque toda una configuración de la incubadora de CO 2, y voltear la configuración de nuevo. </li><li> Flujo de medio de co-cultivo pre-calentado (una mezcla de medio de cultivo celular completo Caco-2 y el medio completo de cultivo HMVECs, 1: 1 v / v) en los dos microcanales superior e inferior en 30 l / hr con movimientos de estiramiento mecánico ( 10%, 0,15 Hz) durante al menos tres días para formar uniones célula-célula de una monocapa endotelial. </li></ol></li></ol> 3. Host-gut microbioma Co-cultivo en un Microdevice Gut-on-a-chip <ol><li> Realizar pre-cultivo of las células bacterianas de la siguiente manera para co-cultivo microbioma comensal intestinal de las vellosidades intestinales en microconstruidos. <ol><li> Resuspender la mezcla en polvo bacteriano probiótico liofilizado en 10 ml de la mezcla (1: 1, v / v) de autoclave Lactobacilli MRS Broth y reforzado clostridial Medium. </li><li> Ajuste la densidad final de células de aproximadamente 0,2 unidades de densidad óptica (a 600 nm) mediante la adición de la cantidad apropiada de medio, a continuación, parte alícuota de 3 ml de suspensión de células microbianas en un tubo estéril desechable de 10 ml. </li><li> Se colocan los tubos que contienen volvieron a suspender las células microbianas en el recipiente anaeróbico. Añadir dos paquetes de anaeróbico bolsita de generación de gas en el recipiente. Cierre la tapa del recipiente bien e incubar la configuración del contenedor sin agitación en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> La inoculación de microbioma y co-cultivo con células intestinales epiteliales 5,10. <ol><li> Preparar 3 ml jeringas desechables que contienen antibioti desgasificada-c libre de medio de cultivo celular (es decir, DMEM con 20% FBS). Ver 2.1.6 para el procedimiento de desgasificación del medio de cultivo. </li><li> Saque toda una configuración del dispositivo gut-on-a-chip que contiene vellosidades microconstruidos de la incubadora de CO 2, a continuación, pasar a la cabina de bioseguridad. </li><li> Retire las jeringas conectadas a un tubo vinculado a los micro-canales superior e inferior. Conectar las jeringas preparadas en 3.2.1 en el dispositivo, traer de vuelta a la incubadora de CO 2, entonces el flujo de este medio de cultivo libre de antibióticos durante 12 horas antes de la siembra del microbioma. </li><li> Centrifugar las células bacterianas probióticas mezcla pre-cultivadas (consulte los pasos de 3.1) a 10.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante usando vacío, a continuación, volver a suspender en medio DMEM libre de antibióticos (densidad celular final, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml). </li><li> Infundir la suspensión de células en el lado del lumen del microcanal que contiene las vellosidades intestinales &quot;libres de gérmenes&quot; utilizando una jeringa desechable de 1 ml conectada a un 25G5 / 8 aguja. Permitir la adherencia de las células microbianas a la superficie apical de las vellosidades intestinales de ~ 1,5 hr sin flujo por apriete a todo el extremo del tubo. </li><li> Perfundir el medio de cultivo libre de antibióticos pre-calentado en ambos microcanales superior e inferior a 40 l / hr con deformaciones rítmicos cíclicos (10%, 0,15 Hz). </li><li> Para el co-cultivo de la proteína fluorescente verde (GFP) marcado con E. coli (E. coli GFP; no patógena DH5-alfa de E. coli huésped) 10,11 células con vellosidades microconstruidos, pre-GFP cultivar E. células de E. coli en medio LB en autoclave a 37 ° C bajo condiciones (200 rpm) con agitación durante 12 h. Repita el procedimiento desde 3.2.5 a 3.2.6 para llevar a cabo el co-cultivo de GFP E. células de E. coli con vellosidades microconstruidos. </li></ol></li><li> Las células de imagen 5,8-10 <ol><li> Realizar DIC, epifluorescencia, o de barrido láser microscopía confocal para la grabación microbiana y epitelial morfología 5,8,10. <ol><li> Para la formación de imágenes DIC, disponer de un microsistema configuración del intestino-on-a-chip de la incubadora de CO 2, coloque la configuración del dispositivo en el escenario de un microscopio, a continuación, registrar la morfología celular. </li><li> Para imágenes de fluorescencia de epitelio de las vellosidades, fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min. <ol><li> Fijar vellosidades con 4% (w / v) de paraformaldehído durante 15 min. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min. </li><li> Permeabilizar las vellosidades con 0,3% (v / v) de Triton X-100 diluido en PBS que contiene 2% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) durante 10 min. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min. </li><li> células de bloques con 2% (w / v) de BSA en PBS durante 1 hr. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min. </li><li> Añadir 300 nM de 4 &#39;, solución de dihidrocloruro de 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS para la tinción nuclear bajo la protección de la luz. </li><li> Añadir 25 unidades / ml de faloidina fluorescente(Conjugado faloidina-CF647) disuelto en PBS para la tinción de actina F bajo la protección de la luz. </li><li> grabar imágenes de las células teñidas con fluorescencia utilizando un microscopio confocal de barrido láser. Nota: Un objetivo 25X se aplicó con zoom óptico apropiado durante la microscopía confocal. En la Figura 3B, se utilizó aproximadamente magnificación 525x. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Donald E. Ingber es fundador de Emulate Inc., tiene acciones en la compañía y preside su Junta Asesora Científica. Los otros autores no tienen divulgaciones financieras.

La comprensión de las interacciones huésped-microbioma es fundamental para el avance de la medicina; Sin embargo, los modelos de cultivo celular tradicionales realizadas en un plato de plástico o una placa estática no apoyan la estable co-cultivo de células intestinales humanas con microbios intestinales vida de más de 1-2 días porque las células microbianas en su mayoría crecen en exceso las células de mamífero in vitro. La población microbiana overgrowing consume rápidamente oxígeno y nutrientes, produciendo ...

El intestino humano alberga una matriz sorprendentemente diversa de especies microbianas (&lt;1.000 especies) y un enorme número de células microbianas (10 veces más que las células huésped humanos) y genes (100 veces más que el genoma humano) 1. Estos microbiomas humanos juegan un papel clave en el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, la regulación de la respuesta inmune, y el mantenimiento de la homeostasis intestinal 2. No es sorprendente, teniendo en cuenta estas diversas funciones, el microbioma intestinal comensal modula ampliamente la salud y la enfermedad 3. Por lo tanto, la comprensión del papel de microbioma intestinal y huésped-microbio interacciones son de gran importancia para promover la salud gastrointestinal (GI) y explorar nuevas terapias para los trastornos intestinales 4. Sin embargo, los modelos existentes en el intestino in vitro (por ejemplo, cultivos estáticos) restringir el co-cultivo de acogida-microbioma de un corto período de tiempo (&lt;1 día) debido a un crecimiento excesivo de células microbianas y comprometen la barrera intestinalFunción 5. Modelos animales sustitutos (por ejemplo, libre de gérmenes 6 o ingeniería genética ratones 7) tampoco se utilizan comúnmente para estudiar anfitrión-gut microbioma diafonía porque la colonización y el mantenimiento estable del microbioma intestinal humana son difíciles. Para superar estos desafíos, recientemente desarrollamos un ser humano biomimético &quot;Gut-on-a-Chip&quot; sistema de microphysiological (Figura 1A, izquierda) para emular las interacciones huésped-microbioma intestinal que se producen en el intestino humano vivo 5,8. El microdispositivo gut-on-a-chip contiene dos canales de microfluidos paralelas separadas por una, porosa, matriz extracelular flexible (ECM) de la membrana recubierta revestido por epitelio intestinal humano células Caco-2, imitando la interfaz de tejido lumen capilar intestinal (Figura 1A , derecha) 9. deformaciones rítmicos cíclicos de vacío impulsada inducen deformaciones mecánicas fisiológicos que imitan cambios normalmente Induccado por el peristaltismo (Figura 1A, derecha). Curiosamente, cuando se cultivan células Caco-2 en el a-chip gut-on-durante más de 100 horas, se forman espontáneamente en tres dimensiones (3D) vellosidades intestinales con uniones estrechas, bordes en cepillo apical, células proliferativas limitados a criptas basales, la producción de moco, aumento de la actividad de metabolización de fármaco (por ejemplo, el citocromo P450 3A4, CYP3A4), y la glucosa mejorada de la recaptación de 8. En este microambiente &#39;libre de gérmenes&#39;, fue posible co-cultivo el Lactobacillus rhamnosus GG probiótico o una formación terapéutico de una mezcla bacteriana probiótica con las células epiteliales de acogida para un máximo de dos semanas 5,10. En este estudio, se describe el protocolo detallado para llevar a cabo anfitrión-gut microbioma co-cultivo en el dispositivo gut-on-a-chip para un periodo prolongado. Además, se discuten los problemas y retos críticos potenciales para ser considerado para una amplia aplicación de este alojamiento microbioma-co-cultivo protocolo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) que contiene 25 mM de glucosa y 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Caliéntalo a 37 &deg; C en un baño de agua.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilos MRS caldo</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Funciona el autoclave a 121 &deg; C durante 15 min.</td></tr><tr><td>Poly(dimetilsiloxano)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/w), PDMS : agente curativo</td></tr><tr><td>Caco-2BBE línea de carcinoma colorrectal humano Centro de</td><td>Enfermedades Digestivas</td><td></td><td>de Harvard Adenocarcinoma colorrectal humano&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20% (v/v) en DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina-glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Dilución 1/100 en DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato Sondas</td><td>moleculares</td><td>D1306</td><td>Tinción de núcleos</td></tr><tr><td>Conjugado con faloidina-CF647 (25 unidades/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>Tinción</td></tr> <tr>con F-actina<td>Sistema de tensión Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Movimiento de trenzado similar al peristaltismo (10% de deformación celular, frecuencia de 0,15 Hz)</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertida</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging, DIC</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, fluorescencia</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Activación superficial del colágeno tipo I del chip intestinal</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01 Componente de</td><td>matriz extracelular para cultivo celular en el chip</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td></td><td>354234 Componente de matriz extracelular para cultivo celular en chip</td></tr><tr><td>Jeringa desechable de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Inyección de células y medios</td></tr><tr><td>25 G Aguja de 5/8</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Inyección de células y medios</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa Braintree</td><td>Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Equipo de inyección en el chip</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>Una formulación de 8 microbios intestinales comensales diferentes</td></tr><tr><td>Medio Clostridial reforzado</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Medio de cultivo de bacterias anaeróbicas</td></tr><tr><td>Sistema de contenedores anaerobios GasPak EZ con indicador</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Sobre generador de gas anaeróbico&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 4%</td> Ciencia de la <td>microscopía electrónica</td><td>157-4-100</td><td>Fijación de las células para la tinción</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Permeabilización de las células</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Agente bloqueante para la tinción de las células</td></tr><tr><td>Tratador de corona</td><td>Productos electrotécnicos</td><td>BD-20AC</td><td>Generador de plasma para la fabricación del chip</td></tr><tr><td>Steriflip&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Desgasificación de todo el medio de cultivo</td></tr><tr><td>Hemocitómetro desechable</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>Para el recuento manual de células</td></tr></tbody></table>

co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos villi en una gut-on-a-chip dispositivo de microfluidos

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de múltiples especies microbioma intestinal humano con vellosidades intestinales microconstruidos en un dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nosotros recapitular la interfaz de tejido lumen capilar intestinal en un dispositivo de microfluidos, donde las deformaciones mecánicas y fisiológicas flujo de cizallamiento del fluido se aplican constantemente para imitar el peristaltismo. En el microcanal lumen, células epiteliales intestinales Caco-2 humanas se cultivan para formar un epitelio de las vellosidades &#39;libre de gérmenes&#39; y regenerar pequeñas vellosidades intestinales. células microbianas Pre-cultivadas se inoculan en el lado del lumen para establecer un ecosistema huésped-microbio. Después de células microbianas se adhieren a la superficie apical de las vellosidades, flujo de fluido y deformaciones mecánicas se reanudan a producir un microambiente de estado estacionario en el que se suministra constantemente medio de cultivo fresco y las bacterias no unidas (así como los residuos bacterianos) se eliminan de forma continua. Después de co-cultivo prolongado fdía ROM a semanas, se encuentran varios microcolonias que se encuentra de forma aleatoria entre las vellosidades, y ambos microbiana y células epiteliales permanecen viables y funcional para al menos una semana en cultivo. Nuestro protocolo de co-cultivo se puede adaptar para proporcionar una plataforma versátil para otros ecosistemas huésped-microbioma que se pueden encontrar en diversos órganos humanos, que pueden facilitar el estudio in vitro de la función del microbioma humano en la organización de la salud y la enfermedad.

Para emular el ecosistema anfitrión-microbioma intestinal humano in vitro, es necesario desarrollar un protocolo experimental para reconstituir el estable a largo plazo co-cultivo de las bacterias intestinales y células epiteliales intestinales humanas en condiciones fisiológicas como la mecánica peristaltismo similar y el flujo de fluido. Aquí, utilizamos un microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cultivo de células ...

Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar el crecimiento de vellosidades de células intestinales humanas bajo movimientos y flujo similares al peristaltismo en un dispositivo microfluídico tipo intestino-en-un-chip, así como mostrar cómo co-cultivar estas células con microbioma intestinal vivo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología, la microbiología clínica y las ciencias farmacéuticas para identificar los mecanismos de las enfermedades y validar la eficacia y toxicidad de nuevos compuestos farmacéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden establecer in vitro un ecosistema viable y funcional del intestino humano posmicrobioma mediante un sistema microfisiológico.Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse a enfermedades como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn, ya que el cultivo celular estable en co-cultivo con el microbioma puede emular las complejidades de estas enfermedades. Aunque este método puede proporcionar una visión detallada de las interacciones complejas entre el microbioma intestinal y el sistema inmunitario en el intestino, también puede aplicarse a otros sistemas orgánicos donde existen interacciones entre el hospedador y los microorganismos, como la piel, el tracto genital o la cavidad oral. Para comenzar, prepare el dispositivo microfluídico tipo intestino-en-un-chip según se describe en el protocolo de texto adjunto.El dispositivo consta de un polímero de silicio transparente permeable a los gases que contiene dos microcanales paralelos, separados por una membrana porosa de PDMS flexible. En cada lado de los canales hay cámaras de vacío, que pueden utilizarse para aplicar tensión mecánica cíclica. Esterilice el dispositivo utilizando una jeringa de un mililitro para hacer pasar etanol al 70 % a través de los canales.A continuación, seque el dispositivo en un horno seco a 60 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, exponga el microsistema de intestino-sobre-un-chip, junto con sus tubos conectados, simultáneamente a luz UV y ozono durante 40 minutos. Enfrié el dispositivo manteniéndolo bajo la luz UV de una cabina de seguridad biológica durante 15 minutos.A continuación, cargue 100 microlitros de una solución codificante de matriz extracelular en una jeringa de un mililitro y dispénsela en el microcanal superior del dispositivo. Repita este proceso para recubrir también el microcanal inferior. Coloque todo el montaje en un incubador humidificado con 5%CO2 a 37 grados Celsius durante una hora.Durante la incubación, desgasifique el medio de cultivo completo precalentado pasándolo a través de un filtro de 0,45 micrones en un sistema de filtración de 50 mililitros durante un minuto. Toque suavemente el medio filtrado durante un minuto para eliminar cualquier burbuja o gas disuelto en el medio. Luego, transfiera el medio completo desgasificado a dos jeringas desechables de tres mililitros e incube las jeringas durante una hora.A continuación, conecte las jeringas a los microcanales superior e inferior del dispositivo tipo intestino-en-un-chip y elimine la solución de codificación haciendo pasar medio completo a través de los microcanales superior e inferior con un pulso suave. Luego, utilice una bomba de jeringa para hacer fluir medio de cultivo celular completo desgasificado hacia el microcanal superior del dispositivo, mientras incuba el chip durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂. Recoleccione células epiteliales intestinales Caco-2 de un frasco T75 completamente confluyente, primero lavando las células con 10 mililitros de PBS sin calcio ni magnesio.Luego, aspire el PBS y repita el lavado otras dos veces. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina-EDTA al 0,05 % e incube el frasco durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular completo precalentado y pipetee la suspensión celular de arriba abajo entre tres y cinco veces antes de transferirla a un tubo de centrífuga.Centrifugar la suspensión celular. Luego, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células a 150.000 células por centímetro cuadrado en medio completo precalentado. Aspirar 500 microlitros de la suspensión celular en una jeringa desechable de un mililitro, equipada con una aguja de 25 gauge, 5/8 de pulgada.A continuación, dispense 100 microlitros de la suspensión celular en el microcanal superior a través del tubo de salida. Luego, cierre con pinzas de oficina todas las entradas y salidas conectadas a los microcanales superior e inferior. Incube todo el montaje durante una hora para permitir que las células epiteliales intestinales se adhieran a la superficie de la membrana porosa.A continuación, retire las pinzas y conecte el tubo del canal superior a una jeringa llena de medio de cultivo que haya sido colocada en una bomba de jeringa. Reanude el flujo de medio de cultivo hacia el microcanal superior a 30 microlitros por hora hasta que las células formen una monocapa intacta. Una vez que las células formen una monocapa, conecte el canal inferior a la segunda jeringa y perfunda el medio de cultivo en ambos microcanales, el luminal superior y el capilar inferior, al mismo flujo de 30 microlitros por hora.Para crear un movimiento similar al peristáltico en el chip, primero encienda la bomba de vacío. Conecte las cámaras de vacío del dispositivo al controlador de vacío mediante tubos con un conector de acero inoxidable. Luego, configure el controlador para que proporcione un movimiento cíclico de estiramiento del 10 % de la deformación media de la célula a una frecuencia de 0,15 hercios y, a continuación, haga clic en iniciar.Mantenga el flujo de medio de cultivo hacia los microcanales superior e inferior en presencia de deformaciones mecánicas durante al menos 80 horas para inducir el crecimiento de vellosidades. Prepare una mezcla 50/50 de caldo MRS para Lactobacilos autoclaveado y medio clostridial reforzado. Luego, re-suspenda una mezcla bacteriana probiótica liofilizada en 10 mililitros de la mezcla.Mida la densidad óptica de la mezcla a 600 nanómetros y ajuste la densidad celular final a aproximadamente 0,2 unidades de densidad óptica. Ali-cuote tres mililitros de la suspensión celular microbiana ajustada en tubos estériles desechables de 10 mililitros. Coloque los alícuotas en un recipiente anaerobio y agregue dos sobres de generación de gas anaerobio en el recipiente.Cierre herméticamente la tapa del recipiente e incube el conjunto sin agitar en una incubadora durante la noche. A continuación, prepare medio de cultivo celular sin antibióticos y desgasificado, y llénelo en jeringas desechables de tres mililitros. Transfiera el dispositivo de intestino-en-un-chip que contiene vellosidades microingenierizadas al gabinete de seguridad biológica.Retire las jeringas conectadas a los microcanales superior e inferior del dispositivo y sustitúyalas por jeringas que contengan medio de cultivo celular sin antibióticos y desgasificado. Una vez finalizado, coloque el dispositivo nuevamente en el incubador de CO₂. A continuación, haga fluir el medio de cultivo sin antibióticos a través del dispositivo durante 12 horas antes de inocular el microbioma.A continuación, centrifugue la mezcla de células bacterianas probióticas previamente cultivadas. Aspire el sobrenadante y luego re-suspenda las bacterias en DMEM sin antibióticos. Cargue aproximadamente 100 microlitros de esta suspensión celular en una jeringa de un mililitro acoplada a una aguja de calibre 25, de 5/8 de pulgada.Infunda las bacterias en el lado luminal del microcanal que contiene las vellosidades intestinales previamente libres de gérmenes. Permita que las células microbianas se adhieran a la superficie apical de las vellosidades intestinales durante una hora y media sin flujo, mediante el pinzamiento del tubo. Luego, perfunda el medio de cultivo sin antibióticos previamente calentado en ambos microcanales, superior e inferior, a 40 microlitros por hora con deformaciones rítmicas cíclicas.Este protocolo de co-cultivo permite la colonización estable de múltiples especies de bacterias probióticas en el espacio intervelloso. Las microcolonias bacterianas viables pueden mantenerse durante hasta dos semanas en co-cultivo. Se muestra aquí una co-cultivo diferente que consta de E. coli marcado con GFP y vellosidades intestinales.La ampliación de alto poder muestra claramente la ubicación de las microcolonias bacterianas en el punto temporal de 72 horas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar suavemente y lentamente el medio de cultivo en los canales microfluídicos para evitar dañar la monocapa de células epiteliales en las primeras etapas del cultivo. A partir de este método, un método de co-cultivo con células inmunitarias humanas también puede proporcionar algunas pistas sobre cómo el microbioma puede interactuar con el sistema inmunológico y sus influencias en la homeostasis y la salud intestinal óptima.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reconstituir el microentorno del intestino humano y demostrar el cultivo conjunto del microbioma y las vellosidades intestinales humanas in vitro. Trabajar con bacterias patógenas y células humanas es extremadamente peligroso, así que no olvide trabajar dentro de una cabina de seguridad biológica.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

En este video, describimos la metodología para establecer un sistema de cultivo de órganos intestinales ex vivo para estudiar las interacciones entre fragmentos de tejido intestinal de ratón y bacterias intestinales específicas. El dispositivo consta de dos pares de puertos de entrada-salida, el primero que conecta la luz del tejido intestinal y suministra la suspensión bacteriana específica en él, y el segundo que suministra continuamente medios a los pocillos del dispositivo para mantener la...

Un sistema de cultivo de órganos intestinales ex vivo para estudiar las interacciones entre el huésped y la microbiota

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Este artículo presenta un método único para analizar las interacciones huésped-microbioma utilizando un nuevo sistema de cultivo de órganos intestinales para experimentos ex vivo.

Un sistema de cultivo de órganos intestinales intestinales para analizar las interacciones huésped-microbiota

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Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

neuroHuMiX es un modelo avanzado de intestino en un chip para estudiar las interacciones de células bacterianas, epiteliales y neuronales en condiciones de cocultivo proximales y representativas. Este modelo permite desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la comunicación entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso.

Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

La integración de organoides intestinales caninos y un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ofrece modelos traslacionales relevantes para las enfermedades intestinales humanas. Los protocolos presentados permiten la morfogénesis en 3D y el modelado dinámico in vitro del intestino, lo que ayuda en el desarrollo de tratamientos efectivos para enfermedades intestinales en perros y humanos con One Health.

Morfogénesis tridimensional en el intestino canino en un chip utilizando organoides intestinales derivados de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

Este artículo describe un protocolo para crear un dispositivo de cultivo microfluídico de vagina en un chip (Vagina Chip) que permite el estudio de las interacciones del huésped humano con un microbioma vaginal vivo en condiciones microaerofílicas. Este chip se puede utilizar como herramienta para investigar enfermedades vaginales, así como para desarrollar y probar posibles contramedidas terapéuticas.

Modelado de microambientes vaginales sanos y disbióticos en una vagina humana en un chip

Nuestro protocolo detallado describe la creación y el uso del modelo avanzado de intestino en chip, que simula la mucosa intestinal humana con estructuras 3D y varios tipos de células, lo que permite un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias y las funciones celulares en respuesta a la colonización microbiana.

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Aprende a co-cultivar microbioma intestinal y células epiteliales usando un dispositivo microfluídico gut-on-a-chip. Este método permite estudiar interacciones huésped-microbioma y avanzar en investigación gastroenterológica y desarrollo de fármacos.

Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos

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