Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar y determinar el perfil de tamaño de vesículas extracelulares utilizando la técnica de detección resistiva ajustable de pulsos. El enfoque estándar es comparar las mediciones de bloqueo de corriente obtenidas de vesículas extracelulares purificadas con las obtenidas de estándares de microesferas de poliestireno. Un segundo enfoque para caracterizar las vesículas extracelulares consiste en agregar microesferas de poliestireno directamente a la muestra, lo cual se utiliza cuando se trabaja con muestras complejas, como vesículas extracelulares no purificadas.

En medio de cultivo celular, los datos resultantes caracterizan el tamaño y el número de las vesículas extracelulares, ya sean purificadas o no purificadas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el inmunoblot o la citometría de flujo de vesículas extracelulares unidas a microesferas de látex, es que este método caracteriza directamente las partículas en fluidos biológicos sin necesidad de aislamiento físico ni etiquetado. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las vesículas extracelulares son heterogéneas en tamaño.

Al intentar detectar las vesículas más pequeñas, las vesículas más grandes pueden obstruir el nanoporo. Hemos añadido algunos consejos y trucos prácticos al protocolo para regresar rápidamente a condiciones funcionales. Intentamos reducir la producción de vesículas extracelulares y necesitábamos un método para cuantificar la concentración de vesículas en cultivo celular.Snet.

En la búsqueda de métodos para caracterizar nanopartículas, encontramos el TRPS y modificamos sus protocolos para que fueran más adecuados para la caracterización de sobrenadantes de cultivos celulares y otros fluidos biológicos. Comience conectando el instrumento TRPS a una computadora con el software Eyes on Control Suite instalado. Asegúrese de minimizar las interferencias eléctricas, tal como se describe en el protocolo escrito.

Ahora, elija el tamaño del nanoporo. Un NP 100 es la mejor opción para vesículas de 70 a 200 nanómetros, mientras que un NP 150 puede utilizarse para vesículas de 85 a 300 nanómetros. Un NP 200 es más adecuado para medir vesículas de 100 a 400 nanómetros.

Luego, seleccione las partículas de calibración de poliestireno complementarias para la NP 100 y las partículas de calibración CPC 100 para la NP 200. Utilice las partículas de calibración CPC 200. Vortex las partículas de calibración durante 30 segundos.

Si aún están agregados, utilice la sonicación y luego diluya las partículas de calibración en PBS hasta la concentración objetivo. Según el tamaño de los nanoporos, el volumen final debe ser de al menos 40 microlitros. Ahora humedezca la celda de fluido inferior del instrumento aplicando 78 microlitros de PBS y elimine inmediatamente el líquido.

Esto reduce el riesgo de formación de burbujas debajo del nanoporo. A continuación, coloque el nanoporo en los brazos del instrumento. Mida la distancia entre los dos brazos opuestos utilizando calibradores digitales.

Introduzca este valor en el software en el campo denominado stretch y, una vez ingresado, haga clic en calibrate stretch utilizando la rueda lateral que controla la distancia entre los brazos opuestos. Estire el nanoporo hasta 47 milímetros. Una vez estirado al tamaño deseado, vuelva a aplicar 78 microlitros de PBS en la celda de fluido inferior.

Inicie el proceso de calibración colocando la celda de fluido superior sobre el nanoporo y fijando la jaula de blindaje. A continuación, agregue 40 microlitros de partículas de calibración diluidas en la celda de fluido superior. Ahora aplique al menos 0.8 kilopascales de presión positiva.

Utilizando el módulo de presión variable o VPM, seleccione un voltaje positivo y haga clic en encender. Luego reduzca lentamente el estiramiento mientras analiza el bloqueo. Eventos causados por las partículas de calibración.

A medida que el estiramiento disminuye, la altura del bloqueo aumentará gradualmente y, por lo tanto, la relación señal-ruido mejorará. Aumentar el voltaje también puede incrementar la altura del bloqueo, pero asimismo puede generar más ruido RMS. Deje de reducir el estiramiento cuando los bloqueos observados superen adecuadamente los niveles de fondo, tal como se indica en el panel de la traza de señal.

En segundo lugar, observe la tasa de partículas. Sin embargo, este parámetro tiene un límite menos estricto. La tasa de partículas debería ser idealmente de al menos 100 por minuto.

Sin embargo, si la tasa de partículas es mayor de 2000 por minuto, diluya la muestra y recalibre el instrumento. Una tasa tan alta puede provocar mediciones inexactas en esta demostración. Se caracterizan vesículas extracelulares previamente purificadas de una línea celular de tumor cerebral.

Comience cargando las partículas de calibración en la celda superior de la prensa de fluido. Encienda y luego aplique presión utilizando el VPM y registre al menos 500 partículas de datos aquí. Se aplica una presión de 0,8 kilopascal.

Opcionalmente, también se puede realizar una medición de múltiples presiones para hacer esto: aumente la presión aplicada y registre un segundo archivo de calibración. Los incrementos de presión deben ser de al menos 0,2 kilopascales. Ahora, retire la muestra de la celda superior y lave la celda tres veces con 100 microlitros de PBS por lavado. Después de los lavados, seque la celda de fluido superior con papel sin pelusas.

Agregue a continuación la muestra experimental. La corriente de referencia debe estar dentro del 3 % de la corriente observada al medir las partículas de calibración. Si no es así, golpee o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua desionizada.

Si la corriente observada es adecuada, aplique exactamente las mismas presiones que se aplicaron a las partículas de calibración. Luego registre al menos 500 partículas y guarde el archivo de datos. Si se produce una interrupción repentina en la detección de partículas, una caída en la corriente de línea base o un aumento súbito en el ruido RMS, detenga la grabación y trate de desobstruir el nanoporo.

Como antes, pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo. Toque o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua desionizada. Otra estrategia consiste en aumentar el estiramiento del nanoporo hasta 47 milímetros y maximizar la presión del VPM durante aproximadamente cinco minutos.

Como esto también puede desconectar el NPO en el software. Vaya a la pestaña de análisis de datos e inicie el procesamiento de los datos haciendo clic derecho en la opción de archivos sin procesar y seleccione la opción de procesar archivos. Luego, para acoplar los archivos de muestra y de calibración, haga clic en la casilla de verificación junto a la muestra.

En la columna calibrada, seleccione los archivos correspondientes y acepte. Las opciones. El software mostrará diferentes características de la muestra, como tamaño, distribución, duraciones de la línea base, anchura total, máximos a la mitad y análisis de concentración.

El siguiente enfoque se utiliza para muestras como fluidos biológicos que provocan un taponamiento excesivo con el método estándar durante la preparación: centrifugue al menos 50 microlitros de cultivo celular. El sobrenadante, que contiene las vesículas extracelulares, durante siete minutos a 300 G. Prepare también un control con medio únicamente, de la misma manera, tanto para la muestra como para el control. Transfiera 20 microlitros del sobrenadante a tubos nuevos y agregue 20 microlitros de PBS y 10 microlitros de la solución stock de esferas de poliestireno de 335 nanómetros diluidas a 10 millones de esferas por mililitro.

Ahora configure el instrumento como antes, utilizando un nanoporo NP 200 y mida la muestra de control que contiene solo perlas en medio. Primero, para mayor precisión, la detección de fondo de partículas pequeñas no perla debe minimizarse a menos del 10 % de las detecciones de perlas. A continuación, mida cada muestra una vez antes de registrar los réplicas.

Esto distribuirá las condiciones variables de los nanoporos entre las muestras. Cada muestra debe medirse tres veces, finalizando siempre con la re-medición de la muestra que contiene solo las perlas de calibración. Posteriormente, durante el análisis de datos, utilice un software de hojas de cálculo para realizar los cálculos de concentración.

En el protocolo escrito se incluye un ejemplo de cálculo. Se purificaron vesículas extracelulares del cultivo celular de U 87 M-G-E-G-F-R-V tres, a partir del sobrenadante mediante ultracentrifugación, y luego se midieron utilizando el protocolo descrito con cuentas de calibración de 115 nanómetros. Se obtuvo una distribución de tamaños para las vesículas extracelulares.

Las vesículas extracelulares también se cuantificaron directamente a partir del sobrenadante del cultivo celular de glioblastoma, utilizando el enfoque alternativo que añade al ejemplo un patrón conocido. Se observaron dos poblaciones de nanopartículas. Las vesículas extracelulares más pequeñas y el patrón conocido más grande permitieron, mediante la estimación del tamaño de las dos poblaciones basada en el patrón conocido, identificar a la población de vesículas como mayor de 140 nanómetros.

Pueden haberse detectado vesículas extracelulares más pequeñas utilizando una abertura de nanoporo más pequeña, pero habría habido más obstrucciones. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en uno a cuatro horas, dependiendo del número de muestras analizadas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las muestras pueden requerir ajustes septales al protocolo.

Por ejemplo, las muestras compuestas por vesículas más grandes pueden requerir el uso de nanoporos más grandes a un estiramiento relativamente elevado, y además las mediciones pueden facilitarse mediante filtración o centrifugación de las muestras para eliminar los restos celulares, los cuales pueden obstruir el nanoporo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar vesículas extracelulares utilizando TRPS. Dependiendo de su muestra de vesículas extracelulares, puede aplicar el protocolo estándar o utilizar el método ajustado de adición de partículas de calibración.