Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar y dimensionar el perfil de las vesículas extracelulares utilizando la detección de pulso resistivo sintonizable. El enfoque estándar consiste en comparar las mediciones actuales de bloqueo tomadas de vesículas extracelulares purificadas con las tomadas de patrones de perlas de poliestireno. Un segundo enfoque para caracterizar las vesículas extracelulares es añadir a la muestra perlas de poliestireno, que se utiliza cuando se trabaja con muestras complejas como las vesículas extracelulares no purificadas.

En el medio de cultivo celular, los datos resultantes caracterizan el tamaño y el número de vesículas extracelulares, ya sean purificadas o no purificadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el western blot o la citometría de flujo de vesículas ex extracelulares unidas a perlas de látex, es que este método caracteriza las partículas directamente en los fluidos biológicos sin necesidad de aislamiento físico o marcaje. Por lo general, los individuos nuevos en el método tendrán dificultades porque las vesículas extracelulares son de tamaño heterogéneo.

Al tratar de detectar las vesículas más pequeñas, las vesículas más grandes pueden obstruir el nanoporo. Hemos añadido algunos consejos y trucos prácticos al protocolo para volver rápidamente a las condiciones viables. Intentamos reducir la producción de vesículas extracelulares y necesitábamos un método para cuantificar la concentración de vesículas en cultivo celular. Snet.

En la búsqueda de métodos para caracterizar nanopartículas de nanos, nos encontramos con TRPS y modificamos sus protocolos para que fueran más adecuados para la caracterización de SLES y el cultivo celular. S sobrenadantes y otros fluidos biológicos Comience conectando el instrumento TRPS a una computadora con los ojos en el software de la suite de control instalado en él. Asegúrese de minimizar la interferencia eléctrica como se describe en el protocolo de texto.

Ahora, elige el tamaño de Nanopore. Un NP 100 es la mejor opción para vesículas de 70 a 200 nanómetros, mientras que un NP 150 se puede utilizar para vesículas de 85 a 300 nanómetros. Un NP 200 es más adecuado para medir vesículas de 100 a 400 nanómetros.

A continuación, seleccione las partículas de calibración de poliestireno complementarias para el NP 100 y el NP 150, seleccione las partículas de calibración CPC 100 para el NP 200. Utilice partículas de calibración CPC 200. Agite las partículas de calibración durante 30 segundos.

Si aún se agregan, utilice la sonicación y luego diluya las partículas de calibración en PBS hasta la concentración objetivo. Según el tamaño de los nanoporos, el volumen final debe ser de al menos 40 microlitros. Ahora humedezca la celda de fluido inferior del instrumento aplicando 78 microlitros de PBS y retirándolo inmediatamente.

Esto reduce el riesgo de que se formen burbujas debajo del nanoporo. A continuación, coloque el Nanopore en los brazos del instrumento. Mida la distancia entre los dos brazos opuestos usando calibradores digitales.

Ingrese este valor en el software en el campo llamado estiramiento y, una vez ingresado, haga clic en calibrar estiramiento usando la rueda lateral que controla la distancia entre los brazos opuestos. Estire el nanoporo a 47 milímetros. Una vez estirado al tamaño, vuelva a aplicar 78 microlitros de PBS en la celda de líquido inferior.

Comience el proceso de calibración colocando la celda de fluido superior en el nanoporo y colocando la jaula de protección. A continuación, añada 40 microlitros de partículas de calibración diluidas en la celda de fluido superior. Ahora aplique al menos 0,8 kilopascales de presión positiva.

Usando el módulo de presión variable o VPM, seleccione un voltaje positivo y haga clic en activar. Luego reduzca lentamente el estiramiento mientras analiza el bloqueo. Eventos causados por las partículas de calibración.

A medida que disminuya el estiramiento, la altura del bloqueo aumentará gradualmente y, por lo tanto, la relación señal/ruido mejorará. El aumento del voltaje también puede aumentar la altura del bloqueo, pero también puede generar más ruido RMS. Deje de reducir el estiramiento cuando los bloqueos observados superen adecuadamente los niveles de fondo, como se indica en el panel de seguimiento de señal.

En segundo lugar, observe la tasa de partículas. Sin embargo, esto tiene un límite menos estricto. Lo ideal es que la velocidad de las partículas sea de al menos 100 por minuto.

Sin embargo, si la tasa de partículas es superior a 2000 por minuto, diluya la muestra y vuelva a calibrar el instrumento. Una tasa tan alta puede dar lugar a mediciones inexactas para esta demostración. Se caracterizan vesículas extracelulares previamente purificadas de una línea celular de tumor cerebral.

Comience cargando las partículas de calibración en la prensa de celda de fluido superior. Encienda y luego aplique presión con el VPM y registre al menos 500 partículas de datos aquí. Se aplica una presión de 0,8 kilopascales.

Opcionalmente, también se puede realizar una medición de presión múltiple para hacer esto, aumentar la presión aplicada y registrar un segundo archivo de calibración. Los incrementos de presión deben ser de al menos 0,2 kilopascales ahora, retire la muestra de la celda superior y lave la celda tres veces con 100 microlitros de PBS por lavado. Después de los lavados, limpie la celda de líquido superior con papel sin pelusa.

Agregue la muestra experimental a continuación. La corriente de referencia debe estar dentro del 3% de la corriente observada al medir las partículas de calibración. De lo contrario, golpee o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua di.

Si la corriente observada es buena, aplique exactamente las mismas presiones que se aplicaron a las partículas de calibración. A continuación, registre al menos 500 partículas y guarde el archivo de datos. Si hay una interrupción repentina de la detección de partículas, una caída en la corriente de referencia o un aumento repentino en el ruido RMS, detenga la grabación e intente desatascar el nanoporo.

Como antes, pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo. Golpee o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua desionizada. Otra estrategia es aumentar el estiramiento de los nanoporos hasta 47 milímetros y maximizar la presión del VPM durante unos cinco minutos.

Como esto también puede UNC desconectar el NPO en el software. Vaya a la pestaña analizar datos y comience a procesar los datos haciendo clic con el botón derecho en la opción de archivos sin procesar y seleccione la opción de procesar archivos. A continuación, para acoplar los archivos de muestra y calibración, haga clic en la casilla de verificación situada junto a la muestra.

En la columna calibrada, seleccione los archivos correspondientes y listo. Las opciones. El software mostrará diferentes características de la muestra como el tamaño, la distribución, las duraciones de referencia, el ancho completo, los medios máximos y el análisis de concentración.

El siguiente enfoque se utiliza para muestras como fluidos biológicos que conducen a una obstrucción excesiva utilizando el método estándar en la preparación, centrifugar al menos 50 microlitros de cultivo celular. Sobrenadante que contiene las vesículas extracelulares durante siete minutos a 300 Gs.También prepare un medio de control solo de la misma manera tanto para la muestra como para el control. Transfiera 20 microlitros del sobrenadante a tubos nuevos y agregue 20 microlitros de PBS y 10 microlitros de material de perlas de poliestireno diluido de 335 nanómetros a 10 millones de perlas por mililitro.

Ahora configure el instrumento como antes, utilizando un NP 200 Nanopore y mida la muestra de control de solo cuentas en medios. En primer lugar, para mayor precisión, la detección de fondo de pequeñas partículas que no forman cordones debe minimizarse a menos del 10% de las detecciones de cordones. Ahora, mida cada muestra una vez antes de grabar las réplicas.

Esto distribuirá las condiciones fluctuantes de los nanoporos sobre las muestras. Cada muestra debe medirse tres veces en todo el acabado volviendo a medir la muestra de solo cordón de calibración. Más tarde. Durante el análisis de datos, utilice un software de hoja de cálculo para realizar cálculos de concentración.

En el protocolo escrito se incluye un ejemplo de cálculo. Las vesículas extracelulares se purificaron a partir de un cultivo de tres células U 87 M-G-E-G-F-R-V, sobrenadante por ultracentrifugación, y luego se midieron utilizando el protocolo descrito utilizando cuentas de calibración de 115 nanómetros. Se obtuvo una distribución de tamaño para las vesículas extracelulares.

Las vesículas extracelulares también se cuantificaron directamente a partir del sobrenadante de cultivo de células de glioblastoma, utilizando el enfoque alternativo que aumenta la muestra con un estándar. Se observaron dos poblaciones de nanopartículas. Las vesículas extracelulares más pequeñas y el estándar conocido más grande, la estimación del tamaño de las dos poblaciones basada en el estándar conocido, identificaron la población de vesículas como mayor de 140 nanómetros.

Es posible que se hayan detectado vesículas extracelulares más pequeñas utilizando una abertura de nanoporos más pequeña, pero habría habido más obstrucción una vez que se dominaron. Esta técnica se puede realizar en una a cuatro horas dependiendo del número de muestras analizadas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las muestras pueden requerir ajustes septales en el protocolo.

Por ejemplo, las muestras que consisten en vesículas más grandes pueden requerir el uso de nanoporos más grandes en un tramo relativamente grande, y también las mediciones se pueden facilitar filtrando nuestra centrifugación de muestras para eliminar los desechos celulares, que pueden cronometrar el nanoporo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar vesículas extracelulares usando TRPS. Dependiendo de su muestra de vesícula extracelular, puede aplicar el protocolo estándar o utilizar el método de pico ajustado.