Name: Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar y perfilar el tamaño de vesículas extracelulares mediante sensibilización por pulso de resistencia ajustable (TRPS) en fluidos biológicos. Este método permite caracterizar partículas directamente sin necesidad de aislamiento previo ni etiquetado.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Protocolo de Operación Estándar 1.1 Configuración del instrumento y la preparación de muestras <ol><li> Conecte el instrumento a un ordenador con el software Izon Control Suite instalado. </li><li> Elija el tamaño nanoporo utilizar: para el tamaño y la concentración medida de los vehículos eléctricos una NP150 (meta rango de tamaño de 85 a 300 nm) o NP200 (meta rango de tamaño de 100 a 400 nm) se utilizan con más frecuencia. Cuando se trabaja con vehículos eléctricos que han sido aislados usando un protocolo que implica la eliminación de los vehículos eléctricos más grandes, por ejemplo haciendo pasar la muestra a través de un filtro de 220 nm, un poro NP100 (objetivo intervalo de tamaño de 70 a 200 nm) se puede utilizar. Cuando se trabaja con los vehículos eléctricos en una muestra biológica o vehículos eléctricos aislados usando un protocolo diferente, el NP200 se puede utilizar, ya que puede quedar atascado con menos frecuencia. Otros nanoporos como el NP300 (rango objetivo tamaño de 150 a 600 nm) o la NP400 (objetivo intervalo de tamaño de 200 a 800 nm), o nanoporos aún más grandes, se pueden utilizar para los tipos más grandes de los vehículos eléctricos. </li><li> Elija el calibr poliestirenopartículas ación que complementan el nanoporo seleccionado en el paso 1.1.2. Para una NP100, NP150 y NP200 nanoporo utilizan el CPC100, partículas CP100 y CPC200, respectivamente. Para la estimación del tamaño exacto, asegurar que las partículas de calibración tienen un tamaño similar a las partículas desconocidas. </li><li> Para asegurar la homogeneidad de las partículas de calibración, brevemente vórtice (30 seg). Opcionalmente, aplicar sonicación para eliminar los agregados. </li><li> Diluir las partículas de calibración en PBS a la concentración objetivo en un volumen de al menos 40 l. Nota: La concentración objetivo varía según el nanoporo seleccionado en el paso 1.1.2. Concentraciones objetivo se suministran con los nanoporos. </li><li> Pega y despega directamente 78 l de PBS en la celda de fluido inferior; esta humectación de la celda inferior fluido reduce el riesgo de formación de burbujas de aire bajo el nanoporos cuando se aplica un electrolito a la celda de fluido inferior cuando el nanoporo está en posición. </li><li> Coloque el nanoporo en los 4 brazos del instrumento. Usolos calibres digitales para medir la distancia entre dos brazos opuestos y entran en la distancia en mm en el campo de entrada &quot;Stretch&quot; y haga clic en &quot;calibrar tramo&quot; para calibrar el tramo nanoporo. </li><li> Estirar el nanoporo a 47 mm, girando la rueda lateral y por lo tanto aumentar la distancia entre los brazos opuestos del instrumento, antes de volver a 78 l de PBS a la celda de fluido inferior. Nota: La interferencia eléctrica puede afectar sustancialmente la calidad de las mediciones. Al utilizar un ordenador para ejecutar el software Izon Control Suite, asegúrese de que el ordenador portátil está conectado a la red eléctrica mediante un enchufe con conexión a tierra y un enchufe. Los teléfonos móviles mantienen cerca del instrumento también puede ser una fuente de interferencia eléctrica. Se observa interferencia eléctrica como picos constantemente repetidas en la actual línea de base, a menudo con la raíz cuadrada media (RMS) del ruido&gt; 10 pA. Nota: Casi cualquier tampón puede ser usado para diluir las partículas de calibración y EVS para TRPS CARACTERÍSzación. La presencia de sales es un requisito previo para el establecimiento de una corriente eléctrica. Para las mediciones de EV utilizar PBS como tampón. Partículas de calibración siempre debe ser diluido en el mismo tampón que los vehículos eléctricos para garantizar mediciones precisas. </li></ol> 1.2. Determine los ajustes óptimos para la medición Nota: Antes de grabar, es importante establecer los valores óptimos de medición. La magnitud bloqueo causado por una partícula que pasa a través de la nanopore depende del estiramiento aplicado y el voltaje aplicado. Para mediciones confiables del ruido RMS debe ser &lt;10 pA y la magnitud del bloqueo modo debe ser&gt; 0,1 nA. <ol><li> Coloque la cámara de fluido superior y blindaje jaula en el nanoporo e introducir 40 l de partículas de calibración diluidos en la celda de fluido superior. Utilice el VPM aplicar ≥0.8 presión kPa positivo. </li><li> Reducir el estiramiento aplicado lentamente hacia 44 mm, mientras que el análisis de los eventos de bloqueo causados ​​por la calibraciónpartículas. Nota: Cuando se reduce el diámetro de poro el movimiento de partículas a través de la nanopore será menos probable y por lo tanto la tasa de partículas disminuirá. Sin embargo, debido al aumento de bloqueo relativo de los poros un evento de bloqueo se producirá más grande resultando en una mejor relación señal-ruido. El aumento de la tensión puede aumentar aún más la magnitud bloqueo, pero también puede aumentar el ruido RMS. </li><li> Reducir el tramo hasta que se observaron eventos de bloqueo apropiados (Figura 1c) en el panel de &quot;Signal rastro&quot;. (Modo de&gt; 0,1 nA) y la tasa de partícula correspondiente es&gt; 100 / min. Nota: La tasa de partícula es menos estricto de corte, sin embargo, como las mediciones de al menos 500 partículas son ideales, las tasas de partícula de &lt;100 / min causarán grabación duraciones de al menos 5 min. Tipos de partículas superiores a 2,000 / min pueden producir mediciones menos precisas (si está presente, se debe realizar dilución de la muestra). </li></ol> 1.3 Medición de la calibraciónLas partículas, lavado de la cámara de fluido de Uper y medición de la muestra <ol><li> En esta sección los vehículos eléctricos a partir del sobrenadante de cultivo de células del glioblastoma multiforme línea celular U87-MG / EGFRvIII se caracterizan. El aislamiento y la preparación de estos vehículos eléctricos se ha descrito anteriormente y se visualizaron 18. </li><li> Coloque las partículas de calibración en la celda fluido superior. Aplique presión (por ejemplo 0,8 kPa) con el VPM y registro&gt; 500 partículas. </li><li> Si se realiza una medición de multi-presión, aumente la presión aplicada (por ejemplo, a 1,0 kPa) y grabar un segundo archivo de calibración. Se requiere un mínimo de 0,2 kPa diferencia: Nota. </li><li> Retirar la muestra de calibración de la celda de fluido superior. Lave la celda fluido superior 3 veces con 100 l de PBS para eliminar las partículas residuales. Antes de la introducción de la muestra en la celda de fluido superior, utilice paño libre de pelusa para eliminar el PBS residual de la célula de fluido superior. </li><li> Introducir la muestra a la celda de fluido superior. Asegúrese de que la corriente de línea de base es menos de 3% de la corriente de línea de base observado en la medición de las partículas de calibración. Si no menos de 3%, aplicar la estrategia se describe a continuación para estabilizar la corriente de línea de base. Aplicar las presiones exactas que se aplican a las partículas de calibración y registrar los archivos de ejemplo. Nota: La línea de la velocidad de las partículas debe mostrar la detección de partículas constante (Figura 2a). En caso de interrupción súbita de la detección de partículas, una caída repentina de la corriente de línea de base, o un aumento repentino en el ruido RMS, el poro puede estar obstruido; por lo tanto, hacer una pausa en la grabación. Con el fin de restaurar la línea de base, toque o gire la tapa de protección, aplicar el émbolo, o eliminar por completo la nanoporo y lavarlo con agua desionizada y vuelva a colocarla en el instrumento. Nota: Alternativamente, aumentar el estiramiento de nanoporos a 47 mm en combinación con la presión máxima de la VPM durante aproximadamente 5 min. </li></ol> Análisis de datos 1.4 <ol><li> Haga clic en el &quot;; Analizar ficha Datos &quot;para entrar en la sección de análisis del software. Procesar la calibración y archivos de ejemplo, haga clic en el &quot;Proceso de Archivos&quot; &quot;sin procesar archivos&quot; y seleccionar. </li><li> Haga clic en la casilla junto a la muestra en la columna &quot;calibrado&quot; para acoplar los archivos de ejemplo para las grabaciones de calibración. Seleccionar archivos de ejemplo y de calibración correspondientes y haga clic en &quot;Aceptar&quot;. Nota: cuando se utiliza la opción de calibración multi-presión seleccionar la pestaña &quot;Calibración Multi-presión&quot; de la izquierda para par de muestras múltiples a múltiples archivos de calibración. </li><li> Una vez acoplado con éxito, el software Izon Control Suite mostrará diferentes características de la muestra, tales como un tamaño de distribución (Figura 2b), las duraciones de referencia, la mitad del máximo ancho (FWHM) y un análisis de concentración. Opcionalmente: Para cada muestra, los puntos de datos individuales se pueden exportar como un archivo separado por comas. </li></ol> 2.Protocolo LTERNATIVA - El clavar muestras con bolas de calibración Nota: En general, el procedimiento operativo estándar se puede utilizar cuando se trabaja con los vehículos eléctricos aislados. Cuando se trabaja con los vehículos eléctricos no aislados en muestras biológicas, o preparaciones EV aisladas contaminadas con grandes agregados de proteínas, de utilizar el instrumento puede ser un reto. Estos desafíos consisten principalmente en una alta tasa de bloqueo de nanoporos (caída repentina de la corriente de línea de base), la incapacidad para recuperar corrientes de línea de base dentro del 3% de la medición de calibración o diferencias significativas en las tasas de partícula entre muestras idénticas (Figura 3A). Para las muestras que presentan estas dificultades un protocolo alternativo para cuantificar los vehículos eléctricos se desarrolló 17. Esta metodología se basa en la introducción de grandes bolas de calibración de poliestireno en la muestra de interés (Figura 3b). Un procedimiento detallado para este protocolo alternativo se discute a continuación. 2.1. MuestraPreparación Nota: En la preparación de las muestras usando el método alternativo, se desea establecer una relación de-EV-a gota de alrededor de 1. También, es esencial incluir un &quot;cordón de calibración sólo &#39;de la muestra, para permitir la exacta&#39; gating&quot; de la bolas de calibración y para determinar el número de partículas de fondo (por ejemplo, agregados de proteínas) presente en el tampón. <ol><li> Centrifugar 100 l de sobrenadante de cultivo celular durante 7 min a 300 xg </li><li> Añadir 20 l del sobrenadante a 20 l de PBS y 10 l de 75 veces diluido 335 nm (perlas de poliestireno de stock 7E10 / ml). </li></ol> 2.2. Medición de la muestra <ol><li> Utilice la estrategia descrita en la sección 1.2 para determinar la configuración óptima de los instrumentos. </li><li> Mida el «talón de calibración sólo &#39;muestra primero. Asegúrese de que la detección de fondo de las pequeñas partículas no del grano es tan baja como sea posible (&lt;10% de las perlas). </li><li> Mide cada individuo sample una vez antes de la grabación se replica con el fin de distribuir fluctuación en condiciones de nanoporos igualmente sobre las diferentes muestras. Medir al menos 3 repeticiones de cada muestra. </li><li> Vuelva a medir el «talón de calibración sólo &#39;muestra después de terminar la grabación de todas las muestras. </li></ol> 2.3. Análisis de Datos Nota: Cuando se utiliza el protocolo alternativo, el uso exclusivo del software Izon Control Suite no es suficiente para el cálculo de la concentración. Se requiere software adicional hoja de cálculo. Tabla 1 indica un ejemplo de cálculo de la concentración de las muestras representadas en la Figura 3. <ol><li> Abra el &#39;talón de calibración sólo&#39; uno o más archivos de muestra de la muestra y. </li><li> Determinar que el bloqueo evento tamaño (en nA) puede ser utilizado como un punto de corte para la distinción entre los vehículos eléctricos y perlas de poliestireno. Determinación del valor de bloqueo (nA) correspondiente a la base izquierda de la población perlas de poliestireno ( <strong&gt; Figura 3b). Nota: garantizar la igualdad de ajuste de los Bin-tamaños de todas las mediciones (puede ser ajustado en &#39;ViewSettings&#39; al que se accede haciendo clic en el botón de &quot;pop-up&quot; de abajo &quot;Trace bloqueo individual&quot;). </li><li> Recuperar los valores del recuento total de partículas para cada muestra haciendo clic en la pestaña &quot;Análisis de Partículas Resumen&quot; de la muestra. </li><li> Filtra los conjuntos de datos utilizando el nivel de corte determinado en el paso 2.3.2. seleccionando la opción &quot;Filtrado de datos&quot; pop-up. Mostrar sólo las partículas más pequeñas que el punto de corte. </li><li> Recuperar los valores de recuento de la EV para cada muestra desde el &quot;análisis de la partícula Resumen&quot;. </li><li> Reste la cantidad de vehículos eléctricos de las partículas totales para determinar la cantidad de bolas de calibración. </li><li> Determinar la relación EV a talón dividiendo recuento EV según el recuento de talón de calibración. </li><li> Determinar la proporción media de fondo promediando los coeficientes determinados para cada uno y# 8220; grano sólo &quot;muestra de calibración. Restar este valor de cada muestra individual. </li><li> Multiplique el ratio ajustado-EV a talón por la concentración de bolas de calibración para determinar la concentración de vehículos eléctricos para cada muestra. </li><li> Multiplicar la concentración encontrada en el paso 2.3.9 por el factor de dilución EV introducido por la adición de perlas de calibración para la muestra EV. Nota: En el ejemplo de configuración de la muestra, la dilución total de la muestra en PBS y perlas de calibración es 2,5 veces y por lo tanto la concentración encontrada en el paso 2.3.9 debe multiplicarse por 2,5 para determinar la concentración de la muestra EV prima. </li><li> Calcular estadísticas tales como los promedios, desviación estándar y el error estándar de la media para cada grupo de repeticiones. Nota: en algunos casos se superponen entre los vehículos eléctricos y perlas de poliestireno con púas que se observa. Si se requiere una corrección de la subestimación de la concentración de EV, también deben medirse muestras sin perlas de poliestireno con pinchos. Utilice el mismo cortefuera tal como se determina en el paso 2.3.2 para determinar una relación &quot;bead-a-EV&quot;, para calcular la relación de los vehículos eléctricos que caen dentro del rango de las perlas de poliestireno con púas. Esta relación de talón-a-EV debe añadirse a la relación-EV a talón determinado en el paso 2.3.8. </li></ol> 2.4. Opcional: EV distribución por tamaño del Uso del método alternativo. <ol><li> Abra una grabación muestra dos veces en la suite de software de control. </li><li> Configure las opciones de filtro de una de las muestras a sólo partículas de visualización más grande que el valor de corte determinado anteriormente. Esto mostrará sólo las partículas de calibración. </li><li> Establezca la muestra filtrada a &quot;archivo de calibración&quot; e introduzca el tamaño medio de las bolas de calibración. </li><li> Pareja el archivo de ejemplo y el &quot;archivo de calibración&quot;, creado en el paso 2.4.3 tal como se describe en 1.4.2. El archivo muestra ahora mostrará una distribución de tamaño de ambos vehículos eléctricos y bolas de calibración basado en las bolas de calibración de pinchos. Nota: La ópera estándarprotocolo ting será más a menudo suficiente para la determinación del tamaño de las distribuciones de los vehículos eléctricos. A veces, sin embargo, los componentes del tampón exactos son desconocidos (por ejemplo en el plasma o en la orina) lo que hace imposible para preparar una muestra de perlas de calibración en el mismo tampón como los vehículos eléctricos de interés. Una muestra de EV de pinchos con partículas de calibración se puede utilizar para el tamaño de sobrestimación EV en estas condiciones específicas. </li></ol>

<ol><li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li>
<li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+%27debris%27%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li>
<li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li>
<li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+exosomes%3A+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li>
<li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li>
<li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sizing+of+nano%2Fmicroparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li>
<li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li>
<li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physics.+Condensed+matter+%3A+an+Institute+of+Physics+journal%22%5BJournal%5D)">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li>
<li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensor%22%5BJournal%5D)">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li>
<li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li>
<li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li>
<li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li>
<li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li>
<li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li>
</ol>

El desarrollo del protocolo descrito y la redacción de este manuscrito ha sido apoyado financieramente, en parte, por la fundación holandesa Cerebro, Fundación Schumacher Kramer, y el Fondo Bohnenn. La producción de este video-artículo fue parcialmente sponsorted por Izon.

Los protocolos descritos en este manuscrito metodologías de oferta para la cuantificación y caracterización de tamaño de los vehículos eléctricos utilizando TRPS. Las principales ventajas de la plataforma TRPS son el pequeño tamaño de la muestra, duración relativa de medición corto y la ausencia de manipulación de la muestra requerida. Requisito previo para la medición precisa TRPS es mantener condiciones idénticas entre las mediciones de calibración y muestras. Esto incluye el uso de topes idénticos, así como la configuración del instrumento idénticos, como el tamaño de nanoporos, la tensión y la presión aplicada. El VPM original, carece de un mecanismo para el ajuste exacto de la presión aplicada, causando con ello diferencias menores en la presión aplicada entre las muestras. También, la evaporación del fluido de cebado en el VPM puede inducir diferencias de presión de menor importancia cuando se mide en diferentes puntos de tiempo y el VPM tanto, a menudo debe ser re-cebado. Estas limitaciones potencialmente han sido resueltos por la introducción de la VPM2, quetiene una escala basada en clic y se basa presión de aire. El protocolo alternativo descrito en este manuscrito es especialmente adecuado para la medición de los vehículos eléctricos en muestras biológicas purificadas no 17. Creemos que los componentes del tampón, tales como azúcares, lípidos, proteínas y otros residuos más grandes, puede en algunos casos influyen en las condiciones de medición demasiado para el protocolo estándar para ser aplicables. La adición de bolas de calibración de la muestra en lugar de comparar dos mediciones separadas introduce &#39;calibración en tiempo real&#39;. Este método es especialmente adecuado cuando la comparación de muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo de diferentes donantes) que tienen diferentes y / o desconocidos contenidos fluídicos fondo. Aunque existen diferencias entre los vehículos eléctricos y las partículas de poliestireno (por ejemplo, la densidad de las partículas y la carga superficial), modelos teóricos, así como los datos experimentales de relieve la capacidad de uso de perlas de poliestireno para la cuantificación y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos,bajo la condición previa de que se aplica una presión significativa 15,19. Para minimizar la influencia de las fuerzas electrocinéticas, se recomienda el uso de la relativamente mayor NP150 / NP200 nanoporos y la presión positiva significativa. EVs y bolas de calibración se distinguen por el tamaño. En consecuencia, el nanoporo tiene que ser abierto mediante la aplicación de estiramiento, a un diámetro donde se observa la detección de ambos vehículos eléctricos y las partículas más grandes de calibración. Desde la apertura del poro disminuirá la sensibilidad hacia partículas más pequeñas, sólo EVS más grande que un cierto tamaño se registran (a menudo EVs&gt; 120 nm cuando se utiliza un cordón de calibración 335 nm). El límite de detección mínimo para los vehículos eléctricos se puede reducir a aproximadamente 90 nm, con 203 bolas de calibración nm en un nanoporo NP150. Sin embargo, esta configuración puede ser inviable cuando los vehículos eléctricos más grandes inducen obstrucción frecuente de la nanopore. La presencia de estos vehículos eléctricos que obstruyen puede forzar la utilización de una configuración en la que una población de EVs, demasiado pequeño para reaCH El umbral de detección, no será detectado. La dificultad para operar el sistema aumenta cuando se trata de medir las partículas menores de 100 nm de tamaño. En tales casos, la detección puede mejorarse aumentando la concentración de sal del electrolito. Un aumento de la concentración de iones inducirá aumenta relativamente magnitudes de bloqueo para partículas pequeñas (mayor relación señal a ruido). La viabilidad de esta técnica para la medición de los vehículos eléctricos tiene que ser validado, aunque, como el aumento de las concentraciones de sal pueden influir en el volumen de los vehículos eléctricos. En conclusión, la plataforma TRPS puede ser utilizado para la cuantificación directa y caracterización tamaño de los vehículos eléctricos. Dado que no se requiere aislamiento o manipulación EV (anticuerpo etiquetado de unión o fluorescente), la plataforma es adecuado para la cuantificación directa EV en fluidos biológicos. Un protocolo alternativo se prevé que puede ser beneficiosa para muestras en las que los componentes del tampón inducen significativa cloggin de porog eventos, por lo que la utilización fiable de el protocolo estándar inviable.

Las vesículas de origen celular son muy abundantes en los fluidos corporales 1. Estos llamados vesículas extracelulares (SVE) (50 - 1000 nm de tamaño) se forman por cualquiera de fusión de cuerpos multivesiculares con la membrana celular, o por gemación directa en el exterior de la membrana celular. En los últimos años, el interés científico en los vehículos eléctricos se ha incrementado en gran medida, lo que resulta en una gran cantidad de publicaciones EV-centrado, en el que las nuevas funciones y características de los vehículos eléctricos se describen 1. EVs ahora se cree que están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos tales como la transducción de señales, regulación inmune, y la coagulación de la sangre 1-4. En el cáncer, los vehículos eléctricos parecen jugar un papel en la formación de nichos premetastatic 5,6, la transferencia de pro-canceroso contenido de 7,8 y la estimulación de la angiogénesis 8. Además de esto, los vehículos eléctricos se exploran como agentes de suministro de agentes terapéuticos 9. A pesar de estos dedesarrollos, la cuantificación fiable de los vehículos eléctricos sigue siendo un reto. Tradicionalmente, se utilizan métodos de cuantificación indirectos, que se basan en la cuantificación del contenido total de proteína o proteínas específicas. Aunque se usan ampliamente, estas técnicas no tienen en cuenta las diferencias de proteínas-por-EV, y no discriminan entre contaminantes agregados de proteínas y proteínas en los vehículos eléctricos. Además, estas técnicas requieren el aislamiento de los vehículos eléctricos, que en muchos casos hace que la comparación de las concentraciones de EV en muestras biológicas imposible. Por lo tanto, se realizan esfuerzos para desarrollar nuevos métodos que permitan la medición EV más precisa y directa 10. Este informe describe el uso de los sensores de pulso resistiva sintonizable (TRP) para la cuantificación fiable y tamaño de perfiles de los vehículos eléctricos. Actualmente, el qNano instrumento (Figura 1a) es la plataforma sólo está disponible comercialmente para TRPS. En TRPS, una membrana elástica no conductor puntuada wiª un poro de tamaño nanométrico se separa dos células del líquido. Una de las células del líquido se llena con la muestra de interés, mientras que la otra celda se llena con electrolito libre de partículas. Mediante la aplicación de una tensión, un flujo / corriente eléctrica iónica se establece, que se altera en la transferencia de las partículas a través del poro (Figura 1b). La magnitud de este bloqueo actual (&#39;pulso resistiva&#39;) es proporcional al volumen de la partícula 11 (Figura 1c). La duración del bloqueo se puede utilizar para evaluar el potencial zeta de las partículas, que se basa en características de las partículas tales como la carga o la forma 12. Tamaño de perfiles de partículas desconocidas puede llevar a cabo mediante la comparación de los impulsos resistivas causadas por las partículas desconocidas con los pulsos resistivas causadas por las partículas de calibración con un diámetro conocido. Además de la magnitud de un evento de bloqueo, se mide la tasa de los que éstos se producen. Esta tasa de recuento reliES en la concentración de partículas. Dado que la concentración y la tasa de bloqueos son linealmente proporcional 13, usando una sola muestra de calibración con una concentración conocida de partículas y tamaño de partícula permite la medición de la concentración y distribución de tamaño 14 11 de una muestra desconocida. El movimiento de las partículas a través de la nanopore se determina por electro kinetic- fuerzas electroforéticas (y electro-osmótica) y de fluidos 15. Al utilizar el módulo de presión variable (VPM) una diferencia de presión entre las cámaras de fluido puede ser inducida como una fuerza adicional. La aplicación de presión positiva aumenta la velocidad de flujo de partículas, que pueden ser de beneficio cuando la concentración de partículas es baja. También, la presión se puede aplicar para reducir el efecto de las fuerzas electro-cinética. Esto es especialmente importante cuando se utiliza nanoporos con un pequeño diámetro de poro relativo (NP100, NP150 y NP200 posiblemente) que se utiliza a menudo como para la detección de los vehículos eléctricos.Para estos nanoporos, incluso cuando se aplica una presión significativa, las fuerzas electro-cinética pueden, dependiendo de la carga superficial de las partículas, siendo no despreciable 16. Mediante la medición de la tasa de partícula en múltiples presiones, un electro cinéticamente corregido, y por lo tanto más precisa, la concentración EV se puede calcular. Aquí, protocolos detallados se proporcionan para determinar la distribución del tamaño y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de funcionamiento regular, un enfoque alternativo se describe que las muestras están sobrecargadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración 17. Esta técnica de calibración en tiempo real se puede utilizar para superar algunos de los desafíos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en fluidos biológicos, tales como orina, plasma y sobrenadante de cultivo celular, o cuando la estabilidad de la nanoporos durante un largo período de tiempo de medición no puede ser asegurado.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrumento</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Módulo de presión variable</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>NP100, NP200</td><td>La elección del nanoporo varía en función de la partícula objetivo. Hay diferentes nanoporos disponibles para diferentes tamaños de objetivo.</td></tr><tr><td>Calibración de Partículas</td><td>Izon Science Ltd.</td>Las partículas de calibración <td>CPC100, CPC200, CPC400</td><td>están disponibles en diferentes tamaños.</td></tr><tr><td>Baño de sonicación</td><td>Múltiple disponible</td><td></td><td>Baño de sonicación básico es suficiente</td></tr><tr><td>(Mini) vórtice</td><td>Múltiples disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tejidos sin elevación</td> Múltiples soluciones salinas <td>tamponadas</td> con fosfato (PBS) disponiblesMúltiples <td></td><td></td></tr><tr><td>computadoras</td><td></td><td></td><td></td>basadas en Windows</tr> <tr><td></td><td>disponibles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izon Control Suite 2.2</td><td>Izon Ciencia Ltda.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software de hoja de cálculo</td><td>Múltiple disponible</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación y tamaño-perfiles de extracelular vesículas usando tunable resistiva pulso sensing

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Vesículas extracelulares (EVs), incluyendo &#39;microvesículas&#39; y &#39;exosomas&#39;, son muy abundantes en los fluidos corporales. Los últimos años han sido testigo de un enorme aumento en el interés por los vehículos eléctricos. EVs han demostrado que desempeñan papeles importantes en varios procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer. Además, los vehículos eléctricos tienen potencial como agentes terapéuticos, por ejemplo, como vehículos de suministro de fármacos o como medicina regenerativa. Debido a su pequeño tamaño (50 a 1000 nm) cuantificación exacta y el tamaño de los perfiles de los vehículos eléctricos es técnicamente difícil. Este protocolo describe cómo sintonizable tecnología de detección de pulso resistiva (TRP), utilizando el sistema de qNano, se puede utilizar para determinar la concentración y el tamaño de los vehículos eléctricos. El método, que se basa en la detección de los vehículos eléctricos sobre su transferencia a través de un poro de tamaño nano, es relativamente rápido, es suficiente el uso de pequeños volúmenes de muestra y no requiere la purficación y la concentración de los vehículos eléctricos. Junto al protocolo de operación regular un enfoque alternativo se describe utilizando muestras adicionadas con perlas de poliestireno de tamaño conocido y concentración. Este tiempo real técnica de calibración se puede utilizar para superar los obstáculos técnicos encontrados en la medición de los vehículos eléctricos directamente en los fluidos biológicos.

Para utilizar el instrumento TRPS, un nanoporo no conductor que tiene que situarse en los 4 brazos de la máquina (Figura 1a) y una tensión (Figura 1b) tiene que aplicarse. Una vez que se establece una corriente eléctrica de línea de base, los pulsos de resistencia causadas por las partículas que pasan a través del poro se detectarán como se ilustra en la Figura 1c. EVs se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo de células de la línea celular de glioblastoma U87-MG / EGFRvIII por ultracentrifugación. Se observa una tasa de partícula-parcela estable cuando la medición de los vehículos eléctricos aislados (Figura 2A) en una nanoporo NP100. Se requiere esta partícula estable tasa de parcelas para una medición de la concentración EV fiable. Después de emparejar la grabación EV-muestra una grabación de perlas 115 nm de calibración de poliestireno, una distribución de tamaño (Figura 2b) y estimación de la concentración de la EV-muestra se puede obtener (datos no mostrados). <p class= &quot;&quot;&gt; jove_content EVs también fueron cuantificados directamente en glioblastoma sobrenadante de cultivo celular. Al medir EVs en muestras biológicas, obstrucción nanoporo a menudo resulta en interrupciones y / o fluctuaciones en los tipos de parcelas de partículas (Figrue 3a). Esto resulta en estimaciones de concentraciones EV inexactos. Por clavar la muestra con perlas de poliestireno de concentración y tamaño conocido, una relación de-EV a talón se puede determinar. Figura 3b ilustra los resultados obtenidos después del enriquecimiento sobrenadante de cultivo celular con perlas de poliestireno de 335 nm de tamaño. Se observan dos poblaciones claras. Las partículas inducen un bloqueo de menos de 0,46 nA son vehículos eléctricos determinados, las partículas más grandes se determinan perlas de poliestireno. La relación de los vehículos eléctricos a perlas de poliestireno se utiliza para calcular la concentración en bruto de los vehículos eléctricos (Tabla 1). Figura 3C ilustra la estimación del tamaño de las dos poblaciones basadas en las perlas de poliestireno con púas. El re configuración nanoporo utilizadoconsultado en la detección de los vehículos eléctricos&gt; 140 nm de tamaño. Esto se puede disminuir reduciendo la apertura de nanoporos, sin embargo, esto también resultará en eventos más obstrucción. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: instrumento qNano y modo de operación. (A) Fotografía del instrumento. Un nanoporos se coloca en el instrumento, la separación de una cámara de fluido inferior de una cámara de fluido superior. Las células del líquido están protegidos de interferencias eléctricas del medio ambiente por la tapa de protección. (B) Ilustración delineando detección de pulso resistiva sintonizable (TRP). Un nanoporo elástico no conductor está separando dos células de líquido. Mediante la aplicación de una tensión de una corriente eléctrica se establece a través del poro perforado en el nanoporo. Como vesículas extracelulares se mueven a través de la nanoporos, el flujo iónico se altera y detectado como un pulso resistiva. En TRPS el tamaño de apertura de la nanoporos puede ser sintonizado (reducción o aumento) estirando el nanoporo mediante el aumento de la distancia entre los brazos opuestos del instrumento, o la reducción de esta distancia. (C) Ejemplo ilustrativo de pulsos resistivas. La magnitud de un solo pulso de resistencia es proporcional al volumen de la partícula:. Pulsos más grandes indican las partículas más grandes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Partículas contar-parcela y tamaño-distribución obtenida a partir de la medición de los vehículos eléctricos aislados de U87-MG / EGFRvIII sobrenadante del cultivo celular (A) Partículas contar-parcela indicando la detección de partículas global constante.. Breve reducción de la particSe observó la detección le entre 80 y 100 segundos de la grabación. Después de la pausa de la grabación y tocar la tapa de protección, la tasa de partículas se estabilizó después de lo cual se reanudó la grabación. (B) La distribución del tamaño de los vehículos eléctricos aislados se traza después de la calibración de la muestra desconocida (EVs) a 115 nm bolas de calibración de poliestireno. (5 nm de tamaño bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: TRPS cuantificación de los vehículos eléctricos en el sobrenadante del cultivo de células utilizando el protocolo alternativo. (A) típicas parcelas de tipos de partículas obtenidas en la medición de los vehículos eléctricos directamente en un fluido biológico. La obstrucción de los poros provoca breves interrupciones y las fluctuaciones en la tasa de detección de partículas. Cadaparcela representa una medición de la replicación de la misma muestra. gráficos (B) Tres replicar tamaño de distribución obtenidos después del enriquecimiento sobrenadante de cultivo celular con 335 nm perlas de calibración de poliestireno. Todas las partículas que inducen un pulso resistiva de menos de 0,46 nA se seleccionan como vehículos eléctricos. (C) Las perlas de poliestireno de púas se pueden utilizar para obtener un tamaño de distribución de la muestra. (5 nm de tamaño bin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Medición </td><td> Calibración sólo # 1 </td><td> Calibración sólo # 2 </td><td> El sobrenadante # 1 </td><td> El sobrenadante # 2 </td><td> El sobrenadante # 3 </td></tr><tr><td> Corriente media (nA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Tasa de Partículas </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> corte utilizado (nA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> Partículas totales </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Vesículas extracelulares </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Bolas de calibración con pinchos </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> EVS / bolas de calibración </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0.788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> Muestra - Fondo </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Vesículas EXTRACCIÓN (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> 2.5x muestra diluida </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EVs concentración Raw (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Ejemplo de cálculo de la concentración de EV usando el protocolo alternativo Un valor de corte es determinado para distinguir los vehículos eléctricos a partir de perlas de calibración. Posteriormente, el número total de los vehículos eléctricos y los granos puede ser recuperada. Para cada medición se calcula el ratio EV a talón. La cantidad de partículas de fondo en el electrolito (por ejemplo, los agregados de proteína) se calcula promediando el ratio EV a talón para las mediciones individuales del &#39;bolas de calibración sólo&#39; muestra. Para cada muestra la relación de fondo se resta de la relación obtenida. Este adjusted relación se multiplica por la concentración de las perlas de calibración en la muestra (en este ejemplo: 9.33e7 / ml). Para determinar la concentración en bruto de los vehículos eléctricos, la concentración obtenida se multiplica por el factor de dilución EVs total (en este ejemplo: 2,5).

Vesículas extracelulares juegan papeles importantes en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la coagulación, respuestas inmunitarias, y el cáncer o como agentes terapéuticos potenciales en la administración de fármacos o la medicina regenerativa. Este protocolo presenta métodos para la cuantificación y caracterización de tamaño de las vesículas extracelulares aisladas y no aisladas en diversos fluidos utilizando sintonizable de detección de pulso resistiva.

Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar y determinar el perfil de tamaño de vesículas extracelulares utilizando la técnica de detección resistiva ajustable de pulsos. El enfoque estándar es comparar las mediciones de bloqueo de corriente obtenidas de vesículas extracelulares purificadas con las obtenidas de estándares de microesferas de poliestireno. Un segundo enfoque para caracterizar las vesículas extracelulares consiste en agregar microesferas de poliestireno directamente a la muestra, lo cual se utiliza cuando se trabaja con muestras complejas, como vesículas extracelulares no purificadas.En medio de cultivo celular, los datos resultantes caracterizan el tamaño y el número de las vesículas extracelulares, ya sean purificadas o no purificadas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el inmunoblot o la citometría de flujo de vesículas extracelulares unidas a microesferas de látex, es que este método caracteriza directamente las partículas en fluidos biológicos sin necesidad de aislamiento físico ni etiquetado. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las vesículas extracelulares son heterogéneas en tamaño.Al intentar detectar las vesículas más pequeñas, las vesículas más grandes pueden obstruir el nanoporo. Hemos añadido algunos consejos y trucos prácticos al protocolo para regresar rápidamente a condiciones funcionales. Intentamos reducir la producción de vesículas extracelulares y necesitábamos un método para cuantificar la concentración de vesículas en cultivo celular.Snet.En la búsqueda de métodos para caracterizar nanopartículas, encontramos el TRPS y modificamos sus protocolos para que fueran más adecuados para la caracterización de sobrenadantes de cultivos celulares y otros fluidos biológicos. Comience conectando el instrumento TRPS a una computadora con el software Eyes on Control Suite instalado. Asegúrese de minimizar las interferencias eléctricas, tal como se describe en el protocolo escrito.Ahora, elija el tamaño del nanoporo. Un NP 100 es la mejor opción para vesículas de 70 a 200 nanómetros, mientras que un NP 150 puede utilizarse para vesículas de 85 a 300 nanómetros. Un NP 200 es más adecuado para medir vesículas de 100 a 400 nanómetros.Luego, seleccione las partículas de calibración de poliestireno complementarias para la NP 100 y las partículas de calibración CPC 100 para la NP 200. Utilice las partículas de calibración CPC 200. Vortex las partículas de calibración durante 30 segundos.Si aún están agregados, utilice la sonicación y luego diluya las partículas de calibración en PBS hasta la concentración objetivo. Según el tamaño de los nanoporos, el volumen final debe ser de al menos 40 microlitros. Ahora humedezca la celda de fluido inferior del instrumento aplicando 78 microlitros de PBS y elimine inmediatamente el líquido.Esto reduce el riesgo de formación de burbujas debajo del nanoporo. A continuación, coloque el nanoporo en los brazos del instrumento. Mida la distancia entre los dos brazos opuestos utilizando calibradores digitales.Introduzca este valor en el software en el campo denominado stretch y, una vez ingresado, haga clic en calibrate stretch utilizando la rueda lateral que controla la distancia entre los brazos opuestos. Estire el nanoporo hasta 47 milímetros. Una vez estirado al tamaño deseado, vuelva a aplicar 78 microlitros de PBS en la celda de fluido inferior.Inicie el proceso de calibración colocando la celda de fluido superior sobre el nanoporo y fijando la jaula de blindaje. A continuación, agregue 40 microlitros de partículas de calibración diluidas en la celda de fluido superior. Ahora aplique al menos 0.8 kilopascales de presión positiva.Utilizando el módulo de presión variable o VPM, seleccione un voltaje positivo y haga clic en encender. Luego reduzca lentamente el estiramiento mientras analiza el bloqueo. Eventos causados por las partículas de calibración.A medida que el estiramiento disminuye, la altura del bloqueo aumentará gradualmente y, por lo tanto, la relación señal-ruido mejorará. Aumentar el voltaje también puede incrementar la altura del bloqueo, pero asimismo puede generar más ruido RMS. Deje de reducir el estiramiento cuando los bloqueos observados superen adecuadamente los niveles de fondo, tal como se indica en el panel de la traza de señal.En segundo lugar, observe la tasa de partículas. Sin embargo, este parámetro tiene un límite menos estricto. La tasa de partículas debería ser idealmente de al menos 100 por minuto.Sin embargo, si la tasa de partículas es mayor de 2000 por minuto, diluya la muestra y recalibre el instrumento. Una tasa tan alta puede provocar mediciones inexactas en esta demostración. Se caracterizan vesículas extracelulares previamente purificadas de una línea celular de tumor cerebral.Comience cargando las partículas de calibración en la celda superior de la prensa de fluido. Encienda y luego aplique presión utilizando el VPM y registre al menos 500 partículas de datos aquí. Se aplica una presión de 0,8 kilopascal.Opcionalmente, también se puede realizar una medición de múltiples presiones para hacer esto: aumente la presión aplicada y registre un segundo archivo de calibración. Los incrementos de presión deben ser de al menos 0,2 kilopascales. Ahora, retire la muestra de la celda superior y lave la celda tres veces con 100 microlitros de PBS por lavado. Después de los lavados, seque la celda de fluido superior con papel sin pelusas.Agregue a continuación la muestra experimental. La corriente de referencia debe estar dentro del 3 % de la corriente observada al medir las partículas de calibración. Si no es así, golpee o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua desionizada.Si la corriente observada es adecuada, aplique exactamente las mismas presiones que se aplicaron a las partículas de calibración. Luego registre al menos 500 partículas y guarde el archivo de datos. Si se produce una interrupción repentina en la detección de partículas, una caída en la corriente de línea base o un aumento súbito en el ruido RMS, detenga la grabación y trate de desobstruir el nanoporo.Como antes, pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo. Toque o gire la tapa protectora, aplique el émbolo o retire completamente el nanoporo y lávelo con agua desionizada. Otra estrategia consiste en aumentar el estiramiento del nanoporo hasta 47 milímetros y maximizar la presión del VPM durante aproximadamente cinco minutos.Como esto también puede desconectar el NPO en el software. Vaya a la pestaña de análisis de datos e inicie el procesamiento de los datos haciendo clic derecho en la opción de archivos sin procesar y seleccione la opción de procesar archivos. Luego, para acoplar los archivos de muestra y de calibración, haga clic en la casilla de verificación junto a la muestra.En la columna calibrada, seleccione los archivos correspondientes y acepte. Las opciones. El software mostrará diferentes características de la muestra, como tamaño, distribución, duraciones de la línea base, anchura total, máximos a la mitad y análisis de concentración.El siguiente enfoque se utiliza para muestras como fluidos biológicos que provocan un taponamiento excesivo con el método estándar durante la preparación: centrifugue al menos 50 microlitros de cultivo celular. El sobrenadante, que contiene las vesículas extracelulares, durante siete minutos a 300 G. Prepare también un control con medio únicamente, de la misma manera, tanto para la muestra como para el control. Transfiera 20 microlitros del sobrenadante a tubos nuevos y agregue 20 microlitros de PBS y 10 microlitros de la solución stock de esferas de poliestireno de 335 nanómetros diluidas a 10 millones de esferas por mililitro.Ahora configure el instrumento como antes, utilizando un nanoporo NP 200 y mida la muestra de control que contiene solo perlas en medio. Primero, para mayor precisión, la detección de fondo de partículas pequeñas no perla debe minimizarse a menos del 10 % de las detecciones de perlas. A continuación, mida cada muestra una vez antes de registrar los réplicas.Esto distribuirá las condiciones variables de los nanoporos entre las muestras. Cada muestra debe medirse tres veces, finalizando siempre con la re-medición de la muestra que contiene solo las perlas de calibración. Posteriormente, durante el análisis de datos, utilice un software de hojas de cálculo para realizar los cálculos de concentración.En el protocolo escrito se incluye un ejemplo de cálculo. Se purificaron vesículas extracelulares del cultivo celular de U 87 M-G-E-G-F-R-V tres, a partir del sobrenadante mediante ultracentrifugación, y luego se midieron utilizando el protocolo descrito con cuentas de calibración de 115 nanómetros. Se obtuvo una distribución de tamaños para las vesículas extracelulares. Las vesículas extracelulares también se cuantificaron directamente a partir del sobrenadante del cultivo celular de glioblastoma, utilizando el enfoque alternativo que añade al ejemplo un patrón conocido. Se observaron dos poblaciones de nanopartículas. Las vesículas extracelulares más pequeñas y el patrón conocido más grande permitieron, mediante la estimación del tamaño de las dos poblaciones basada en el patrón conocido, identificar a la población de vesículas como mayor de 140 nanómetros.Pueden haberse detectado vesículas extracelulares más pequeñas utilizando una abertura de nanoporo más pequeña, pero habría habido más obstrucciones. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en uno a cuatro horas, dependiendo del número de muestras analizadas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las muestras pueden requerir ajustes septales al protocolo.Por ejemplo, las muestras compuestas por vesículas más grandes pueden requerir el uso de nanoporos más grandes a un estiramiento relativamente elevado, y además las mediciones pueden facilitarse mediante filtración o centrifugación de las muestras para eliminar los restos celulares, los cuales pueden obstruir el nanoporo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar vesículas extracelulares utilizando TRPS. Dependiendo de su muestra de vesículas extracelulares, puede aplicar el protocolo estándar o utilizar el método ajustado de adición de partículas de calibración.

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Aquí se utiliza un nanopore sintonizable de poliuretano integrado en una técnica de detección de impulsos resistiva para caracterizar las nanopartículas química de la superficie a través de la medición de las velocidades de translocación de partículas, que se puede utilizar para determinar el potencial zeta de las nanopartículas individuales.

Determinación del Potencial Zeta a través de nanopartículas de translocación velocidades a través de un sintonizable nanoporos: El uso de partículas de ADN modificado como ejemplo

Demostramos una plataforma de microfluidos con una red de electrodo de superficie integrado que combina detección de pulso resistivo (RPS) con división de código de acceso múltiple (CDMA), para multiplexar la detección y el tamaño de las partículas en múltiples canales de microfluidos.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

Demostramos cómo utilizar un nuevo instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas para estimar la distribución del tamaño y la concentración total de partículas de vesículas extracelulares aisladas de tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano.

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

La última generación de herramientas de caracterización de EV es capaz de realizar un solo análisis de EV a través de múltiples parámetros simultáneamente. La citometría de nanoflujo mide todas las partículas biológicas mayores de 45 nm sin etiquetado e identifica características específicas de subpoblaciones mediante una variedad de técnicas de etiquetado fluorescente.

Caracterización de proteínas transmembrana de vesícula extracelular única mediante citometría de nanoflujo

Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.

Plataforma analítica multimodal en un chip de resonancia de plasmón de superficie multiplexada para el análisis de subconjuntos de vesículas extracelulares

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Aquí, demostramos el método de caracterización de vesículas extracelulares (EV) recolectadas de fluidos biológicos, como lágrimas y saliva, de sujetos humanos. El escáner utilizado en este método es capaz de detectar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de 1 μL de la muestra.

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Aquí presentamos un protocolo para analizar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales utilizando espectroscopía Raman mejorada en superficie sin etiquetar (SERS), permitiendo diagnósticos y evaluaciones mínimamente invasivas de las enfermedades como vehículos terapéuticos de administración.

Explorando la aplicación de la biodetección basada en dispersión Raman mejorada en superficies de sEVs individuales en el diagnóstico y terapias de enfermedades

La espectroscopia Raman es una técnica adecuada para el contacto no, libre de marca análisis de las células vivas, las construcciones de ingeniería de tejidos y tejidos nativos. Fuente específicos de huellas espectrales pueden ser generados y analizados utilizando el análisis multivariado.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Aprende a cuantificar y perfilar el tamaño de vesículas extracelulares mediante sensibilización por pulso de resistencia ajustable (TRPS) en fluidos biológicos. Este método permite caracterizar partículas directamente sin necesidad de aislamiento previo ni etiquetado.

Cuantificación y Tamaño-perfiles de extracelular vesículas Usando Tunable resistiva Pulso Sensing

Explorar más videos