Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

El objetivo general de este procedimiento es crear de forma reproducible discos de hidrogel de alginato bicapa para investigar las relaciones entre diferentes poblaciones celulares durante el co-cultivo en 3D. Este método facilita el estudio de las interacciones entre múltiples poblaciones celulares en cultivos tridimensionales espacialmente heterogéneos, lo que puede ayudar a responder preguntas clave en ingeniería de tejidos y en la fisiología de los tejidos que soportan carga. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una manera sencilla, económica y reproducible de construir hidrogeles de alginato multicapa sembrados con células, que estructuralmente son adecuados para la estimulación mecánica.

Quien demostrará este procedimiento será Poonam Sharma, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para formar los discos de alginato, primero coloque una pieza de papel filtro grueso encima de una placa terminal de tres por tres pulgadas, seguida de una membrana de microtamiz celular. Utilice una espátula estéril para alisar la membrana y el papel filtro.

Luego, invierta la pila sobre un montón de toallas de papel y comprima los materiales para eliminar la solución excesiva de cloruro de calcio. A continuación, coloque un molde de formación de gel con pozos cilíndricos encima de la membrana de microtamiz y use sujetapapeles para sujetar suavemente el molde a la placa terminal en los lados izquierdo y derecho. Ahora, coloque una pieza de papel filtro grueso sobre una placa terminal pequeña, seguida de una pieza de membrana de microtamiz, e invierta la pila para eliminar cualquier exceso de cloruro de calcio, tal como se acaba de demostrar.

Cuando ambas mitades del molde estén listas, re suspenda un por diez elevado a la sexta células de interés por mililitro de medio estéril de alginato. La mezcla parecerá turbia de forma homogénea cuando las células estén adecuadamente dispersas. Luego, transfiera 130 microlitros de células gota a gota a pozos individuales de seis milímetros de diámetro por tres milímetros de altura en la mitad inferior del constructo del molde.

Debe ser visible un menisco ligeramente convexo por encima del borde de cada pocillo. Cuando todas las células hayan sido sembradas, utilice una espátula estéril para alisar cuidadosamente la mitad superior del constructo del molde. Luego, gire el molde de modo que la membrana de microcriba quede en la parte superior de los pocillos, y coloque el molde encima de los pocillos, teniendo cuidado de cubrir completamente los pocillos que contienen las mezclas de células y alginato.

Cuando el molde esté en su lugar, levante el conjunto del molde cargado y, presionando firmemente en el centro, coloque abrazaderas en los otros dos lados del conjunto para asegurar las mitades superior e inferior del molde. Las soluciones de alginato con células deben quedar firmemente asentadas en los pozos. A continuación, sumerja todo el conjunto del molde en un baño de cloruro de calcio 102 milimolar en una cabina de cultivo celular a temperatura ambiente durante 90 minutos.

Al finalizar la incubación, transfiera el constructo a una pila de toallas de papel y retire las dos pinzas que sujetan la placa superior al molde. Separe las dos mitades del constructo. Los hidrogeles formados en los pocillos no deben tener burbujas y deben llenar completamente los pocillos.

Retire los dos clips sujetadores restantes y separe el molde que contiene el hidrogel de la placa final restante. Utilizando una espátula, siga cuidadosamente el borde de los pozos que contienen los hidrogeles para aflojar suavemente los geles. Luego, transfiera los hidrogeles directamente a un baño de DPBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

Después de uno a cinco minutos, transfiera los hidrogeles a pozos individuales de una placa de seis pozos que contenga suficiente solución de medio de crecimiento de albahaca para sumergir completamente los geles durante al menos una hora a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO₂. Durante los últimos 30 minutos de la incubación, utilice sujetadores de papel para fijar el molde con pozos de la mitad de la altura del molde de formación de geles a la placa de aluminio de tres por tres pulgadas o de tres por 1,5 pulgadas en los extremos izquierdo y derecho, con el fin de crear un molde de corte. Luego, cree el modo de recocido sujetando con clips el molde que tiene pozos con un diámetro tres milímetros mayor que el molde de formación de geles a placas de aluminio de tres por tres pulgadas en los extremos izquierdo y derecho.

Ahora, transfiera los hidrogeles a los pozos del molde de corte. Cada gel debe encajar firmemente en el pozo, con la mitad del gel sobresaliendo por encima del molde. Utilice un escalpelo para cortar a lo largo de la superficie del molde y dividir el hidrogel por la mitad.

Gire la mitad superior del gel y colóquela en un pozo abierto del molde. El trozo de gel debe encajar firmemente en el pozo, y ahora ambas mitades deben tener la altura del molde, con la superficie interna cortada visible. A continuación, coloque un trozo de membrana de microcriba para células seca sobre los pozos, asegurándose de que la membrana esté en contacto con todas las mitades del gel que se van a unir, y cubra la membrana con un trozo de papel filtro grueso.

Cuando los geles estén completamente cubiertos, sature el papel filtro con citrato de sodio suplementado con EDTA e incube los geles a temperatura ambiente. Después de un minuto, deseche la membrana microtamiz para células y el papel filtro grueso, y retire las pinzas sujetapapeles. Luego, abra el molde y transfiera una mitad del gel a un molde de recocido preparado, con la superficie cortada orientada hacia arriba.

Utilizando una espátula, transfiera una segunda mitad de gel tratada sobre el primer gel, de manera que la superficie cortada esté en contacto con la superficie cortada del primer gel. Cuando todos los geles hayan sido colocados, use una espátula para presionar suavemente sobre los geles y eliminar cualquier burbuja, y sumerja cuidadosamente el molde de recocido en el baño de cloruro de calcio. Después de 30 minutos, transfiera el molde de recocido sobre una pila de toallas de papel y retire las pinzas de sujeción.

Luego, separe el molde de la placa final y transfiera brevemente los geles a un baño de DPBS, seguido de su inmersión en el medio de cultivo celular apropiado. Los geles bilaminares terminados muestran una separación inicial completa de las poblaciones celulares, como se observa en esta imagen de células 293 FT marcadas con colorantes rastreadores celulares verdes o rojos. La viabilidad de las células madre mesenquimales humanas incrustadas tras el recocido es alta dentro de los hidrogeles estratificados, similar a la viabilidad celular observada en hidrogeles masivos.

Después de aislar el estrés máximo de cada ciclo durante una compresión cíclica no confinada de cuatro horas, los hidrogeles estratificados libres de células exhiben una respuesta de estrés a la compresión cíclica significativamente menor en magnitud en comparación con los hidrogeles libres de células no estratificados en bloque, aunque ambos tipos de hidrogel permanezcan intactos después de siete días en cultivo. Una vez dominada, esta técnica, incluyendo la preparación de todos los materiales, puede completarse en menos de cuatro horas y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar de forma deliberada y lenta para prevenir errores y para llevar un control más fácil de las diferentes muestras.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la estimulación mecánica y la inmunotinción para responder preguntas adicionales sobre las interacciones entre las diferentes poblaciones celulares que pueden formar las matrices extracelulares. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la mecanobiología y la ingeniería de tejidos investigar más fácilmente la relación entre diferentes poblaciones celulares, tales como células madre mesenquimales, condrocitos y células del núcleo pulposo. No olvide que trabajar con objetos cortantes, materiales biológicos y especialmente células humanas puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal adecuado durante la realización de este procedimiento.