Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

El objetivo general de este procedimiento es crear de forma reproducible discos de hidrogel de alginato de dos capas para investigar las relaciones entre diferentes poblaciones celulares durante el cocultivo en 3D. Este método facilita el estudio de las interacciones entre múltiples poblaciones celulares en cultivos 3D espacialmente heterogéneos, lo que puede ayudar a responder preguntas clave en ingeniería de tejidos y la fisiología de los tejidos portadores de carga. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una forma sencilla, económica y reproducible de construir hidrogeles de alginato multicapa sembrados en células que son estructuralmente propicios para la estimulación mecánica.

Para demostrar este procedimiento estará Poonam Sharma, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para formar los discos de alginato, primero apile un trozo de papel de filtro grueso encima de una placa final de tres por tres pulgadas, seguido de una membrana de microtamiz celular. Use una espátula estéril para aplanar la membrana y el papel de filtro.

Luego, invierta la pila sobre una pila de toallas de papel y comprima los materiales para eliminar el exceso de solución de cloruro de calcio. A continuación, coloque un molde de formación de gel con pocillos cilíndricos en la parte superior de la membrana del microtamiz y use clips aglutinantes para sujetar suavemente el molde a la placa final en los lados izquierdo y derecho. Ahora, apila un trozo de papel de filtro grueso en una pequeña placa final, seguido de un trozo de membrana de microtamiz, e invierte la pila para eliminar el exceso de cloruro de calcio, como se acaba de demostrar.

Cuando las dos mitades del molde estén listas, vuelva a suspender una vez 10 a la sexta celda de interés por mililitro de medio de alginato estéril. La mezcla aparecerá homogéneamente turbia cuando las células estén adecuadamente dispersas. Luego, transfiera 130 microlitros de células gota a gota a pocillos individuales de seis milímetros de diámetro por tres milímetros de altura en la mitad inferior de la construcción del molde.

Un ligero menisco convexo debe ser visible por encima del borde de cada pocillo. Cuando se hayan sembrado todas las células, use una espátula estéril para alisar cuidadosamente la mitad superior de la construcción del molde. Luego, voltee el molde para que la membrana del microtamiz quede encima de los pocillos y coloque el molde encima de los pocillos, teniendo cuidado de cubrir completamente los pocillos que contienen las mezclas de células y alginatos.

Cuando el molde esté en su lugar, levante la construcción del molde cargada y, presionando firmemente en el centro, coloque clips de encuadernación en los dos lados restantes de la construcción para sujetar las mitades superior e inferior del molde. Las soluciones de alginato celular deben estar firmemente ubicadas en los pocillos. A continuación, sumerja toda la construcción del molde en un baño de cloruro de calcio de 102 milimolares en una campana de cultivo celular a temperatura ambiente durante 90 minutos.

Al final de la incubación, transfiera el constructo a una pila de toallas de papel y retire los dos clips de aglutinante que sujetan la placa del extremo superior al molde. Separa las dos mitades de la construcción. Los hidrogeles formados en los pozos no deben tener burbujas y deben llenar los pozos por completo.

Retire los dos clips de aglutinante restantes y separe el molde que contiene hidrogel de la placa final restante. Con una espátula, trace cuidadosamente el borde de los pocillos que contienen los hidrogeles para aflojar cuidadosamente los geles. Luego, transfiera los hidrogeles directamente a un baño de DPBS con cloruro de calcio y cloruro de magnesio.

Después de uno a cinco minutos, transfiera los hidrogeles a pocillos individuales de una placa de seis pocillos que contenga suficiente solución de medio de crecimiento de albahaca para sumergir completamente los geles durante al menos una hora a 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2. Durante los últimos 30 minutos de la incubación, use clips de aglutinante para sujetar el molde con pozos de la mitad de la altura del molde de formación de gel a la placa final de aluminio de tres por tres pulgadas o tres por 1.5 pulgadas en los lados izquierdo y derecho para crear un molde de corte. Luego, cree el modo de recocido recortando el molde con pozos de tres milímetros más grandes de diámetro que el molde de formación de gel a placas de aluminio de tres por tres pulgadas en los extremos izquierdo y derecho.

Ahora, transfiera los hidrogeles a los pozos del molde de corte. Cada gel debe encajar perfectamente en el pocillo con la mitad del gel sobresaliendo por encima del molde. Y use un bisturí para cortar a lo largo de la superficie del molde para cortar el hidrogel por la mitad.

Dale la vuelta a la mitad superior del gel y colócalo en un pozo de molde abierto. La pieza de gel debe encajar perfectamente en el pozo, pero ahora ambas mitades deben tener la altura del molde, con la superficie interior cortada visible. A continuación, coloque un trozo de membrana de microtamiz de célula seca sobre los pocillos, asegurándose de que la membrana esté en contacto con todas las mitades de gel que se van a recocer, y cubra la membrana con un trozo de papel de filtro grueso.

Cuando los geles estén completamente cubiertos, sature el papel de filtro con citrato de sodio suplementado con EDTA e incube los geles a temperatura ambiente. Después de un minuto, deseche la membrana del microtamiz celular y el papel de filtro grueso y retire los clips de aglutinante. Luego, abra el molde y transfiera la mitad de un gel a un molde de recocido preparado con la superficie de corte hacia arriba.

Con una espátula, transfiera un segundo medio gel tratado al primer gel, de modo que la superficie de corte esté en contacto con la superficie de corte del primer gel. Cuando se hayan colocado todos los geles, use una espátula para presionar suavemente los geles para eliminar las burbujas y sumerja con cuidado el molde de recocido en el baño de cloruro de calcio. Después de 30 minutos, transfiera el molde de recocido a una pila de toallas de papel y retire los clips de encuadernación.

A continuación, separe el molde de la placa final y transfiera los geles brevemente a un baño de DPBS, seguido de su inmersión en el medio de cultivo celular adecuado. Los geles bicapa completados exhiben una separación inicial total de las poblaciones celulares, como se observa en esta imagen de 293 células FT marcadas con tintes rastreadores de glóbulos verdes o rojos. La viabilidad de las células madre mesenquimales humanas incrustadas después del recocido es alta dentro de hidrogeles en capas, similar a la viabilidad celular observada en hidrogeles a granel.

Después de aislar la tensión máxima de cada ciclo durante una compresión cíclica no confinada de cuatro horas, los hidrogeles en capas libres de células exhiben una respuesta de estrés a la compresión cíclica que es significativamente menor en magnitud en comparación con los hidrogeles libres de células a granel sin capas, aunque ambos tipos de hidrogel permanecen intactos después de siete días en cultivo. Una vez dominada, esta técnica, incluida la preparación de todos los materiales, se puede completar en menos de cuatro horas y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante trabajar deliberada y lentamente para evitar errores y para realizar un seguimiento más fácil de las diferentes muestras.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la estimulación mecánica y la inmunotinción para responder preguntas adicionales sobre las interacciones entre las diferentes poblaciones celulares en las matrices extracelulares que puedan formarse. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la mecanobiología y la ingeniería de tejidos investigar más fácilmente la relación entre diferentes poblaciones celulares, como las células madre mesenquimales, los condrocitos y las células pulposas del núcleo. No olvide que trabajar con objetos punzantes, materiales biológicos y, especialmente, células humanas, puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de la ropa de protección personal adecuada mientras se realiza este procedimiento.