Name: Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a fabricar un dispositivo microfluídico neumático para estudiar la mecanobiología de condrocitos en cultivos de hidrogel 3D. Esta plataforma permite aplicar compresiones dinámicas de múltiples magnitudes simultáneamente.

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Agradecemos a los doctores Christopher Moraes y Stephen A. Morin su apoyo para el diseño y la fabricación de dispositivos. Este estudio fue apoyado por la beca Bioingeniería para la Salud Humana de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) y el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC), y la subvención AR070242 del NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor y James R. Talaska de la Instalación Central de Microscopía Avanzada en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska por proporcionar asistencia con microscopía confocal.

NOTA: Use equipo de protección personal (EPP) como guantes y capa de laboratorio para cada paso de este protocolo.
1. Fabricación de moldes maestros
NOTA: Realice los pasos 1.1 - 1.3 en una campana de humo.
<ol><li>Tratamiento de vidrio NOTA: Use un protector facial, guantes y una capa de laboratorio para el paso 1.1.<ol>
<li>Hacer la solución de Piranha (60 mL) mezclando ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) con una relación de volumen de 3:1. ADVERTENCIA: No utilice la solución y la acetona de Piranha en la misma campana de humodebido al riesgo de explosión.</li>
		<li>Colocar una placa de vidrio (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) en la solución de Piranha durante 30 minutos a 40 oC.</li>
		<li>Enjuague la placa de vidrio con agua desionizada (diH2O).</li>
		<li>Coloque la placa de vidrio en acetona a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
		<li>Enjuagar la placa de vidrio con isopropanol y secarla con nitrógeno (N2) gas.</li>
		<li>Hornee la placa de vidrio a 200 oC durante 20 minutos sobre un plato caliente. Todos los pasos posteriores para hornear utilizan un plato caliente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formación de la capa de semillas SU-8 en la placa de vidrio<ol>
<li>Extienda su-8 5 en la placa de vidrio con una pipeta desechable para cubrir alrededor de 2/3 de la superficie de la placa.</li>
		<li>Gire la placa de vidrio con fotorresistentes SU-8 5 a 500 rpm durante 35 s (ciclo de hilado inicial) y luego 2.500 rpm para 40 s (ciclo de hilado final) utilizando una recubridora de giro. Todos los pasos posteriores del recubrimiento de giro incluyen el mismo ciclo de hilado inicial.</li>
		<li>Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 5 a 65 oC durante 2 min y luego a 95 oC durante 5 min.</li>
		<li>Exponga la placa de vidrio recubierto SU-8 5 a la luz UV (60 mW/cm2, la distancia entre la lámpara UV y la fotomáscara es de 20 cm, cantidad total de energía de luz UV a 60 mJ/cm2) durante 1 s. NOTA: El tiempo de exposición UV debe ajustarse de acuerdo con la potencia de una luz UV usada.</li>
		<li>Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 5 a 65oC durante 2 min y a 95oC durante 5 min.</li>
		<li>Coloque la placa de vidrio al horno en el desarrollador SU-8 durante 2 min.</li>
		<li>Hornee el vaso recubierto SU-8 5 a 180 oC durante 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fabricación de patrones de canal SU-8 mediante fotolitografía(Figura 2a Paso 1-3)<ol>
<li>Vierta SU-8 100 en la placa de vidrio SU-8 5 sembrada para cubrir alrededor de 2/3 de la superficie de la placa.</li>
		<li>Gire la placa de vidrio con SU-8 100 a 3.000 rpm durante 38 s (90 m de espesor).</li>
		<li>Hornee la placa de vidrio recubierta SU-8 100 a 65 oC durante 10 min y luego a 95 oC durante 30 min. Si su-8 100 sigue pegajoso después de este procedimiento, hornee la placa de vidrio durante más tiempo a 95 oC hasta que su-8 100 se vuelva no pegajoso.</li>
		<li>Coloque una fotomáscara de microcanal de alta resolución (25.400 ppp, véase la figura suplementaria 1) en la placa de vidrio recubierta SU-8 100 y exponga la placa de vidrio cubierta de fotomáscara a la luz UV durante 4 s (cantidad total de energía de luz UV a 240 mJ/cm2). NOTA: El tiempo de exposición UV debe ajustarse de acuerdo con la potencia de una luz UV usada.</li>
		<li>Retirar la fotomascarilla de la placa de vidrio y hornear la placa de vidrio a 65 oC durante 2 min y luego 95 oC durante 20 min.</li>
		<li>Mantenga la placa de vidrio horneada en un recipiente, que está envuelta con papel de aluminio para bloquear cualquier luz, para el curado durante la noche.</li>
		<li>Desarrolle patrones de canal SU-8 100 en la placa de vidrio en el desarrollador SU-8 durante 15 min.</li>
		<li>Lave la placa de vidrio con patrón SU-8 (molde maestro) con alcohol isopropílico y séquela con gas N2. Si las partículas blancas permanecen durante este proceso, repita el paso 7 durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Unidad de accionamiento neumático
<ol><li>Capa de microcanal (Capa 1) NOTA: Realice los pasos 2.1.1 - 2.1.2 en una campana de humo.<ol>
<li>Dejar caer 200 l de (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Triclorosilano en un cubreobjetos y colocarlo en una cámara de vacío con el molde maestro.</li>
		<li>Aplicar vacío durante 2 minutos en la cámara y esperar 6 h (o durante la noche) para la silanización del molde.</li>
		<li>Mezclar PDMS con una relación de peso de 10:1 (prepolímero:agente de curado) durante 5 min. NOTA: Todos los pasos de fundición PDMS subsiguientes contienen el mismo prepolímero y la misma relación de peso del agente de curado (10:1).</li>
		<li>Vierta PDMS en el molde maestro y desgasifique PDMS en una cámara de vacío durante 30 min.</li>
		<li>Sandwich PDMS con una película de transparencia.</li>
		<li>Sujete el conjunto emparedado anterior con una placa de vidrio, almohadillas de espuma y placas de plexiglás(Figura 2a Paso 4).</li>
		<li>Curar PDMS en un horno a 80oC durante 6 h.</li>
		<li>Aísle la capa PDMS (Capa 1) con la película de transparencia de la estructura emparecida(Figura 2a Paso 5).</li>
		<li>Active las superficies de la Capa 1 y una placa de vidrio limpia (placa de vidrio 1; 50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) utilizando un limpiador de plasma durante 1 min. NOTA: El tiempo de limpieza del plasma puede variar en función de la potencia de un limpiador de plasma usado.</li>
		<li>Una capa 1 sobre la placa de vidrio 1 y colóquelas en el horno a 80 oC durante 30 min.</li>
		<li>Elimine la película de transparencia de la Capa 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membrana Thin PDMS (Capa 2)<ol>
<li>Recubre PDMS sin curar en una película de transparencia a 1.000 rpm durante 1 min para obtener una capa PDMS de 60 m de espesor.</li>
		<li>Curar parcialmente PDMS recubierto de espín (Capa 2) en el horno a 80oC durante 20-30 min.</li>
		<li>Active la Capa 1 en la placa de vidrio 1 y la capa 2 utilizando el limpiador de plasma durante 1 min. NOTA: El tiempo de limpieza del plasma puede variar en función de la potencia de un limpiador de plasma usado.</li>
		<li>Une la Capa 2 sobre la Capa 1 y colócala en el horno a 80oC durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloque de tubos<ol>
<li>Coloque los tubos metálicos verticalmente en una placa de petri.</li>
		<li>Vierta suavemente PDMS en el plato para sumergir alrededor de 3/4 de los tubos metálicos.</li>
		<li>Curar PDMS en el horno a 60oC durante 6 h (o durante la noche).</li>
		<li>Corte un trozo de bloque PDMS que contenga un tubo metálico.</li>
		<li>Haga un agujero en la capa 2 para la entrada.</li>
		<li>Active el bloque PDMS y la Capa 2 utilizando el limpiador de plasma durante 1 min.</li>
		<li>Coloque el bloque PDMS en la parte de entrada de la Capa 2 y coloque toda la unidad de accionamiento en el horno a 80 oC durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Construcciones de alginato-condrocitos (o perlas)
<ol><li>Placa de vidrio amino-silanizado<ol>
<li>Cortar una placa de vidrio (50,8 mm x 76,2 mm x 1,2 mm) en dos placas de vidrio de tamaño medio (50,8 mm a 38,1 mm x 1,2 mm) con un escriba de diamante.</li>
		<li>Coloque las placas de vidrio en cloruro de hidrógeno de 0,2 M (HCl) y agítelas suavemente (por ejemplo, 55 rpm) durante la noche.</li>
		<li>Enjuague las placas de vidrio con diH2O.</li>
		<li>Agitar las placas de vidrio en hidróxido de sodio de 0,1 M (NaOH) durante 1 h a 55 rpm y enjuagarlas con diH2O.</li>
		<li>Agitar las placas de vidrio en 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) durante 1 h a 55 rpm y enjuagar con diH2O.</li>
		<li>Seque las placas de vidrio amino-silanizadas en una campana de humodurante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Molde de gel de agarosa para construcciones de gel de alginato<ol>
<li>Mezclar 5% (p/v) agarosa y 200 mM de cloruro de calcio (CaCl2) en diH2O.</li>
		<li>Hervir la solución de gel de agarosa con un horno microondas (o una placa caliente). El tiempo de ebullición varía en función del volumen de la solución de gel de agarosa y la potencia del horno microondas (o la temperatura de la placa caliente).</li>
		<li>Vierta la solución de gel de agarosa hervida en un molde de aluminio (ver Figura Suplementaria S2) y empareje con una placa de vidrio.</li>
		<li>Espere 5 minutos y desmolde el gel de agarosa solidificado del molde de aluminio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cosecha de condrocitos de placas de crecimiento<ol>
<li>Aislar las placas de crecimiento de las extremidades posteriores de los ratones neonatales.</li>
		<li>Colocar las placas de crecimiento en 1 ml de colagenasa al 0,25% durante 3 h en una incubadora a 37oC y 8% de dióxido de carbono (CO2),para eliminar la matriz extracelular (ECM).</li>
		<li>Centrifugar la muestra digerida durante 5 min a 125 x g para hacer un pellet de condrocitos y eliminar el sobrenadante de la muestra. Aquí, 1 x g es la aceleración de la gravedad.</li>
		<li>Resuspenda el pellet de condrocitos en 1 ml del medio de águila modificado (DMEM) modificado de Dulbecco.</li>
		<li>Cuente el número de condrocitos en DMEM utilizando un contador de células.</li>
		<li>Centrifugar los condrocitos en DMEM durante 5 min a 125 x g para hacer un pellet de condrocitos de nuevo y eliminar el sobrenadante de la muestra.</li>
		<li>Opcionalmente, resuspenda el pellet de condrocitos en los medios de cultivo de condrocitos (CCM)34 que contiene 2 M de calceína AM, e incubar la muestra a 37 oC durante 30 minutos. Repita el paso 3.3.6 y pase al paso 3.3.8.</li>
		<li>Resuspenda el pellet de condrocitos en el volumen deseado de MCP y guárdalos en la incubadora a 37oC y 8% deCO2 antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construcciones de alginato-condrocitos (o perlas) (Figura 2c)<ol>
<li>Mezclar 1.5% (p/v) de alginato en solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 5 mg/ml de sulfo-NHS, 10 mg/ml de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC).</li>
		<li>Añadir 8 x 106 condrocitos en la solución de 1 ml de gel de alginato [o Añadir 3 éL de perlas fluorescentes de 1 m de diámetro (542/612 nm) en 1 ml de solución de gel de alginato (0,3% (v/v))].</li>
		<li>Colocar 150 l de la solución de alginato-condrocitos (o perla) en la placa de vidrio amino-silanizado fabricada en el paso 3.1.</li>
		<li>Cubra la solución de gel de alginato con el molde de gel de agarosa durante 3 min.</li>
		<li>Retire la solución excesiva de gel de alginato que se desborda del molde de gel de agarosa con una cuchilla de afeitar y retire el molde de gel de agarosa. Luego, las construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos (o perlas) se obtienen en la placa de vidrio amino-silanizado.</li>
		<li>Colocar las construcciones de alginato-condrocitos en solución reticulante (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl en diH2O) durante 1 min para una mayor polimerización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Montaje del dispositivo (Figura 2d)
NOTA: Los espaciadores PDMS y las abrazaderas impresas en 3D deben prepararse por separado.
<ol><li>Localice cuatro espaciadores PDMS de 1 mm de espesor en las cuatro esquinas de la Capa 2 de la unidad de accionamiento.</li>
	<li>Coloque 700 l de MCP para cubrir las cámaras de aire de la capa 2.</li>
	<li>Coloque las construcciones de alginato-condrocitos (o perlas) en la Capa 2 mientras alinea cuidadosamente las construcciones con las cámaras de aire.</li>
	<li>Sujete el dispositivo con abrazaderas impresas en 3D(Figura 1c).</li>
</ol>5. Actuación del dispositivo
<ol><li>Conecte la salida de una bomba de aire (ver Tabla de Materiales)con la entrada de una válvula solenoide con un tubo de silicio.</li>
	<li>Conecte la salida de la válvula solenoide con la entrada del dispositivo montado con un tubo de silicio.</li>
	<li>Conecte la válvula solenoide con un generador de funciones.</li>
	<li>Manipular la válvula solenoide con una onda cuadrada (por ejemplo, 1 Hz) generada por el generador de funciones.</li>
	<li>Encienda la bomba de aire para accionar el dispositivo neumáticamente.</li>
</ol>6. Imágenes de condrocitos en el dispositivo
NOTA: Para obtener una buena calidad de imagen, los condrocitos de imagen (o cuentas fluorescentes) en gel de alginato a través de la placa de vidrio 2 porque los globos PDMS expandidos y las cámaras de aire pueden distorsionar las imágenes ópticas. Si se utiliza un microscopio invertido para la toma de imágenes, el dispositivo debe configurarse de modo que la placa de vidrio 2 se dirija hacia abajo.
<ol><li>Prepare el dispositivo con condrocitos (o perlas fluorescentes) como se muestra en las secciones anteriores.</li>
	<li>Tome imágenes de pila zde condrocitos (o cuentas fluorescentes) con un microscopio confocal antes y bajo compresión, respectivamente. Elija un tamaño de paso zen función de la profundidad de campo de un sistema de imágenes confocales utilizado.</li>
	<li>La altura de los condrocitos (o una construcción de alginato-perla) se puede medir con el método de procesamiento automático de imágenes mostrado en las literaturas anteriores26,35.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para probar los efectos de la tensión compresiva en los condrocitos de la placa de crecimiento, desarrollamos el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos(Figura 1) para aplicar varios niveles de tensión compresiva a los condrocitos en el andamio de hidrogel de alginato para 3D cultura de alto rendimiento. Para ayudar a otros investigadores a adoptar nuestro dispositivo o desarrollar dispositivos similares, proporcionamos detalles de los pasos de fabricación del dispositivo en ...

Las plataformas micro-ingeniería son herramientas valiosas para estudiar la biología molecular, celular y de nivel tisular porque permiten el control dinámico de los microambientes físicos y químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Por lo tanto, múltiples hipótesis se pueden probar simultáneamente de una manera estrechamente controlada. En el caso del cartílago de la placa de crecimiento, hay crecientes evidencias de un papel importante de la tensión compresiva en la modulación del crecimiento óseo a través de la acción en el cartílago de la placa de crecimiento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Sin embargo, el mecanismo de acción del estrés compresivo– en particular, cómo el estrés guía la formación de columnas de condrocitos en la placa de crecimiento – se entiende mal.
El objetivo de este protocolo es crear un dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos de accionamiento neumático26 para dilucidar los mecanismos de mecanobiología en condrocitos de placas de crecimiento(Figura 1a-c). El dispositivo consta de dos partes: la unidad de accionamiento neumático y la construcción del gel de alginato. La unidad de accionamiento neumático microfluídico se fabrica utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) basado en la fotolitografía y la litografía blanda. Esta unidad contiene una matriz de 5 x 5 de globos de membrana PDMS delgados que se pueden inflar de manera diferente en función de sus diámetros. La construcción del gel de alginato consiste en los condrocitos incrustados en una matriz de 5 x 5 cilindros de gel de alginato, y todas las construcciones de alginato-condrocitos se ensamblan con la unidad de accionamiento. Las construcciones de gel de alginato son comprimidas por los globos PDMS inflados neumáticamente(Figura 1b). El dispositivo microfluídico puede generar cinco niveles diferentes de tensión de compresión simultáneamente en una sola plataforma en función de las diferencias en el diámetro del globo PDMS. Por lo tanto, una prueba de alto rendimiento de la mecanobiología de condrocitos bajo múltiples condiciones de compresión es posible.
El dispositivo microfluídico descrito en este protocolo tiene muchas ventajas sobre el dispositivo de compresión convencional, como los fijadores externos14,21,23 y los dispositivos de compresión macroscópica16, 19 , 27 , 28 para el estudio de la mecanobiología del condrocitos: 1) El dispositivo microfluídico es rentable porque consume un volumen de muestras más pequeño que el dispositivo de compresión macroscópica, 2) El dispositivo microfluídico es eficaz en el tiempo porque puede probar múltiples condiciones de compresión simultáneamente, 3) El dispositivo microfluídico puede combinar estímulos mecánicos y químicos formando un gradiente de concentración de productos químicos basado en la mezcla limitada en microcanales, y 4) Diversas técnicas de microscopía (time-lapse microscopía microscópica y microscopía confocal de fluorescencia) se puede aplicar con el dispositivo microfluídico hecho de PDMS transparente.
Adoptamos y modificamos el método de Moraes et al.7,29 para crear diferentes niveles de tensión compresiva en un solo dispositivo para permitir estudios de mecanobiología de alto rendimiento de compresión de condrocitos. Nuestro enfoque es apropiado para las células (por ejemplo, condrocitos) que necesitan un entorno de cultivo tridimensional (3D) y para ensayos biológicos después de comprimir las células. Aunque algunos dispositivos de compresión celular microfluídica pueden comprimir células cultivadas en sustratos bidimensionales (2D)30,31,32,no se pueden utilizar para condrocitos porque los condrocitos cultivados 2D desdiferenciado. Existen plataformas microfluídicas para comprimir células cultivadas en 3D en hidrogeles fotopolimerizados7,33,pero están limitadas en el aislando de células después de experimentos de compresión porque aislar las células de fotopolimerizado hidrogel no es fácil. Además, es posible que sea necesario evaluar los efectos de la exposición ultravioleta (UV) y los iniciadores de reticulación foto en las células. Por el contrario, nuestro método permite un rápido aislamiento de las células después de experimentos de compresión para ensayos postbiológicos porque los hidrogeles de alginato pueden ser despolimerizados rápidamente por los quelantes de calcio. Los métodos detallados de fabricación y caracterización del dispositivo se describen en este protocolo. En la Figura 2se muestra un breve procedimiento para fabricar el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano (ATPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahidrooctilo)-1-triclorosilano</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>Lámina acrílica</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de aire</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>Utilizamos el modelo comprado en 2015. El diseño interno y el rendimiento de la bomba de aire (SP 500 EC-LC) cambiaron a principios de 2016. Además, el rendimiento de la bomba de aire ha cambiado con el paso del tiempo. Por lo tanto, la presión de aire generada por una bomba de aire SP 500 EC-LC debe calibrarse antes de su uso.</td></tr><tr><td>Polvo de alginato</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>Conectores rectos de lengüeta (tubo de metal)</td><td>Pneumadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Partículas fluorescentes acuosas teñidas de rojo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de espuma</td><td>GRAINGER</td><td>Artículo # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>Función / Generador de forma de onda arbitraria</td><td>Keysight Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Fisher Biorreactivos</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Keysight Technologies</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Colector de solenoide</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de solenoide</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>Barnizadora de centrifugación</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Revelador</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>EMD Millipore</td><td>MSX12445</td><td></td></tr></tbody></table>

una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Se sabe que los estímulos mecánicos modulan las funciones biológicas de las células y los tejidos. Estudios recientes han sugerido que el estrés compresivo altera la arquitectura del cartílago de la placa de crecimiento y resulta en la modulación del crecimiento de los huesos largos de los niños. Para determinar el papel de la tensión compresiva en el crecimiento óseo, creamos un dispositivo microfluídico accionado por presión neumática, para comprimir dinámicamente (o estáticamente) los condrocitos de la placa de crecimiento incrustados en cilindros de hidrogel de alginato. En este artículo, describimos métodos detallados para fabricar y caracterizar este dispositivo. Las ventajas de nuestro protocolo son: 1) Se pueden generar cinco magnitudes diferentes de tensión compresiva en cinco réplicas técnicas en una sola plataforma, 2) Es fácil visualizar la morfología celular a través de un microscopio de luz convencional, 3) Las células pueden aislarse rápidamente desde el dispositivo después de la compresión para facilitar los ensayos aguas abajo, y 4) La plataforma se puede aplicar para estudiar la mecanobiología de cualquier tipo de célula que pueda crecer en hidrogeles.

Este artículo muestra los pasos detallados de la fabricación del dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos (Figura 2). El dispositivo contiene 5 matrices x 5 de construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos, y estas construcciones se pueden comprimir con cinco magnitudes diferentes de compresión(Figura 1, Figura 3 y Figura 4). La altura del microcanal neumático es de alrededor de 90 m...

Este artículo proporciona métodos detallados para fabricar y caracterizar un dispositivo microfluídico de accionamiento neumático para la compresión de condrocitos.

Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Este dispositivo de compresión microfluídica activado neumáticamente se puede utilizar para estudiar la mecanobiología en cultivos de hidrogel 3D de condrocitos de placas de crecimiento. El dispositivo microfluídico es rentable y eficaz en el tiempo, ya que puede generar simultáneamente múltiples magnitudes de una compresión en pequeños volúmenes de muestras, y se pueden aplicar varias imágenes microscópicas con el dispositivo. Nuestro método también se puede aplicar al estudio de la mecanobiología de otros tipos de células.Para configurar la capa de microcanal, primero mezcle PDMS con una relación de peso de 10 prepolímeros a un agente de curado durante cinco minutos. A continuación, coloque el molde en una almohadilla de espuma y vierta la mezcla en el molde maestro. Desgasar el PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos y emparedar los PDMS desgastados con una pieza de película de transparencia.Sujete el conjunto emparedado con la placa de vidrio, las almohadillas de espuma y las placas de plexiglás. Cure los PDMS a 80 grados centígrados durante seis horas y aísle la capa PDMS y la película de transparencia de la estructura intercalada. Active las superficies del PDMS y una placa de vidrio limpia con el limpiador de plasma durante un minuto antes de unir el PDMS a la placa de vidrio en el horno Celsius de 80 grados durante 30 minutos.A continuación, quite la película de transparencia. Para la preparación de la membrana delgada PDMS, gire la capa PDMS sin curar en una película de transparencia a 1.000 rotaciones por minuto durante un minuto para obtener una capa PDMS de 60 micrómetros de espesor. Curar parcialmente los PDMS recubiertos de centrifugado a 80 grados Celsius durante 20 a 30 minutos antes de usar el limpiador de plasma para activar la capa PDMS de microcanal en la placa de vidrio y la capa delgada PDMS durante un minuto.A continuación, une la fina capa de membrana PDMS a la capa PDMS de microcanal y coloca las capas en el horno Celsius de 80 grados durante la noche. Para la preparación de bloques de tubos, coloque los tubos metálicos verticalmente sobre una placa de petri y vierta suavemente PDMS no curados en el plato hasta que aproximadamente 3/4 de los tubos estén sumergidos. Después de desgasar el PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos, cure el PDMS en el horno a 60 grados centígrados durante más de seis horas.Al final del proceso de curado, corte un fragmento de bloque PDMS que contenga un tubo y realice un agujero en la capa delgada de PDMS para la entrada. Active el bloque PDMS y la capa delgada PDMS con el limpiador de plasma. Después de un minuto, conecte el bloque PDMS al orificio de entrada de la capa delgada PDMS y coloque toda la unidad de accionamiento en el horno a 80 grados centígrados durante la noche.Para la preparación del moho de gel de agarosa, mezcle el 5% de la agarosa y el cloruro de calcio 200 mililitros en agua desionizada y caliente la solución de gel de agarosa hasta que hierva. Vierta la solución de gel de agarosa hervida en un molde de aluminio y emparece el molde con la placa de vidrio. Después de cinco minutos, retire el gel de agarosa solidificado del molde de aluminio.Placa 150 microlitros de solución de alginato-condrocitos sobre la placa de vidrio aminosilizado y cubrir la solución con moho de gel de agarosa durante tres minutos. Al final de la incubación, utilice una cuchilla de afeitar para eliminar la solución excesiva de gel de alginato y retire el molde de gel de agarosa de la placa. A continuación, coloque las construcciones de condrocitos de alginato en una solución de reticulación que contenga cloruro de calcio de 50 milimolar y cloruro de sodio de 140 milimolar en agua desionizada durante un minuto.Para ensamblar el dispositivo, localice cuatro espaciadores PDMS de un milímetro de grosor en las cuatro esquinas de la capa delgada PDMS de la unidad de accionamiento. Cubra las cámaras de aire de la fina capa PDMS con 700 microlitros de medio de cultivo de condrocitos. Usando un microsope estéreo, coloque la construcción de condrocitos de alginato en la capa delgada PDMS, teniendo cuidado de alinear las construcciones con las cámaras de aire, y sujete el dispositivo con abrazaderas impresas en 3D.Para la accionamiento del dispositivo, utilice una pieza de tubo de silicio para conectar la salida de una bomba de aire con la entrada de una válvula solenoide. Utilice una pieza adicional de tubo para conectar la salida de la válvula solenoide con la entrada del dispositivo montado. Conecte la válvula solenoide con un generador de funciones y utilice una onda cuadrada de hercio generada por el generador de funciones para manipular la válvula solenoide.A continuación, encienda la bomba de aire para accionar el dispositivo neumáticamente. El dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos contiene cinco por cinco matrices de construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos y estas construcciones se pueden comprimir con cinco magnitudes diferentes de compresión. En este ejemplo, la columna de gel se comprimió un 33,8% de altura por el globo PDMS más grande y la cepa compresiva resultante de las construcciones de gel aumentó aproximadamente un 5% por incremento de 0,2 milímetros y el diámetro del globo PDMS.La deformación compresiva de los condrocitos se determinó mediante la toma de imágenes de las células en un volumen de 613 por 613 por 40 a 55 micrómetros cerca del centro de construcción del gel. Aquí se muestra una imagen de un condrocitos que fue comprimido en un 16% por el globo PDMS más grande. En este gráfico, se puede observar la distribución de los valores de deformación unitaria de compresión celular medidos.En este análisis, las celdas se comprimieron más en general mediante globos PDMS más grandes. En conjunto, estos datos sugieren que las cantidades de gel de alginato y compresión de condrocitos están controladas por el diámetro de los globos PDMS bajo una presión constante de 14 kilopascales. Para garantizar la repetibilidad del rendimiento del dispositivo, es crucial crear una membrana DELGADA PDMS con un espesor y elasticidad constantes.Después de este procedimiento, se pueden realizar varios ensayos biológicos, como la inmunofluorescencia y la hibridación in situ. Usando esta técnica, muchas preguntas sobre la mecanotransducción en placa de crecimiento o condrocitos articulares pueden ser respondidas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Un sistema 3D de los condrocitos articulares humanos en cultivo de altos niveles de líquido sinovial se describe. El líquido sinovial refleja el microambiente más naturales para el cartílago articular, y puede ser fácilmente obtenido y almacenado. Así, este sistema puede ser utilizado para el estudio de la regeneración del cartílago y de terapias de detección para el tratamiento de la artritis.

Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

La biosíntesis de la matriz extracelular cartilaginosa por los condrocitos pueden ser afectados por la aplicación de estímulos mecánicos. Este método describe la técnica de aplicación de dinámicas tensiones compresivas a los condrocitos encapsulados en construcciones en 3D y la evaluación de los cambios inducidos en el metabolismo de los condrocitos.

La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles

Hemos diseñado un nuevo biorreactor de carga mecánica que se puede aplicar tensión mecánica uniaxial o biaxial a un biocompuesto cartílago antes del trasplante en un defecto de cartílago articular.

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

La reparación del cartílago representa un desafío médico no resuelto y los enfoques basados en células para diseñar el cartílago articular humano son una solución prometedora. Aquí, describimos los hidrogeles biomiméticos tridimensionales (3D) como una herramienta ideal para la expansión y maduración de los condrocitos articulares humanos.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de articulaciones murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse para investigar cómo osteoartritis, factores genéticos o los regímenes de carga diferentes afectan la vulnerabilidad de los condrocitos en situ .

Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Aquí, presentamos protocolos para analizar la remodelación ósea dentro de una plataforma de laboratorio en un chip. Un dispositivo de carga mecánica impreso en 3D se puede emparejar con la plataforma para inducir la transducción de mechanostratos de osteocitos deformando la matriz celular. La plataforma también se puede utilizar para cuantificar los resultados funcionales de remodelación ósea de osteoclastos y osteoblastos (resorción/formación).

Una plataforma Lab-On-A-Chip para estimular la reconversión de mecanonoducción de osteocitos y analizar los resultados funcionales de la remodelación ósea

Proporcionamos métodos detallados para generar cuatro tipos de tejidos a partir de células madre mesenquimales humanas, que se utilizan para recapitular el cartílago, el hueso, la almohadilla de grasa y la membrana sinovial en la articulación de la rodilla humana. Estos cuatro tejidos se integran en un biorreactor personalizado y se conectan a través de microfluídica, generando así una articulación de rodilla en un chip.

Creación de una articulación de rodilla en un chip para modelar enfermedades articulares y probar medicamentos

Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Aprende a fabricar un dispositivo microfluídico neumático para estudiar la mecanobiología de condrocitos en cultivos de hidrogel 3D. Esta plataforma permite aplicar compresiones dinámicas de múltiples magnitudes simultáneamente.

Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica

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