Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas
3 de octubre de 2014
Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado. Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar láminas celulares para construir un parche de tejido ingenierizado. Esto se logra primero tratando la superficie de cultivo celular con el polímero termosensible polipropil acrilamida, también conocido como pNIPAM. El segundo paso consiste en cultivar las células de interés en alta densidad sobre la superficie recubierta con el polímero para crear láminas celulares.
A continuación, las láminas se levantan al reducir la temperatura de la placa, lo que permite que las células se separen de la placa en forma de una lámina celular. El paso final consiste en trasladar las láminas celulares intactas, sin romperlas, hacia un constructo para su implantación. En última instancia, se puede utilizar una microscopía óptica sencilla para demostrar que la lámina celular se ha creado y mantenido durante su manipulación al generar un material tisular ingenierizado implantable.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, que incorporan células en matrices como hidrogeles, es que en esta técnica pueden generarse y mantenerse los bordes laterales de las células como un tejido funcional. Estos métodos también pueden permitir estudios adicionales en el campo de la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, ¿qué tan bien sobreviven las células después del trasplante cuando se encuentran en este estado organizado?
El procedimiento será demostrado por el Dr. William Turner, investigador postdoctoral en mi laboratorio, y la Sra. Snapshot Sand Do. Para comenzar este procedimiento, disuelva 2,6 gramos de P nipam en dos mililitros de una solución al 60 % de tolueno y 40 % de hexano. A continuación, caliente la mezcla a 60 grados Celsius durante 10 minutos y agite hasta que el P nipam se disuelva completamente.
Luego, corte el papel de filtro en un círculo de 60 milímetros de diámetro y colóquelo en un embudo de Buchner. Filtre la solución a través del embudo de Buchner hacia un vaso de precipitados de vidrio previamente pesado. Mantenga el vaso y su contenido en una campana de vacío durante toda la noche.
Posteriormente, pese el vaso de precipitados con pNIPAM. A continuación, agregue alcohol isopropílico al pNIPAM para crear una solución al 50-50 peso/peso. Luego, coloque dos mililitros de la solución sobre la superficie de la placa de cultivo celular y revístala durante cinco minutos bajo luz ultravioleta.
Luego, lave la placa con dos mililitros de PBS tibio dos veces antes de usarla para el cultivo celular. En este procedimiento, primero aísle las células musculares lisas aórticas de rata lavando las células con dos mililitros de PBS tibio. A continuación, agregue tres mililitros de tripsina o cualquier otra solución disociadora de escisión a las células e incube durante cinco minutos.
Luego, agregue tres mililitros del medio de cultivo o PBS que contenga 10 %FBS a las células. Después, recolecte las células en un tubo cónico y cuéntelas. Posteriormente, centrifugue las células a 1000 RPM durante cinco minutos.
Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en el medio de crecimiento. A continuación, coloque el medio que contiene las células sobre una placa de 35 milímetros sensible a la temperatura a una concentración que alcance 100 % de confluencia, luego incube durante la noche a 37 grados Celsius para mantener la adhesión celular a la placa. Ahora recolecte las células endoteliales y dispérselas en una solución de células individuales.
Se puede utilizar también una solución de tripsina al 1x, aguda o tampón de disociación celular para la dispersión en células individuales. A continuación, desactive la enzima tripsina con una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja o con FBS al 10 % en PBS. Luego, recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros.
Cuente las células con un hemocitómetro y calcule el volumen necesario para las dimensiones del parche; para un parche de cuatro milímetros, se utilizan 2 millones de células endoteliales. Después de eso, extraiga 2 millones de células y colóquelas en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Luego, centrifugue las células durante cinco minutos, aspire el sobrenadante, dejando las células como un sedimento en el tubo cónico. Ahora, prepare el hidrogel de aurina alta de acuerdo con el protocolo de la empresa.
Mezcle aurina alta y gelatina líquida en una proporción uno a uno. Posteriormente, transfiera el 80 % del volumen final total al tubo cónico que contiene el precipitado y resuspenda las células endoteliales en la mezcla de gelatina con aurina alta. A continuación, transfiera las células suspendidas a la matriz fibrosa.
Añada el 20% del volumen final total del agente de reticulación e incube a 37 grados Celsius durante una hora. En este paso, retire la placa tratada de 35 milímetros de P nypa que contiene las células del incubador y colóquela en una cabina de cultivo celular. A temperatura ambiente, aspire rápidamente el medio de las células.
Luego, agregue dos mililitros de gelatina normal al 6% a 37 grados Celsius a la placa mientras la gelatina aún esté caliente, coloque la rejilla metálica en la gelatina, sumergiéndola por debajo de la superficie de la gelatina normal. Posteriormente, coloque toda la placa sobre hielo durante cinco a siete minutos, permitiendo que la gelatina se endurezca. Después de siete minutos, use una espátula para separar cuidadosamente los bordes de la gelatina del costado de la placa.
A continuación, levante la rejilla metálica de la placa con pinzas. Transfiera la lámina de células al recipiente y colóquela encima de la combinación de hidrogel matriz fibrosa. Añada dos mililitros de medio a 37 grados Celsius a la placa de cultivo de tejidos e incube durante la noche para permitir que la lámina de células se adhiera a la superficie del hidrogel.
Mientras tanto, retire la rejilla metálica después de que la solución se haya calentado. Aquí, las células se cultivaron en una superficie recubierta con Pippa y luego se trasladaron como una lámina a la superficie de la matriz fibrosa. En ensayos iniciales que no se transfirieron con la rejilla metálica de gelatina, se obtuvieron pequeños fragmentos desgarrados.
Esta imagen representa una composición temprana del diseño del parche que combina el marcador mitocondrial, células de músculo liso aórtico de rata teñidas de rojo, células endoteliales de vena umbilical humana fluorescentes con amarillo verde de calcio y la imagen de luz transmitida. Y esta es la composición de la lámina celular combinada con la combinación de hidrogel de matriz fibrosa de base más resistente. Esta imagen compuesta se tomó desde la parte inferior del parche a través de una matriz fibrosa de base más resistente, y esta imagen compuesta de las láminas celulares se obtuvo sobre la matriz fibrosa de base.
Las células en combinación con el hidrogel en la lámina cubren la base de hidrogel combinado fibroso, que muestra una fluorescencia aumentada en los bordes debido al agrupamiento de las células. Esta es una imagen de transmisión del constructo y de la matriz fibrosa natural autofluorescente en DPI que se muestra aquí. Tras seguir este procedimiento, otros experimentos de ingeniería de tejidos pueden responder otras preguntas, como cómo la alineación y comunicación celular afectan el éxito del trasplante.
Esta técnica permite a los investigadores en ingeniería de tejidos explorar formas complejas de trasplantar múltiples tipos de células. No olvide que trabajar con disolventes puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como usar mascarillas adecuadas y campanas químicas, al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este estudio se centra en la construcción de un parche de ingeniería tisular utilizando láminas de células. El proceso implica tratar una superficie de cultivo celular con un polímero termosensible y cultivar células para crear láminas íntegras destinadas al implante.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos
- Técnicas de cultivo celular
- Biomateriales
Antecedentes
- La creación de estructuras organizadas de tejidos complejos requiere múltiples tipos de materiales y células.
- La utilización de láminas celulares estratificadas específicas de órganos mejora la integración del tejido.
- Los materiales derivados de fuentes biológicas pueden favorecer la formación de nuevos vasos.
- Los polímeros sensibles a la temperatura facilitan la separación de las láminas celulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la construcción de un parche de ingeniería tisular.
- Utilizar láminas celulares para mejorar las técnicas de implantación.
- Demostrar la viabilidad de mantener la integridad celular durante la manipulación.
Métodos Utilizados
- Tratar las superficies de cultivo celular con polipropil acrilamida (pNIPAM).
- Cultivar células a alta densidad sobre la superficie recubierta con polímero.
- Levantar láminas celulares reduciendo la temperatura para desprenderlas.
- Transferir láminas celulares íntegras sobre un constructo para su implantación.
Resultados principales
- Creación exitosa de láminas celulares que pueden manipularse sin romperse.
- La microscopía óptica confirmó la integridad de las láminas celulares durante el proceso.
- El método permite la construcción de materiales implantables obtenidos mediante ingeniería tisular.
- Se demostró el potencial de una vascularización mejorada en tejidos ingenierizados.
Conclusiones
- El estudio presenta un método viable para la creación de parches de tejido ingenierizado.
- El uso de polímeros termosensibles es eficaz para la manipulación de láminas celulares.
- Este enfoque podría avanzar significativamente el campo de la ingeniería de tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la construcción de andamiajes tridimensionales multicelulares utilizando láminas celulares estratificadas, abordando un desafío clave en medicina regenerativa: la entrega de construccos organizados y multicelulares con interacciones célula-célula preservadas y potencial vascular. Al mantener los bordes laterales de las células y permitir la transferencia de las láminas sobre compuestos de biomatriz, la técnica respalda una confianza predictiva en modelos preclínicos de integración y función tisular. Ofrece un enfoque escalable y listo para usar en el diseño terapéutico de tejidos, aplicable a múltiples sistemas orgánicos más allá del tejido cardíaco.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas al mantener la integridad de la lámina celular y las adhesiones laterales durante la manipulación.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para la validación funcional de objetivos mediante la administración organizada de células.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación posterior de compuestos mediante la creación de construccos de tejido estandarizados e implantables.
- Valor operativo: Facilita la disponibilidad del ensayo mediante la separación y transferencia de láminas dependiente de la temperatura, lo que permite un flujo de trabajo escalable.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mejora la relevancia de la enfermedad al combinar células específicas del órgano con hidrogeles permisivos para la neovascularización y células endoteliales.
- Valor operativo: Facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante parches implantables disponibles comercialmente.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y los estudios preclínicos, apoyando la comprobación de hipótesis y la reducción del riesgo mecanicista en aplicaciones de ingeniería de tejidos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la administración controlada de tipos celulares estratificados con interacciones preservadas.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la formación y transferencia reproducibles de láminas celulares sobre plataformas de biomatriz.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos mediante microscopía óptica y seguimiento de fluorescencia para evaluar la integridad de la lámina y la integración vascular.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la construcción de parches implantables con potencial vascular para la evaluación de tejidos funcionales.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad reutilizable para generar construcciones tisulares disponibles comercialmente dirigidas a múltiples órganos diana.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la conservación de las interacciones célula-célula y la arquitectura tisular organizada.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante un recubrimiento de polímero sensible a la temperatura y la elevación de láminas.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar/descartar al reducir la ambigüedad mecanicista en la integración y supervivencia del tejido.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante un mayor valor predictivo en modelos tisulares preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, manipulación de biomateriales y técnicas con polímeros sensibles a la temperatura.
- Depende de la reticulación con UV, la preparación de hidrogeles y un control preciso de la temperatura para la separación de las láminas.
- Necesita una estandarización entre equipos para garantizar una calidad constante de las láminas y una eficiencia uniforme en su transferencia.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes tipos celulares o matrices específicas de órganos.
- Incluye limitaciones prácticas, como los riesgos por disolventes durante la preparación de pNIPAM y la necesidad de manipulación aséptica durante todo el proceso.
