Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

El objetivo general de este procedimiento es utilizar láminas de células para construir un parche de ingeniería tisular. Esto se logra tratando primero la superficie del cultivo celular con el polímero termosensible poli propilacrilamida, también conocido como p nipam. El segundo paso es cultivar las células de interés en una alta densidad en la superficie recubierta de polímero para crear láminas de células.

A continuación, las láminas se levantan bajando la temperatura de la placa, lo que permite que las células se desprendan de la placa como una lámina de células. El paso final es mover las láminas de células intactas sin rasgarlas en una construcción para la implantación. En última instancia, la microscopía óptica simple se puede utilizar para mostrar que la lámina celular se ha creado y mantenido durante su manipulación, al tiempo que se crea un material de ingeniería tisular implantable.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, que incrustarán las células en la matriz como hidrogeles, es que en esta técnica, los bordes laterales de las células se pueden generar y mantener como un tejido funcional. Estos métodos también pueden permitir estudios posteriores en el campo de la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, ¿qué tan bien sobreviven las células después del trasplante cuando están en este estado organizado?

Para demostrar este procedimiento estará el Dr. William Turner, becario postdoctoral en mi laboratorio y la Sra. Snapshot. Para comenzar este procedimiento, disuelva 2,6 gramos de P nipam en dos mililitros de una solución de 60% de tolueno y 40% de hexano. A continuación, calienta la mezcla a 60 grados centígrados durante 10 minutos y remueve hasta que el P nipam se disuelva.

A continuación, corta el papel de filtro en un círculo de 60 milímetros de diámetro y colócalo en un embudo buchner. Filtre la solución a través del embudo Buchner en un vaso de precipitados de vidrio prepesado. Mantenga el vaso de precipitados y el contenido en una aspiradora de campana durante la noche.

A continuación, pesa el vaso de precipitados con p nipam. Posteriormente, agregue alcohol isopropílico al P nipam para crear una solución de peso 50 50. A continuación, coloque dos mililitros de la solución en la superficie de la placa de cultivo de tejidos y cúbrala durante cinco minutos bajo luz ultravioleta.

A continuación, lave la placa con dos mililitros de PBS tibio dos veces antes de utilizarla para el cultivo celular. En este procedimiento, primero, aísle las células del músculo liso de la aorta de rata lavando las células con dos mililitros de PBS tibio. A continuación, agregue tres mililitros de tripsina u otra solución disociante de escisión a las células e incube durante cinco minutos.

A continuación, añada tres mililitros del medio de cultivo o PBS que contenga un 10% de FBS a las células. Después de eso, recoja las células en un tubo cónico y cuéntelas. Posteriormente, gire las celdas a 1000 RPM durante cinco minutos.

Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento. A continuación, coloque el medio que contiene las células en una placa termosensible de 35 milímetros a una concentración que logre el 100% de confluencia, luego incube a 37 grados centígrados durante la noche para mantener la adhesión de la célula a la placa. Ahora recoja las células endoteliales y distribúyalas en una solución de una sola célula.

El uso de un tampón de disociación x tripsina, acuado o celular también podría usarse para la dispersión de una sola célula. A continuación, desactive la enzima tripsina con una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja o 10%FBS en PBS. A continuación, recoge las células en un tubo cónico de 15 mililitros.

Cuente las células con un hemocitómetro y calcule el volumen necesario para las dimensiones del parche para un parche de cuatro milímetros, luego se utilizan 2 millones de células endoteliales, extraiga 2 millones de células y colóquelas en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Luego centrifugar las células durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante, dejando las células como una bolita en el tubo cónico. Ahora prepare el hidrogel de alta aurina de acuerdo con el protocolo de la empresa.

Mezcle la aurina alta y la gelatina líquida en una proporción de uno a uno. Posteriormente, transfiera el 80% del volumen final total al tubo cónico que contiene el pellet, resuspenda las células endoteliales en la mezcla de gelatina con alto contenido de aurina. A continuación, transfiera las células suspendidas a la matriz fibrosa.

Añadir el 20% del volumen final total del reticulante e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. En este paso, retire de la incubadora la placa tratada con P nypa de 35 milímetros que contiene las células y colóquela en una campana de cultivo celular. A temperatura ambiente, aspire rápidamente los medios de las células.

Luego agregue dos mililitros de gelatina normal de 37 grados centígrados, 6% mientras la gelatina aún está tibia, coloque la red metálica en la gelatina, sumergiéndola debajo de la superficie de la gelatina normal. Luego, coloque todo el plato en hielo durante cinco a siete minutos, permitiendo que la gelatina se endurezca. Después de siete minutos, use una espátula para separar cuidadosamente los bordes de la gelatina del costado del plato.

A continuación, levante la celosía metálica de la placa con pinzas. Transfiera la lámina de células a la placa y colóquela encima de la combinación de hidrogel de matriz fibrosa. Agregue dos mililitros de medio de 37 grados Celsius a la placa de cultivo de tejidos e incube durante la noche para permitir que la lámina de células se adhiera a la superficie del hidrogel.

Mientras tanto, retire la celosía metálica después de que la solución se haya calentado. Aquí, las células se cultivaron en una superficie recubierta de Pippa y luego se movieron como una lámina a la superficie de la matriz fibrosa. Los primeros ensayos que no se transfirieron con la red metálica de gelatina dieron como resultado pequeños parches andrajosos.

Esta imagen representa una imagen compuesta de diseño de parche temprano que combina el rastreador mito, las células de músculo liso aórtico de rata teñidas de rojo, las células endoteliales de la vena umbilical humana fluorescentes de calcio am verde y la imagen de luz transmitida. Y este es el compuesto de lámina celular combinado con la combinación de hidrogel de matriz fibrosa base más fuerte. Esta imagen compuesta se tomó desde la parte inferior del parche a través de una matriz fibrosa base más fuerte, y esta imagen compuesta de las láminas celulares se tomó sobre la matriz fibrosa base.

Las células de combinación de hidrogel en la lámina cubren la combinación de hidrogel de la matriz fibrosa base, que muestra una mayor fluorescencia en los bordes debido al agrupamiento de las células. Esta es una imagen de transmisión de la construcción y aquí se muestra la matriz de base fibrosa natural autofluorescente en DPI. Siguiendo este procedimiento, otros experimentos de ingeniería de tejidos pueden responder a otras preguntas, como cómo la alineación y la comunicación de las células afectan el éxito del trasplante.

Esta técnica permite a los investigadores en ingeniería de tejidos explorar formas complejas de trasplantar múltiples tipos de células. No olvide que trabajar con solventes puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de mascarillas adecuadas y capuchas químicas, mientras se realiza este procedimiento.