Name: Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a construir parches de ingeniería de tejidos utilizando láminas de células multicapa con polímeros termosensibles. Este método permite crear implantes funcionales manteniendo la integridad celular durante la manipulación.

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Este trabajo fue financiado por un Premio a la Nueva Facultad II del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM; RN2-00921-1), el Premio Nacional de Investigación financiado por los NIH (F32-HL104924) y la Beca de Capacitación del CIRM (TG21163). Los materiales fueron proporcionados por: Glycosan Biosystems Inc / BioTime y el Dr. Stephen Badylak (Universidad de Pittsburgh)

1. Creación de placas recubiertas con PNIPAAm <ol><li> Disolver el 2,6 g de PNIPAAm en 2 ml de una solución de hexano 60% de tolueno / 40%. </li><li> Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 10 min con agitación, hasta que se disuelva el PNIPAAm. </li><li> Cortar el papel de filtro en un círculo de diámetro 60 mm y coloque el papel en el embudo Buchner. </li><li> Se filtra la solución a través de un embudo Buchner en el vaso de vidrio previamente pesado (no utilice plásticos, como el hexano se derretirá plásticos). </li><li> Colocar el vaso y su contenido en un vacío de campana (24 psi) O / N (16 horas). Nota: Hasta que el residuo se hace reaccionar con isopropílico se oxidará así que asegúrese de que no entre en contacto con el oxígeno. </li><li> Pesar el vaso de precipitados para establecer el peso de la PNIPAAm. </li><li> Añadir alcohol isopropílico a la PNIPAAm, la creación de un 50/50 w / w solución. </li><li> Coloque 2 ml de la solución en la superficie de la placa de cultivo de tejidos, y el abrigo durante 5 minutos bajo luz UV. </li><li> Lavar la placa con 2 ml de PBS caliente dos vecesantes de usar para el cultivo celular. </li></ol> 2. Creación de láminas de células Nota: láminas de células de células primarias para el órgano diana pueden ser creados usando un número de diferentes métodos, o mediante el recubrimiento de superficies de cultivo de tejidos con el polímero termosensible tal como se describe aquí. Placas termo-sensible Pre-recubiertos también son ofrecidos por varios proveedores. Nota: Este protocolo es para la cultura utilizando una placa de 35 mm. Brevemente, las células se incubaron primero a 37 ° C durante un mínimo de 24 horas a confluencia de establecer conexiones laterales entre las células adyacentes. Para separar las hojas de células, las placas se someten a temperaturas inferiores a 32 ° C. La lámina de células se transfiere a continuación a la fuerte matriz fibrosa de base que contiene un hidrogel permisiva neovascular con las células endoteliales vasculares. <ol><li> Aislar la población celular. Nota: Este método depende de los procedimientos de derivación individuales y el tipo de células. Rata mu lisa aórticacélulas SCLE (RASMC) se utilizan en este ejemplo. Estos son células musculares lisas primarias aisladas de la aorta abdominal de una rata. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS caliente. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina (u otra solución de escisión / disociar) a las células durante 5 min. </li><li> Inhibir la tripsina mediante la adición de 3 ml de los medios de cultivo, o una solución de tampón fosfato (PBS) que contenía 10% suero bovino fetal (FBS). </li><li> Recoger las células en un tubo cónico y contar una alícuota. </li><li> Girar las células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en su medio de crecimiento (medio de cultivo SmGM2 más kit de bala se utiliza para RASMC). </li><li> Coloque el soporte que contiene las células en un termo-sensible placa de 35 mm - PNIPAAm placa recubierta con una concentración que permitirá alcanzar el 100% de confluencia. Nota: Para RASMCs ese número se determinó que era de 100.000 células / cm 2. Sin embargo, debido a la pérdida de células durante el paso, 120% de que va<html> se utiliza Lue. </li><li> Coloque en una incubadora a 37 ° CO / N. Nota: Es importante mantener las células a 37 ° C para mantener la adhesión de células a la placa. </li></ol> 3 Preparación de Matrix Foundational Nota: Varias matrices fibrosas 3D se pueden utilizar para la capa matriz fibrosa fuerte entre las láminas de células delicadas. Algunos ejemplos incluyen: espuma de gel, bioglass, materiales naturales acellularized 26 o nanospun materiales 27,28 La matriz de la vejiga urinaria porcino (UBM) utilizado en estos estudios fue proporcionado generosamente de nuestro colaborador, el Dr. Badylak 29. <ol><li> Antes de usar, determinar las características de la matriz, incluyendo la falta de contenido celular si se utiliza matriz descelulariza, 27,28 viabilidad de células específicas, y el espacio vacío. 22 </li><li> Cortar la matriz de pre-esterilizados en un tamaño y forma deseados. Nota: Aquí, una perforadora se utiliza para cortar un círculo de diámetro 4 mm. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. células endoteliales Siembra en un neovascular permisivo hidrogel Nota: Las células endoteliales se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluyendo la diferenciación de las células madre o progenitoras. En este caso, se utilizan las HUVEC. <ol><li> Utilice cualquier hidrogel permisiva (fibrina, geles de colágeno), siempre y cuando el tiempo de reticulación es suficientemente corto como para permitir que las células permanecen viables. Nota: En este caso, un gel de ácido hialurónico (HA), basado reticulado se utiliza con un puente disulfuro. </li><li> Preparar el hidrogel HA de acuerdo con el protocolo de empresa. </li><li> Recoger las células endoteliales y se dispersan en una solución de una sola célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase o tampón de disociación celular también podrían utilizarse para la dispersión de células individuales. </li><li> Desactivar la enzima tripsina mediante el uso de una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja (si es importante que las células no entran en contacto con suero) o 10% de FBS en PBS, recogiendo la solución / células en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Cporte de las células, y calcular el volumen necesario para las dimensiones del parche (previamente cuantificados). Nota: Para obtener un parche de 4 mm, se utilizan aquí de 2 millones de células endoteliales. </li><li> Extraer 2 millones de células, y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml. </li><li> Haga girar al (228 xg) durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, dejando las células como sedimento en un tubo cónico. </li><li> Mezclar los materiales líquidos de HA y gelatina en una ración de 1: 1. A continuación, añadir 80% del volumen total en el tubo cónico que contiene el sedimento. </li><li> Resuspender las células endoteliales en la 1: / mezcla de gelatina 1 HA </li><li> Colocar las células en suspensión en la mezcla de HA / gelatina en la base de matriz fibrosa de la Etapa 2. </li><li> Añadir un quinto (20 por ciento) del volumen total deseado de la reticulante </li><li> Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 5. Aislamiento de láminas de células <ol><li> Retire las placas tratadas con PNIPAAm 35 mm que contienen las células de la incubadora y el lugar en una campana de cultivo celular aRT. </li><li> Aspirar rápidamente el medio de las células, y añadir 2 ml de 6% de gelatina normal que se ha calentado a 37 ° C. </li><li> Mientras que la gelatina está todavía caliente, coloque la retícula de metal en la gelatina, sumergiéndolo debajo de la superficie de la gelatina normal (Película 1). </li><li> Toda la placa sobre hielo durante 5 a 7 minutos, lo que permite que la gelatina se endurezca. </li><li> Después de 7 min, utilizar una espátula para separar cuidadosamente los bordes de gelatina desde el lado de la placa, y luego usar fórceps para levantar la retícula de metal de la placa Nota: La gelatina 6%, y la lámina de células debe levantar con la red. </li><li> Mueva la lámina de células a la placa y se coloca en la parte superior de la combinación de matriz de hidrogel de base fibroso, estableciendo cuidadosamente la red en la parte superior de la construcción. Nota: El lado apical de la lámina de células todavía estará en la posición superior. </li><li> Añadir 2 ml de medio caliente (37 ° C). </li><li> Incubar O / N permitiendo que la lámina de células para adherirse a la superficie del hidrogel. </li><li> Retire tretícula de metal después de que la solución se calienta (aproximadamente 1 hora), o al día siguiente. </li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

Los pasos críticos en el protocolo incluyen: el revestimiento de las superficies de la placa con el polímero termosensible y la manipulación de las láminas de células después de enfriar las placas. Debido a que diferentes células exhiben diferentes propiedades físicas, como la adhesividad, el tiempo de elevación debe ser optimizada para cada tipo celular diferente. El segundo, y más desafiante significativamente componente de este protocolo, se centra en la manipulación de la capa celular, un aspecto crítico de los méto...

La inyección de células y/o materiales individuales por sí sola ha mostrado un éxito variable en otros sistemas de órganos y un éxito limitado en la regeneración cardíaca. 5,7-12 En la actualidad, las células derivadas de células madre se administran al tejido dañado utilizando una variedad de métodos de administración que incluyen: inyección directa de células en el tejido y perfusión en el suministro de sangre. 13-17 Otros han implantado células solas, materiales solos y/o en combinación con portadores de materiales para ayudar a regenerar los órganos dañados. 18-21 Este diseño combina múltiples estrategias que proporcionan resistencia del material, patrones en múltiples materiales y múltiples tipos de celdas. 
Específicamente, la matriz fibrosa acelularizada base proporciona la fuerza física fundamental al constructo, lo que lo hace adecuado para suturar en el paciente, si es necesario. Los espacios vacíos en la matriz base se llenan con células endoteliales en un hidrogel permisivo neovascular22 para establecer rápidamente la vascularización de la construcción implantada. Este compuesto se integra con láminas de células premodeladas que permiten una mejor comunicación de célula a célula, imitando más de cerca el tejido nativo. 1,23-25 El proceso general de producción del parche celular en capas se describe en el diagrama de flujo de la Figura 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Rastreador celular / colorante vivo</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Rastreador celular</td></tr><tr><td>Rojo neutro</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Colorante celular visible</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Células de músculo liso aórtico de rata</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Medios de músculo liso</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Células endoteliales venosas humanas</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan/ Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Specific Equipment</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900</td><td></td></tr><tr><td>Embudo de Buchner&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas UpCell&nbsp;</td><td>Nunc&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luz ultravioleta</td><td>Jelight Company&nbsp;</td><td>Limpiador UVO Modelo No.42</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería de tejidos: construcción de un multicelular 3d andamios para la entrega de láminas de células en capas

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Muchos tejidos, tales como los corazones humanos adultos, no son capaces de regenerarse adecuadamente después de un daño. 2,3 Estrategias en la ingeniería de tejidos proponen innovaciones para ayudar al cuerpo en la recuperación y reparación. Por ejemplo, los enfoques de TE pueden ser capaces de atenuar la remodelación cardiaca después de infarto de miocardio (MI) y, posiblemente, aumentar la función total del corazón a un nivel casi normal pre-MI. 4 Como con cualquier tejido funcional, regeneración exitosa del tejido cardíaco implica la correcta entrega de los múltiples tipos de células con señales ambientales que favorecen la integración y la supervivencia del injerto de células / tejido implantado. Tejidos reconstituidos deben abordar varios parámetros, entre ellos: señales solubles, interacciones célula a célula, y materiales de matriz evaluados como vehículos de administración, sus efectos sobre la supervivencia celular, la resistencia del material, y la facilitación de la organización de la célula a los tejidos. Los estudios que emplean la inyección directa de células del injerto sólo ignorar estos elementos esenciales. 2,5,6Un diseño tejido combinando estos ingredientes todavía no se ha desarrollado. A continuación, presentamos un ejemplo de diseños integrados que utilizan capas de láminas de células estampadas con dos tipos distintos de materiales de origen biológico que contenga el tipo de células de órganos diana y las células endoteliales para la mejora de la formación de nuevos vasos en el &quot;tejido&quot;. Aunque estos estudios se centran en la generación de tejido de corazón-como, este diseño de tejido se puede aplicar a muchos otros órganos además de corazón con diseño y el material cambios mínimos, y está destinado a ser un producto fuera de la plataforma para las terapias regenerativas. El protocolo contiene cinco pasos detallados. Una temperatura de poli sensible (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) se utiliza para platos de cultivo de tejidos abrigo. Luego, las células específicas de tejidos se cultivan en la superficie de las placas recubiertas / superficies micropatrón para formar láminas de células con fuertes adherencias laterales. En tercer lugar, se crea una matriz de base para el tejido mediante la combinación de matriz porosa con admisible que neovascularhe hidrogeles y células endoteliales. Finalmente, las láminas de células se levantan de los platos recubiertos PNIPAAm y se transfieren al elemento de base, por lo que la construcción completa.

El diagrama de flujo (Figura 1) muestra el método general de hacer que el parche de varias capas. Láminas de células se separan de la placa tratada PNIPAAm dejando caer la temperatura por debajo de 32 ° C. A continuación, la lámina de células se coloca en la parte superior del hidrogel reticulado que contiene las células endoteliales sembradas en la matriz fibrosa subyacente (Figura 1). Las placas termo-sensible pretratados también se pueden utilizar para crear las láminas de células. S...

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado. Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar láminas celulares para construir un parche de tejido ingenierizado. Esto se logra primero tratando la superficie de cultivo celular con el polímero termosensible polipropil acrilamida, también conocido como pNIPAM. El segundo paso consiste en cultivar las células de interés en alta densidad sobre la superficie recubierta con el polímero para crear láminas celulares.A continuación, las láminas se levantan al reducir la temperatura de la placa, lo que permite que las células se separen de la placa en forma de una lámina celular. El paso final consiste en trasladar las láminas celulares intactas, sin romperlas, hacia un constructo para su implantación. En última instancia, se puede utilizar una microscopía óptica sencilla para demostrar que la lámina celular se ha creado y mantenido durante su manipulación al generar un material tisular ingenierizado implantable.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, que incorporan células en matrices como hidrogeles, es que en esta técnica pueden generarse y mantenerse los bordes laterales de las células como un tejido funcional. Estos métodos también pueden permitir estudios adicionales en el campo de la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, ¿qué tan bien sobreviven las células después del trasplante cuando se encuentran en este estado organizado?El procedimiento será demostrado por el Dr. William Turner, investigador postdoctoral en mi laboratorio, y la Sra. Snapshot Sand Do. Para comenzar este procedimiento, disuelva 2,6 gramos de P nipam en dos mililitros de una solución al 60 % de tolueno y 40 % de hexano. A continuación, caliente la mezcla a 60 grados Celsius durante 10 minutos y agite hasta que el P nipam se disuelva completamente.Luego, corte el papel de filtro en un círculo de 60 milímetros de diámetro y colóquelo en un embudo de Buchner. Filtre la solución a través del embudo de Buchner hacia un vaso de precipitados de vidrio previamente pesado. Mantenga el vaso y su contenido en una campana de vacío durante toda la noche.Posteriormente, pese el vaso de precipitados con pNIPAM. A continuación, agregue alcohol isopropílico al pNIPAM para crear una solución al 50-50 peso/peso. Luego, coloque dos mililitros de la solución sobre la superficie de la placa de cultivo celular y revístala durante cinco minutos bajo luz ultravioleta.Luego, lave la placa con dos mililitros de PBS tibio dos veces antes de usarla para el cultivo celular. En este procedimiento, primero aísle las células musculares lisas aórticas de rata lavando las células con dos mililitros de PBS tibio. A continuación, agregue tres mililitros de tripsina o cualquier otra solución disociadora de escisión a las células e incube durante cinco minutos.Luego, agregue tres mililitros del medio de cultivo o PBS que contenga 10 %FBS a las células. Después, recolecte las células en un tubo cónico y cuéntelas. Posteriormente, centrifugue las células a 1000 RPM durante cinco minutos.Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en el medio de crecimiento. A continuación, coloque el medio que contiene las células sobre una placa de 35 milímetros sensible a la temperatura a una concentración que alcance 100 % de confluencia, luego incube durante la noche a 37 grados Celsius para mantener la adhesión celular a la placa. Ahora recolecte las células endoteliales y dispérselas en una solución de células individuales.Se puede utilizar también una solución de tripsina al 1x, aguda o tampón de disociación celular para la dispersión en células individuales. A continuación, desactive la enzima tripsina con una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja o con FBS al 10 % en PBS. Luego, recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros.Cuente las células con un hemocitómetro y calcule el volumen necesario para las dimensiones del parche; para un parche de cuatro milímetros, se utilizan 2 millones de células endoteliales. Después de eso, extraiga 2 millones de células y colóquelas en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Luego, centrifugue las células durante cinco minutos, aspire el sobrenadante, dejando las células como un sedimento en el tubo cónico. Ahora, prepare el hidrogel de aurina alta de acuerdo con el protocolo de la empresa.Mezcle aurina alta y gelatina líquida en una proporción uno a uno. Posteriormente, transfiera el 80 % del volumen final total al tubo cónico que contiene el precipitado y resuspenda las células endoteliales en la mezcla de gelatina con aurina alta. A continuación, transfiera las células suspendidas a la matriz fibrosa.Añada el 20% del volumen final total del agente de reticulación e incube a 37 grados Celsius durante una hora. En este paso, retire la placa tratada de 35 milímetros de P nypa que contiene las células del incubador y colóquela en una cabina de cultivo celular. A temperatura ambiente, aspire rápidamente el medio de las células.Luego, agregue dos mililitros de gelatina normal al 6% a 37 grados Celsius a la placa mientras la gelatina aún esté caliente, coloque la rejilla metálica en la gelatina, sumergiéndola por debajo de la superficie de la gelatina normal. Posteriormente, coloque toda la placa sobre hielo durante cinco a siete minutos, permitiendo que la gelatina se endurezca. Después de siete minutos, use una espátula para separar cuidadosamente los bordes de la gelatina del costado de la placa.A continuación, levante la rejilla metálica de la placa con pinzas. Transfiera la lámina de células al recipiente y colóquela encima de la combinación de hidrogel matriz fibrosa. Añada dos mililitros de medio a 37 grados Celsius a la placa de cultivo de tejidos e incube durante la noche para permitir que la lámina de células se adhiera a la superficie del hidrogel.Mientras tanto, retire la rejilla metálica después de que la solución se haya calentado. Aquí, las células se cultivaron en una superficie recubierta con Pippa y luego se trasladaron como una lámina a la superficie de la matriz fibrosa. En ensayos iniciales que no se transfirieron con la rejilla metálica de gelatina, se obtuvieron pequeños fragmentos desgarrados.Esta imagen representa una composición temprana del diseño del parche que combina el marcador mitocondrial, células de músculo liso aórtico de rata teñidas de rojo, células endoteliales de vena umbilical humana fluorescentes con amarillo verde de calcio y la imagen de luz transmitida. Y esta es la composición de la lámina celular combinada con la combinación de hidrogel de matriz fibrosa de base más resistente. Esta imagen compuesta se tomó desde la parte inferior del parche a través de una matriz fibrosa de base más resistente, y esta imagen compuesta de las láminas celulares se obtuvo sobre la matriz fibrosa de base.Las células en combinación con el hidrogel en la lámina cubren la base de hidrogel combinado fibroso, que muestra una fluorescencia aumentada en los bordes debido al agrupamiento de las células. Esta es una imagen de transmisión del constructo y de la matriz fibrosa natural autofluorescente en DPI que se muestra aquí. Tras seguir este procedimiento, otros experimentos de ingeniería de tejidos pueden responder otras preguntas, como cómo la alineación y comunicación celular afectan el éxito del trasplante.Esta técnica permite a los investigadores en ingeniería de tejidos explorar formas complejas de trasplantar múltiples tipos de células. No olvide que trabajar con disolventes puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como usar mascarillas adecuadas y campanas químicas, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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