Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato
20 de septiembre de 2016
A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.
El objetivo general de este procedimiento es permitir que un microorganismo evolucione en condiciones de laboratorio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como las relaciones con la función adrenal, las respuestas al estrés, la ingeniería metabólica y, por supuesto, la evolución. La principal ventaja de esta técnica es la selección continua del descendiente más adaptado bajo condiciones de laboratorio específicas.
Comience este procedimiento con la preparación del equipo, así como del medio inicial, medio de estrés y medio de alto estrés, tal como se describe en el protocolo escrito. Inocule una colonia única o E. coli tipo silvestre en un tubo de ensayo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio inicial. Incube el tubo de ensayo en un incubador agitador durante 12 horas a 37 grados Celsius y 220 rpm.
Incube el frasco del quimiostato proporcionando aireación y agitación a 37 grados celsius durante seis horas. Tras la incubación, conecte asépticamente el extremo del tubo de silicona de las bombas al frasco del quimiostato. Transfiera asépticamente un mililitro de precultivo al frasco del quimiostato.
Inicie la bomba de salida y recoja el cultivo en fase exponencial. Verifique la densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo procedente del tubo de salida. Luego, inicie la bomba de entrada.
Verifique la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros en el tubo de salida cada 24 horas. Después de operar el quimostato durante 96 horas, lo que equivale a 9,6 renovaciones completas, cambie el reservorio al medio de mayor estrés de menor concentración. Cuando cambie el reservorio a un medio de mayor estrés, las células podrían sufrir un choque.
Si la densidad celular es demasiado baja, detenga la alimentación con el medio de mayor estrés durante un tiempo para restablecer la densidad celular. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detenga la bomba de alimentación de entrada durante seis horas. Reinicie la bomba de entrada y verifique que la densidad óptica esté por encima de 0,2.
Aumente gradualmente la concentración del agente de estrés cambiando de forma incremental a un depósito que contenga una concentración más alta del agente de estrés. Tome muestras de la cultura adaptada cada vez que alcance un hito de adaptación al agente de estrés y almacénelas para análisis genómico posterior. Para el almacenamiento de las muestras, mezcle la muestra de cultivo de 0,5 mililitros con 0,5 mililitros de una solución esterilizada de glicerol al 80 % y almacénela a 80 grados Celsius.
Prepare un medio de agar al 1,6 % que contenga el mismo agente de estrés en la misma concentración que en el medio. Plaque 0,1 mililitros de la cultura del efluente del quimostato e incube a 37 grados Celsius durante 16 horas. Tras la incubación, seleccione colonias individuales de la placa utilizando un palillo estéril e inocúlelas en tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan el mismo agente de estrés y a la misma concentración del medio que en el quimostato.
Incubar durante seis horas. Transferir un mililitro del caldo de cultivo a un matraz erlenmeyer de 250 mililitros que contenga 50 mililitros de medio. Recoger 0,5 mililitros del caldo de cultivo cada hora y medir la densidad óptica a 600 nanómetros.
Compare la tasa de crecimiento de la cepa adaptada con la de la cepa tipo silvestre dada la presencia del agente de estrés. La cepa de E.coli tipo silvestre se evolucionó en condiciones de estrés elevado por succinato durante 270 días, lo que corresponde a casi 930 generaciones. Cada vez que se añadió un mayor estrés por succinato, la concentración de biomasa disminuyó inmediatamente y luego se restableció.
Se muestra aquí un diagrama esquemático del quimiostato con un mutante que es tolerante al alto estrés por succinato. La mayoría de las células de tipo salvaje son eliminadas bajo las condiciones de estrés y el mutante crece más. Eventualmente, la población del descendiente mutante aumenta.
Las segunda y tercera mutaciones se seleccionan continuamente y finalmente dominan el quimiostato. Esta figura muestra que la cepa adaptada creció sin retraso bajo condiciones de estrés elevado de succinato, mientras que la cepa silvestre no lo hizo. Una estrategia similar puede aplicarse a la evolución adaptativa en laboratorio utilizando un quimiostato con una variación de agentes de estrés.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir y hacer evolucionar al microorganismo bajo una condición específica. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un par de meses. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no eliminar las células del quimiostato agregando demasiado estrés de golpe y recordar verificar la densidad óptica todos los días.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como un análisis del genoma y un análisis del transcriptoma para responder preguntas adicionales, como qué mutación contribuye a la evolución de la tolerancia al estrés?
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la evolución adaptativa en laboratorio de microorganismos utilizando cultivo en quimiostato. Se analiza el análisis genómico de la cepa evolucionada y sus implicaciones en microbiología.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Evolución en Laboratorio
- Análisis Genómico
Antecedentes
- La evolución adaptativa en laboratorio permite que los microorganismos evolucionen bajo condiciones controladas.
- Este método puede proporcionar información sobre las respuestas al estrés y la ingeniería metabólica.
- La selección continua de descendientes mejora el estudio de los procesos evolutivos.
- La preparación inicial del medio es crucial para una implementación exitosa.
Objetivo del estudio
- Permitir que los microorganismos evolucionen en un entorno de laboratorio.
- Investigar las relaciones entre las respuestas al estrés y las adaptaciones evolutivas.
- Facilitar estudios de ingeniería metabólica.
Métodos Utilizados
- Preparación de los medios inicial, de estrés y de alto estrés.
- Inoculación de E. coli en un tubo de ensayo con medio inicial.
- Incubación en un incubador agitador bajo condiciones especificadas.
- Monitoreo continuo de la evolución microbiana.
Resultados principales
- Éxito en la evolución de microorganismos bajo condiciones controladas.
- Conocimientos sobre los mecanismos de respuesta al estrés.
- Aplicaciones potenciales en ingeniería metabólica.
- El análisis genómico revela adaptaciones en las cepas evolucionadas.
Conclusiones
- El protocolo permite la evolución experimental eficaz de microorganismos.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las adaptaciones microbianas.
- Este método puede aplicarse a diversas preguntas de investigación en microbiología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evolución adaptativa en laboratorio mediante cultivo en quimiostato permite la selección continua de cepas microbianas bajo condiciones controladas de estrés, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque genera poblaciones diversas mediante tasas elevadas de división celular, mejorando la confianza predictiva para la ingeniería de cepas y la optimización de vías metabólicas. El método facilita la continuidad traslacional al vincular la evolución en laboratorio con análisis genómicos y transcriptómicos para identificar mutaciones adaptativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la evolución inducida por agentes estresantes y la aclaración de vías.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al identificar cepas adaptativas dominantes bajo presión selectiva.
- Valor predictivo: Genera poblaciones mutantes diversas para la validación funcional de dianas y la identificación de compuestos prometedores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con fenotipos tolerantes al estrés estabilizados para ensayos posteriores.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad de los ensayos mediante cultivo continuo y gradientes definidos de agentes de estrés.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en múltiples agentes de estrés y hospedadores microbianos para disponibilidad en ensayos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los fenotipos de cepas evolucionadas con cambios genómicos, apoyando la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Valor operativo: Proporciona continuidad evolutiva desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante hitos de adaptación trazables.
- Reducción de riesgos: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al vincular la tolerancia al estrés con mutaciones específicas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica, apoyado por la selección continua y los resultados del análisis genómico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la exposición controlada a agentes de estrés y el enriquecimiento de mutantes.
- Selección: Proporciona cultivos reproducibles y listos para ensayos, con monitoreo cuantitativo de densidad óptica para la comparación de cepas.
- Análisis: Permite el análisis genómico y transcriptómico comparativo para identificar mutaciones que contribuyen a la tolerancia al estrés.
- Investigación Traducional: Conecta la evolución en laboratorio con la continuidad preclínica mediante hitos de adaptación documentados y muestras criopreservadas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para evolucionar microorganismos bajo distintos agentes de estrés en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la ingeniería de cepas al revelar los mecanismos de adaptación al estrés.
- Valor operativo: Reduce la intensidad de trabajo después del montaje mediante cultivos continuos automatizados e intervalos de muestreo definidos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular los resultados evolutivos con los factores genómicos que determinan la aptitud.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de cepas basada en mutaciones adaptativas validadas y en el desempeño de crecimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microbiología, operación de quimiostatos y técnicas asépticas.
- Depende de instrumentación para el control preciso de bombas, aireación, agitación y monitoreo de densidad óptica.
- Necesita estandarización entre equipos para la preparación de medios, gradientes de estrés y protocolos de muestreo.
- Incluye consideraciones de adaptación al transferir cepas evolucionadas a ensayos de validación en matraces agitados o en placas.
- Comprende limitaciones prácticas, como el riesgo de lavado celular bajo estrés excesivo y la necesidad de verificaciones diarias de densidad óptica para mantener la estabilidad del cultivo.
