Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

El objetivo general de este procedimiento es permitir que un microorganismo evolucione en condiciones de laboratorio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como las relaciones de la función suprarrenal, las respuestas al estrés, la ingeniería metabólica y, por supuesto, la evolución. La principal ventaja de esta técnica es la selección continua del descendiente más demandado en condiciones específicas de laboratorio.

Comience este procedimiento con la preparación del equipo, así como el medio inicial, el medio de tensión medio y el medio de tensión alta, como se describe en el protocolo de texto. Inocular una sola colonia o E. coli de tipo silvestre en un tubo de ensayo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio inicial. Incubar el tubo de ensayo en una incubadora agitadora durante 12 horas a 37 grados centígrados y 220 rpm.

Incubar el frasco de quimiostato proporcionando aireación y agitación a 37 grados centígrados durante seis horas. Después de la incubación, conecte asépticamente el extremo del tubo de silicona de las bombas al frasco de quimiostato. Transfiera asépticamente un mililitro de precultivo al frasco de quimiostato.

Ponga en marcha la bomba de salida y recoja el cultivo en la fase exponencial. Verifique la densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo desde el tubo de salida. A continuación, encienda la bomba de entrada.

Compruebe la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros del tubo de salida cada 24 horas. Después de operar el quimiostato durante 96 horas, que es una rotación completa de 9.6, cambie el reservorio a la concentración más baja de medio de alta tensión. Cuando se cambia el depósito a un medio de mayor estrés, las células pueden sufrir un choque.

Si la densidad celular es demasiado baja, deje de alimentar el medio de mayor estrés durante algún tiempo para restaurar la densidad celular. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detenga la bomba de entrada de alimentación durante seis horas. Reinicie la bomba de entrada y compruebe que la densidad óptica sea superior a 0,2.

Aumente gradualmente la concentración del factor estresante cambiando gradualmente a un depósito que contenga una concentración más alta del factor estresante. Tome muestras del cultivo adaptado cada vez que alcance un hito de adaptación a un factor estresante y guárdelas para su posterior análisis genómico. Para el almacenamiento de la muestra, mezcle la muestra de cultivo de 0,5 mililitros con 0,5 mililitros de una solución esterilizada de glicerol al 80% y guárdela a 80 grados centígrados.

Prepare un medio de placa de 1.6% que contenga el mismo factor de estrés a la misma concentración que en el medio. Colocar 0,1 mililitros del cultivo de salida del quimiostato e incubar a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, recoja colonias individuales de la placa con un palillo de dientes estéril e inocule en tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan el mismo factor estresante y a la misma concentración de medio que en el quimiostato.

Incubar durante seis horas. Transfiera un mililitro del caldo de cultivo a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga 50 mililitros de medio. Coseche 0,5 mililitros de caldo de cultivo cada hora y mida la densidad óptica a 600 nanómetros.

Compare la tasa de crecimiento de la cepa adaptada con la de la cepa de tipo silvestre dado el factor estresante. La cepa de E. coli de tipo salvaje evolucionó en una condición de alto estrés por succinato durante 270 días, lo que corresponde a casi 930 generaciones. Cada vez que se agregó un mayor estrés de succinato, la concentración de biomasa se redujo inmediatamente y luego se restableció.

Aquí se muestra un diagrama esquemático del quimiostato con un mutante que es tolerante contra el alto estrés de succinato. La mayoría de las células de tipo salvaje se lavan bajo las condiciones de estrés y el mutante crece más. Eventualmente, la población del descendiente mutante se incrementa.

La segunda y tercera mutaciones se seleccionan continuamente para el quimiostato y, finalmente, lo dominan. Esta figura muestra que la cepa adaptada creció sin demora en condiciones de alto estrés por succinato, mientras que la cepa de tipo silvestre no lo hizo. Una estrategia similar se puede aplicar a la evolución adaptativa de laboratorio utilizando un quimiostato con una variación de los factores estresantes.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo adquirir y evolucionar el microorganismo bajo una condición específica. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un par de meses. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe lavar las células de quimiostatos agregando demasiado estrés a la vez y recuerde verificar la densidad óptica todos los días.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como el análisis del genoma y el análisis del transcriptoma para responder a preguntas adicionales como ¿qué mutación contribuye a la evolución tolerante al estrés?