Name: Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda la evolución adaptativa de microorganismos en quimiostato para estudiar respuestas al estrés y adaptaciones genómicas en E. coli. Este método permite seleccionar continuamente descendientes adaptados bajo condiciones controladas.

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Este estudio fue financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura de Corea (programa del Centro de Biología Sintética Inteligente 2012M3A6A8054887). P. Kim fue apoyado por una beca de la Universidad Católica de Corea (2015).

1. Preparación del equipo <ol><li> Obtener un frasco quimiostato (150-250 ml) o un matraz Erlenmeyer (250 ml) que contiene un orificio de entrada y un puerto de salida. Conectar los puertos con tubo de silicona que permite velocidades de flujo de 10 a 100 ml / hr. Opcionalmente, utilizar una salida de aire, un puerto de salida de aire, y puertos de entrada y salida de agua de temperatura controlada. </li><li> Obtener un dispositivo adecuado para el frasco chemostat que proporciona para el control de la agitación y la temperatura (o utilizar una incubadora de agitación rotatoria). </li><li> Obtener dos bombas peristálticas con el fin de entregar medio fresco y recoger el cultivo. </li><li> Obtener un frasco de depósito (10 a 20 L) que contiene un puerto de salida de medios y un puerto de entrada de aire. </li><li> Obtener tubo de silicona adecuado para la tasa de dilución (es decir, ID 0,8 mm, rango de flujo desde 0,06 hasta 36 ml / min; L / S 13 tubos). </li></ol> 2. Medio preparación y esterilización <ol><li> medio inicial <ol><li> Disolver 0,3 g de glucosa, 0,08 g NH 4Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O y 0,3 g de KH 2 PO 4 en 90 ml de agua destilada (DW) en un frasco quimiostato. </li><li> Sellar el frasco quimiostato junto con el tubo con abrazaderas. No selle la salida de aire. </li><li> Esterilizar el frasco quimiostato en un autoclave a 121 ° C durante 15 min. Después de la esterilización, almacenar el frasco quimiostato a temperatura ambiente. </li><li> Disolver 0,02 g MgSO4 · 7H 2 O, 0,01 g de CaCl 2, y 0,1 mg de tiamina en 10 ml DW (solución A). </li><li> Filtrar la solución A mediante una jeringa y un filtro de jeringa pre-esterilizado (un filtro de 0,45 micras de poro). </li><li> Añadir la solución A los filtrados a la jarra quimiostato. </li></ol></li><li> Medio estrés <ol><li> Disolver 30 g de glucosa, 8 g de NH4Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g de KH 2 PO 4, y 300 g de hexahidrato de succinato disódico (Na 2 · · 6H succinato &lt;sub&gt; 2 O; el factor estresante usado en este experimento) en 9,9 L DW en un frasco de depósito. </li><li> Sellar el vaso del depósito junto con el tubo con abrazaderas. No selle la salida de aire. </li><li> Esterilizar el vaso del depósito en un autoclave a 121 ° C durante 15 min. Después de la esterilización, almacenar el frasco a temperatura ambiente. </li><li> Disolver 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g de CaCl 2, y 10 mg de tiamina en 100 ml DW (solución A). </li><li> Filtrar la solución A con una jeringa y un filtro de jeringa pre-esterilizado (un filtro de 0,45 micras de poro). </li><li> Añadir la solución A los filtrados al vaso del depósito. </li><li> Asépticamente conectar el tubo de silicona esterilizado al vaso del depósito y adjuntar las bombas peristálticas. </li></ol></li><li> Medio-alto estrés <ol><li> Preparar el medio como en la sección 2.2, pero con una mayor concentración de factor de estrés (es decir, 3-5 g / L mayor en la adaptación succinato). Nota: Este protocolo es para la adaptación a un esfuerzo de THen el se pueden entregar a través del medio. En el caso de los factores estresantes físicos tales como la temperatura, agitación, o iluminación, el cultivo debe ser diseñada en consecuencia. </li></ol></li></ol> 3. El cultivo inicial <ol><li> Se inocula una sola colonia de tipo salvaje E. coli en un tubo de ensayo 15 ml que contiene 4 ml de medio inicial. </li><li> Incubar el tubo de ensayo en una incubadora de agitación durante 12 horas a 37 ° C y 220 rpm. </li><li> transferencia asépticamente 1 ml de cultivo previo a la jarra quimiostato. </li><li> Incubar el frasco quimiostato, proporcionando para la aireación (aire 50 ml / min) y agitación (200 rpm), a 37 ° C durante 6 horas. </li></ol> 4. Adaptación del estrés <ol><li> Asépticamente conectar el extremo del tubo de silicio de las bombas a la jarra quimiostato. </li><li> Arrancar la bomba de salida (10 ml / hr o superior) y recoger la cultura. Nota: El cultivo debe estar en la fase exponencial, típicamente 4-8 horas después del cultivo inicial. </li><li> check la densidad óptica (600 nm) del cultivo de la tubería de salida. </li><li> Arrancar la bomba de entrada (10 ml / h, correspondiente a una tasa de dilución de 0,1 -1 hr). </li><li> Comprobar la densidad óptica del cultivo a 600 nm desde el tubo de salida cada 24 horas. </li><li> Operar el quimiostato durante 96 horas (volumen de negocios 9.6 veces) o más. Si la densidad óptica es estable, intercambiar el depósito que contiene el medio de alta tensión. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detener la bomba de entrada de alimentación durante 6 horas. Reiniciar la bomba de entrada y comprobar que la densidad óptica es superior a 0.2. </li><li> Aumentar gradualmente la concentración del factor de estrés al cambiar a un depósito que contiene una concentración de factor de estrés superior. </li><li> Tomar muestras de la cultura adaptada cada vez que llegue un hito (por ejemplo, una cepa adaptada a 100 g / L estrés succinato), y almacenar para su posterior análisis genómico. </li><li> Para el almacenamiento de la muestra, mezclar la muestra de cultivo (0,5 ml) con una soluti glicerol esterilizado 80%en (0,5 ml) y almacenarlo a -80 ° C. Nota: Si el microorganismo adquiere una capacidad de degradar el factor de estrés durante el proceso de ALE, la concentración de estrés en la jarra de fermentación no es el mismo que en el depósito fresco. </li></ol> 5. Single-colonia aislamiento de la cepa Stress-adaptado <ol><li> Preparar medio de placa de agar (1,6% de agar) que contiene el mismo factor de estrés y a la misma concentración de medio. </li><li> Placa de la cultura de salida (0,1 ml) de la quimiostato, y se incuba a 37 ° C durante 16 hr. </li><li> Recoger colonias individuales de la placa usando un palillo de dientes estéril e inocular en 15 ml tubos de ensayo que contienen el mismo factor de estrés y a la misma concentración medio como en el quimiostato, y se incuba durante 6 hr. </li><li> Transferir 1 ml de caldo de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 50 ml de medio. Cosecha 0,5 ml de caldo de cultivo cada 1 hr, y medir la DO a 600 nm. Comparación de la tasa de crecimiento de la strai adaptadon a la de la cepa de tipo salvaje dado el factor de estrés. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
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<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
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<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
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<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los microorganismos son capaces de adaptarse a casi todos los entornos debido a su rápida tasa de crecimiento y la diversidad genética. la evolución adaptativa de laboratorio permite a los microorganismos a evolucionar en condiciones diseñadas, lo que proporciona una manera de seleccionar los organismos individuales que albergan mutaciones espontáneas que son beneficiosos en las condiciones dadas. La técnica quimiostato es más robusta para lograr la evolución impulsada artificialmente que la...

Los microorganismos pueden sobrevivir y adaptarse a diversos ambientes. En situaciones de estrés severo, la adaptación puede ocurrir a través de la adquisición de fenotipos beneficiosos por mutaciones genómicas al azar y la selección positiva posterior 1-3. Por lo tanto, las células microbianas se pueden adaptar cambiando metabólica o las redes de regulación para un crecimiento óptimo, que se denomina &quot;evolución adaptativa&quot;. microbianas tendencias recientes importantes, tales como brotes de superbacterias y la aparición de cepas microbianas resistentes, están muy estrechamente relacionados con la evolución adaptativa en condiciones de estrés. En condiciones de laboratorio definidos, somos capaces de estudiar los mecanismos de la evolución molecular e incluso controlar la dirección de la evolución microbiana para diversas aplicaciones. A diferencia de los organismos multicelulares, los organismos unicelulares son muy adecuadas para la evolución adaptativa de laboratorio (ALE) por las siguientes razones: se regeneran rápidamente, mantienen grandes poblaciones, y es fácil de crear y mantener homogeneous entornos. En combinación con los recientes avances en las técnicas de secuenciación de ADN y las tecnologías de alto rendimiento, ALE permite la observación directa de los cambios genómicos que conducen a cambios en la regulación sistémicos. dinámica mutacional y una diversidad de la población también son observables. Estrategias de ingeniería genética se pueden determinar a partir del análisis de las cepas ALE 4,5. Cultura quimiostato es un método utilizado para obtener células en estado de equilibrio y aumentar la productividad en los procesos de fermentación de 6. se añade medio fresco y el caldo de cultivo se recoge durante el proceso (el último incluye medio y biomasa). Cultura quimiostato a largo plazo, sin embargo, cambia la productividad de estado estacionario de la cultura y provoca la acumulación de mutaciones espontáneas y la selección durante el cultivo (Figura 1a). Bajo diferentes presiones de selección (estrés), la acumulación de mutaciones es mayor. Un aumento gradual de la tensión en un largo plazo<html> chemostat prevé una selección continua de las mutaciones que trabajan contra los factores de estrés dadas, tales como temperatura, pH, presión osmótica, el hambre de nutrientes, la oxidación, los productos finales tóxicos, etc. transferencia de colonias a partir de un medio sólido y la transferencia en serie de un medio líquido (repetido cultivo por lotes) también permiten a los investigadores obtener microorganismos evolucionados (Figura 1B y 1C). Aunque la cultura chemostat requiere métodos complicados, la piscina de la diversidad (número de repeticiones y tamaño de la población) es mayor que la obtenida por transferencia de colonias y las técnicas de transferencia en serie. La exposición al estrés estable a las células individuales y la disminución de la variación en el estado celular durante el cultivo en quimiostato (estado estacionario) son otros beneficios de ALE comparación con las técnicas basadas en el cultivo por lotes. ALE inducida por estrés de Escherichia coli sometidos a altas condiciones de succinato se introduce en este artículo. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Métodos de laboratorio de la evolución adaptativa (A) Chemostat;. (B) la transferencia en serie; (C) la transferencia de la colonia. Las máximas figuras ilustran el concepto de los métodos para ALE, y las cifras de abajo ilustran el número de células que crecieron durante la ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Fermentador de mini-quimiostato</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>fabricado por pedido especial</td></tr><tr><td>, tubo de silicona</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td>, <td>el tamaño del tubo se puede variar en función de la tasa de dilución y del tamaño del frasco del fermentador.</td></tr><tr><td>tarro de depósito</td><td>Bellco</td><td>Media botella de almacenamiento</td><td>20 L</td></tr><tr><td>productos químicos</td><td>Sigma-Aldrich-glucosa</td><td></td> <td>de grado reactivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reactivo</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>para biología molecular, apto para cultivo celular, &ge; 99,5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>reactivo ACS, &ge; 99</td></tr><tr><td>%Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>reactivo ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td> Reactivo <td>230391</td> ACS <td>Sigma-Aldrich</td><td>, &ge; 98%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>reactivo ACS, &ge; 96%</td></tr><tr><td>tiamina y middot; HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>grado de reactivo, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2&middot; succinato &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr></tbody></table>

procedimiento para adaptive laboratory evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

La evolución natural implica diversidad genética, como el cambio ambiental y una selección entre pequeñas poblaciones. La evolución adaptativa de laboratorio (ALE) se refiere a la situación experimental en la que se observa la evolución utilizando organismos vivos en condiciones controladas y factores estresantes; De este modo, los organismos se ven obligados artificialmente a realizar cambios evolutivos. Los microorganismos están sujetos a una variedad de factores estresantes en el medio ambiente y son capaces de regular ciertas proteínas inducibles por estrés para aumentar sus posibilidades de supervivencia. Las mutaciones espontáneas que ocurren naturalmente provocan cambios en el genoma de un microorganismo que afectan sus posibilidades de supervivencia. La exposición a largo plazo al cultivo de quimiostatos provoca una acumulación de mutaciones espontáneas y hace que la cepa más adaptable sea dominante. En comparación con los métodos de transferencia de colonias y transferencia en serie, el cultivo de quimiostatos implica el mayor número de divisiones celulares y, por lo tanto, el mayor número de poblaciones diversas. Aunque el cultivo de quimiomostáticos para el ALE requiere dispositivos de cultivo más complicados, es menos laborioso una vez que comienza la operación. Los análisis genómicos y del transcriptoma comparativos de la cepa adaptada proporcionan pistas evolutivas sobre cómo los factores estresantes contribuyen a las mutaciones que superan el estrés. El objetivo del presente trabajo es lograr una evolución acelerada de los microorganismos en condiciones controladas de laboratorio.

Para la adaptación de alta tensión succinato, la de tipo salvaje E. coli cepa W3110 se cultivó en un quimiostato a D = 0,1 h-1 por 270 días (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figura 2: High-succinato de adaptación al estrés de E. coli W3110 uso de la cultura quimiostato. flechas delgadas indican los momentos en que se aumentó la concentración de fac...

A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir que un microorganismo evolucione en condiciones de laboratorio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como las relaciones con la función adrenal, las respuestas al estrés, la ingeniería metabólica y, por supuesto, la evolución. La principal ventaja de esta técnica es la selección continua del descendiente más adaptado bajo condiciones de laboratorio específicas.Comience este procedimiento con la preparación del equipo, así como del medio inicial, medio de estrés y medio de alto estrés, tal como se describe en el protocolo escrito. Inocule una colonia única o E. coli tipo silvestre en un tubo de ensayo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio inicial. Incube el tubo de ensayo en un incubador agitador durante 12 horas a 37 grados Celsius y 220 rpm.Incube el frasco del quimiostato proporcionando aireación y agitación a 37 grados celsius durante seis horas. Tras la incubación, conecte asépticamente el extremo del tubo de silicona de las bombas al frasco del quimiostato. Transfiera asépticamente un mililitro de precultivo al frasco del quimiostato.Inicie la bomba de sali

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fuente: Jian, X., et al., Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa mediante el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el uso de un sistema de cultivo de microgotas microbianas para impulsar la evolución adaptativa de las bacterias hacia la tolerancia al metanol. Al mezclar cultivos bacterianos diseñados con un medio de alto estrés de metanol y segmentarlos en microgotas, el sistema selecciona mutantes que exhiben un crecimiento...

Evolución adaptativa de bacterias mediante un sistema de cultivo de microgotas microbianas

Fuente: Jeong, H., et al. Procedimiento para la evolución adaptativa en laboratorio de microorganismos utilizando un quimiostato. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demuestra el aislamiento selectivo y el crecimiento de bacterias adaptadas al estrés a partir de un cultivo expuesto a condiciones prolongadas de estrés. El cultivo se coloca sobre agar que contiene un factor de estrés, y se selecciona una sola colonia para inocular un medio líquido con el factor de estrés. La absorbancia se mide a...

Aislamiento de bacterias adaptadas al estrés mediante selección de colonia única

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Describimos un morbidostat configurable de bajo coste que permite la caracterización de la resistencia a los antibióticos mediante el ajuste dinámico de la concentración del fármaco. El dispositivo puede integrarse con una plataforma microfluídica multiplexada. El enfoque puede ampliarse para estudios de resistencia a antibióticos en laboratorio.

Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos

El marco eVOLVER permite un cultivo microbiano continuo de alto rendimiento con alta resolución y control dinámico sobre parámetros experimentales. Este protocolo demuestra cómo aplicar el sistema para llevar a cabo un experimento de fitness complejo, guiar a los usuarios en la programación de control automatizado sobre muchas culturas individuales, midiendo, recopilando e interactuando con datos experimentales en tiempo real.

Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. MMC puede cultivar y subcultivar microorganismos de forma automática y continua y monitorear en línea su crecimiento con un rendimiento relativamente alto y una buena paralelización, reduciendo el consumo de mano de obra y reactivos.

Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)

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Transferencias diarias, archivo de poblaciones y medición de la aptitud física en el experimento de evolución a largo plazo con Escherichia coli

Aquí, presentamos un protocolo de evolución experimental para la adaptación en termófilos utilizando termomezcladores de sobremesa de bajo costo y eficiencia energética como incubadoras. La técnica se demuestra a través de la caracterización de la adaptación a la temperatura en Sulfolobus acidocaldarius, una arquea con una temperatura óptima de crecimiento de 75 °C.

Adaptación en los Extremos de la Vida: Evolución Experimental con el Arqueón Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Presentamos un protocolo para el dispositivo de cultivo continuo milifluido (MCCD), que permite el cultivo de poblaciones bacterianas bajo condiciones constantes de bajas concentraciones de nutrientes (hasta cientos de concentraciones nanomolares) o fluctuaciones temporales de nutrientes en una escala temporal de tiempo.

Un dispositivo milifluido de cultivo continuo para el estudio de Escherichia coli bajo condiciones de nutrientes bajos y fluctuantes

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