Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato
20 de septiembre de 2016
A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.
El objetivo general de este procedimiento es permitir que un microorganismo evolucione en condiciones de laboratorio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como las relaciones de la función suprarrenal, las respuestas al estrés, la ingeniería metabólica y, por supuesto, la evolución. La principal ventaja de esta técnica es la selección continua del descendiente más demandado en condiciones específicas de laboratorio.
Comience este procedimiento con la preparación del equipo, así como el medio inicial, el medio de tensión medio y el medio de tensión alta, como se describe en el protocolo de texto. Inocular una sola colonia o E. coli de tipo silvestre en un tubo de ensayo de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio inicial. Incubar el tubo de ensayo en una incubadora agitadora durante 12 horas a 37 grados centígrados y 220 rpm.
Incubar el frasco de quimiostato proporcionando aireación y agitación a 37 grados centígrados durante seis horas. Después de la incubación, conecte asépticamente el extremo del tubo de silicona de las bombas al frasco de quimiostato. Transfiera asépticamente un mililitro de precultivo al frasco de quimiostato.
Ponga en marcha la bomba de salida y recoja el cultivo en la fase exponencial. Verifique la densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo desde el tubo de salida. A continuación, encienda la bomba de entrada.
Compruebe la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros del tubo de salida cada 24 horas. Después de operar el quimiostato durante 96 horas, que es una rotación completa de 9.6, cambie el reservorio a la concentración más baja de medio de alta tensión. Cuando se cambia el depósito a un medio de mayor estrés, las células pueden sufrir un choque.
Si la densidad celular es demasiado baja, deje de alimentar el medio de mayor estrés durante algún tiempo para restaurar la densidad celular. Si la densidad óptica es inferior a 0,2, detenga la bomba de entrada de alimentación durante seis horas. Reinicie la bomba de entrada y compruebe que la densidad óptica sea superior a 0,2.
Aumente gradualmente la concentración del factor estresante cambiando gradualmente a un depósito que contenga una concentración más alta del factor estresante. Tome muestras del cultivo adaptado cada vez que alcance un hito de adaptación a un factor estresante y guárdelas para su posterior análisis genómico. Para el almacenamiento de la muestra, mezcle la muestra de cultivo de 0,5 mililitros con 0,5 mililitros de una solución esterilizada de glicerol al 80% y guárdela a 80 grados centígrados.
Prepare un medio de placa de 1.6% que contenga el mismo factor de estrés a la misma concentración que en el medio. Colocar 0,1 mililitros del cultivo de salida del quimiostato e incubar a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, recoja colonias individuales de la placa con un palillo de dientes estéril e inocule en tubos de ensayo de 15 mililitros que contengan el mismo factor estresante y a la misma concentración de medio que en el quimiostato.
Incubar durante seis horas. Transfiera un mililitro del caldo de cultivo a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga 50 mililitros de medio. Coseche 0,5 mililitros de caldo de cultivo cada hora y mida la densidad óptica a 600 nanómetros.
Compare la tasa de crecimiento de la cepa adaptada con la de la cepa de tipo silvestre dado el factor estresante. La cepa de E. coli de tipo salvaje evolucionó en una condición de alto estrés por succinato durante 270 días, lo que corresponde a casi 930 generaciones. Cada vez que se agregó un mayor estrés de succinato, la concentración de biomasa se redujo inmediatamente y luego se restableció.
Aquí se muestra un diagrama esquemático del quimiostato con un mutante que es tolerante contra el alto estrés de succinato. La mayoría de las células de tipo salvaje se lavan bajo las condiciones de estrés y el mutante crece más. Eventualmente, la población del descendiente mutante se incrementa.
La segunda y tercera mutaciones se seleccionan continuamente para el quimiostato y, finalmente, lo dominan. Esta figura muestra que la cepa adaptada creció sin demora en condiciones de alto estrés por succinato, mientras que la cepa de tipo silvestre no lo hizo. Una estrategia similar se puede aplicar a la evolución adaptativa de laboratorio utilizando un quimiostato con una variación de los factores estresantes.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo adquirir y evolucionar el microorganismo bajo una condición específica. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un par de meses. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe lavar las células de quimiostatos agregando demasiado estrés a la vez y recuerde verificar la densidad óptica todos los días.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como el análisis del genoma y el análisis del transcriptoma para responder a preguntas adicionales como ¿qué mutación contribuye a la evolución tolerante al estrés?
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos utilizando cultivo en quimiostato. Discute el análisis genómico de la cepa evolucionada y sus implicaciones en microbiología.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Evolución en laboratorio
- Análisis genómico
Antecedentes
- La evolución adaptativa de laboratorio permite que los microorganismos evolucionen en condiciones controladas.
- Este método puede proporcionar información sobre las respuestas al estrés y la ingeniería metabólica.
- La selección continua de descendientes mejora el estudio de los procesos evolutivos.
- La preparación inicial del medio es crucial para una implementación exitosa.
Propósito del estudio
- Permitir que los microorganismos evolucionen en un entorno de laboratorio.
- Investigar las relaciones entre las respuestas al estrés y las adaptaciones evolutivas.
- Facilitar estudios de ingeniería metabólica.
Métodos utilizados
- Preparación de medio inicial, medio de estrés y medio de alto estrés.
- Inoculación de E. coli en un tubo de ensayo con medio inicial.
- Incubación en un incubador con agitación en condiciones especificadas.
- Monitoreo continuo de la evolución microbiana.
Resultados principales
- Evolución exitosa de microorganismos en condiciones controladas.
- Información sobre los mecanismos de respuesta al estrés.
- Aplicaciones potenciales en ingeniería metabólica.
- El análisis genómico revela adaptaciones en las cepas evolucionadas.
Conclusiones
- El protocolo permite una evolución efectiva de laboratorio de microorganismos.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las adaptaciones microbianas.
- Este método puede aplicarse a varias preguntas de investigación en microbiología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
