Viabilidad de las células de formación de imágenes en los andamios no transparentes - Usando el ejemplo de una novela de punto de titanio del implante

El objetivo general de este experimento es visualizar la microestructura y la adhesión celular de un implante de núcleo de titanio tejido no transparente, utilizando técnicas de imagen fluorescente. Este método avanza en el análisis de la ingeniería de tejidos con andamios no transparentes. Una ventaja de esta técnica es que se puede rastrear la viabilidad celular, así como la proliferación en el andamio con aire de cultivo definido.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la tinción fluorescente y, posteriormente, la visualización es un desafío. Las propiedades individuales del andamio, como el tamaño de los poros, pueden afectar la temporización y/o la fluorescencia del andamio pueden afectar la elección de los fluoróforos que está utilizando. Coloque hasta cinco andamios de seis o siete milímetros de grosor en un tubo de 50 mililitros y lávelos con agua tres veces durante 20 minutos por lavado.

Haga esto a temperatura ambiente con una agitación suave. A continuación, lave los andamios en 30 mililitros de solución Triton X-100 al 1% en las mismas condiciones. Luego, realice dos lavados con agua más.

Ahora, sonique secuencialmente los andamios en grado reactivo con 99 % de acetona, 99 % de isopropanol y 99 % de etanol. Realice cada paso de sonicación dos veces durante cinco minutos por sonicación. Luego, sonique el andamio tres veces más en agua durante un total de 15 minutos.

Termine colocando los andamios sobre un pañuelo sin pelusa y séquelos al aire durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, autoclave los andamios durante 15 minutos a 121 grados Celsius y 15 PSI. Para confirmar que la limpieza funcionó, use fluorescencia indirecta.

Cargue un pocillo de una placa de 12 pocillos con 2000 microlitros de la solución de tinción de azufre y rodamina B recién hecha y, con pinzas, transfiera un andamio a ese pozo. A continuación, capture imágenes negativas del andamio utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un conjunto de filtros cúbicos LED RFP y busque impurezas a gran aumento. Usando el gabinete de bioseguridad, transfiera los andamios limpios a los pozos de una placa de 24 pocillos.

Agregue 500 microlitros de medio de cultivo a 37 grados Celsius a cada pocillo y deje que el andamio se remoje durante 15 minutos. Mientras tanto, prepare 500.000 células SEP1 infectadas con Ad-GFP por 1 mililitro de medio. Después de 15 minutos, aspire completamente el medio de los andamios y siéntelos con 100 microlitros de la suspensión celular.

Luego, incubarlos durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la breve incubación, agregue 500 microlitros más de medio de cultivo e incube los andamios durante 24 horas. Al día siguiente, cambie el medio de cultivo para eliminar las células no adherentes.

A continuación, evalúe la adherencia y la dispersión de las células en los andamios, utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un conjunto de filtros cúbicos LED GFP. Para una tinción de vivos-muertos, primero coloque las células SEP1 en el andamio como antes. Después de 24 a 48 horas, aspire completamente el medio de cultivo y lave los andamios con DPBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Ahora, tiña las células con un medio de cultivo que contenga Calceína AM, Hoechst 33342 y Homodímero de etidio. Estos tres fluoróforos son sensibles a la luz, por lo que es vital mantener las células en la oscuridad en el futuro. Incubar las células durante 30 minutos con los fluoróforos para obtener una distribución uniforme por todo el andamio.

Las características específicas del andamio afectarán este tiempo de incubación. Después de la incubación, lave las celdas tres veces con DPBS usando un mililitro por pocillo. Ejecute cada lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Inmediatamente después de los lavados, documente los andamios con microscopía de fluorescencia. Para medir la viabilidad celular a lo largo del tiempo, utilice las mediciones de conversión de resazurina. Primero, aspire completamente el medio de cultivo de las células SEP1 asentadas en una placa de 24 pocillos y lave las celdas con 500 microlitros de DPBS por pocillo.

A continuación, cubra las células con el volumen requerido de solución de trabajo estéril de resazurina e incluya un pocillo con solo resazurina. Luego, incuba las células a 37 grados centígrados durante unos 30 minutos. Después de la incubación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante acondicionado de cada pocillo a una placa de 96 micropocillos para medir su fluorescencia como se describe en el protocolo de texto.

Para un mayor cultivo, retire la resazurina del pozo y lave tres veces con un mililitro de DPBS. Realice cada lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del tercer lavado, agregue 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo de células y continúe su incubación para obtener más mediciones de curso de tiempo.

Mediante el uso de tinciones fluorescentes indirectas, se documentaron las impurezas de la limpieza previa para optimizar el protocolo de limpieza. Una reducción significativa en la carga de sustancia en el andamio muestra la eficiencia del protocolo de limpieza descrito. Los implantes sucesivos utilizados para el tratamiento de artroplastia están determinados por eventos que tienen lugar en la interfaz del material celular.

Después de 24 horas de adherencia con los andamios, las células SEP1 se habían adherido. A continuación, se aplicaron fluoróforos para examinar la muerte y proliferación celular durante un período de tiempo en los andamios. La tinción de muertos vivos mostró tinción nuclear azul con fluorescencia roja en las células muertas y fluorescencia verde en las células viables.

Además, se cuantificó la viabilidad celular en el andamio mediante el ensayo de conversión de resazurina. Durante dos semanas, se recopilaron datos sobre células cultivadas con o sin andamios. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ajustar los fluoróforos que está utilizando al andamio y al microscopio que tiene disponibles.

Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como la tinción inmunofluorescente, para visualizar la presencia de proteínas, o la activación de cascadas de señalización. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la artroplastia, ya que la interacción de la cara de la célula con el tejido circundante in vivo definirá su función y durabilidad.