Inducir completa Pólipo regeneración de la aboral Physa de la anémona de mar Starlet Vectensis Nematostella

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar la serie predecible de cambios morfológicos que ocurrieron durante la regeneración de un pólipo completo a partir de una pequeña sección de tejido extraído de la punta aboral de nematostella vectensis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología de la regeneración, como cómo las células en el sitio de una herida se reorganizan y despliegan para rehacer las estructuras faltantes. Primero tuve la idea de este método porque quería ver cómo un pólipo relativamente complejo podía recomponerse a partir de la menor cantidad de información morfológica. La demostración visual de este método es fundamental porque la progresión de la etapa después de la herida inicial a veces se ve oscurecida por una membrana mucosa.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para obtener una separación completa del tejido en el sitio de la herida, debido a la naturaleza blanda, pegajosa y gelatinosa del pólipo. Comience este procedimiento con el acondicionamiento de nematostella vectensis como se describe en el protocolo de texto. Es especialmente importante cuando se utiliza esta técnica que los animales seleccionados sean del mismo tamaño y tengan el mismo historial de cultivo, como una alimentación idéntica y otros parámetros de condición.

Retire el plato de los animales seleccionados de la incubadora a la luz de la habitación al menos una hora antes de la amputación. Utilice una pipeta de plástico de diámetro ancho para transferir los cinco animales de la piscina para ser amputados al fondo de un plato de corte de vidrio estéril de 100 milímetros de diámetro que contiene agua de mar artificial con una salinidad de 12 partes por mil. Coloque la antena en la platina de un microscopio estereoscópico con un aumento variable de 10 a 40x.

Seleccione pólipos del mismo tamaño de aproximadamente la misma longitud y colóquelos en un recipiente separado de la colonia durante tres días antes de la amputación. Con un bisturí estéril, amputar la fisa aboral de cada pólipo para obtener una sección de la fisa que sea aproximadamente tan larga como ancha y que no contenga mesenterio. Para lograr esto, coloque la hoja del bisturí en contacto con el animal en el sitio deseado de la amputación.

Hazlo sin ayuda o agarrando suavemente el cuerpo del animal con unas pinzas número cinco. Corta el tejido haciendo palanca en la hoja curva del bisturí con un movimiento de balanceo por todo el cuerpo. Retire cada pólipo de donante amputado del plato y devuélvalo a un recipiente separado etiquetado como amputados agrupados.

Después de fechar el tazón, devuélvalo a la cultura de stock. Enjuagar los physa extirpados que permanezcan en el plato de corte en agua de mar artificial con una salinidad de 12 partes por 1 000. Luego, transfiera cada physa a un pocillo estéril separado en una placa de cultivo celular de múltiples pocillos que tenga 10 mililitros de agua de mar artificial con una salinidad de 12 partes por 1, 000 en cada pocillo.

Repita estos pasos para recolectar al menos cinco physa en cada pocillo para reservarlos para cada tratamiento experimental. Coloque la placa que contiene el physa en una incubadora con temperatura regulada a una temperatura fija determinada por la tasa de regeneración deseada. Marque la fisa utilizando un microscopio estereoscópico compuesto con aumento variable.

Marque la nematostella physa recién cortada como etapa cero y continúe puntuando a la misma hora todos los días después de la amputación, o DPA, utilizando el NRSS. Marque la fisa como etapa cero si una physa recién cortada aparece como una masa en forma de copa que se asemeja a un globo flácido con un sitio de herida abierta que probablemente sea visible. Marque una physa como etapa uno si la herida de amputación parece cerrada.

Marque un physa como etapa dos si la superficie del polo auditivo parece inflada, revelando ocho arcos elevados dispuestos en un patrón radialmente simétrico y separados por ranuras. En la etapa dos, observe pequeñas ampollas hemisféricas en el ápice de los arcos que son casi tan altas como anchas, probablemente transitorias e inicialmente compuestas por una sola capa de células ectodérmicas. A medida que la fisa envejece, puede quedar encerrada en mucosa, que debe eliminarse cuidadosamente con pinzas.

Puntúa un physa como etapa tres si las yemas de los tentáculos que contienen capas de tejido endodérmico y ectodérmico están formadas de manera estable en el extremo aural de al menos algunos arcos radiales. Se califica un fisa como estadio cuatro si el fisa contiene ocho mesenterios visibles distintos que se extienden en un celenterón desde inserciones en la pared del cuerpo con longitudes aborales auditivas que son más del doble de su ancho radial medido desde donde parecen conectarse a la faringe en su extremo aboral, o enterostoma. Finalmente, marque un physa como etapa cinco si la physa tiene más de cuatro mesenterios con pliegues, y el pliegue es más completo y sinuoso que en la etapa cuatro.

En la etapa cinco, el animal tiene una apariencia adulta casi normal, pero no hay células gonadales visibles. Este grupo de nematostella physa de control tratados con 0.1 por ciento de DMSO se ha regenerado completamente a la etapa cinco. Sin embargo, los physa tratados con cloroquina no lograron formar mesenterios completos.

Un primer plano muestra tanto la presencia como la falta de pliegues en los mesenterios de una physa que se incubó en cloroquina. Este gráfico ilustra los resultados agregados del tratamiento con cloroquina. Cualquier tratamiento entre 10 y 50 micromolares causó defectos similares, principalmente la falta de reformación completa de los mesenterios en que los mesenterios carecen de pliegues.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora por cada placa de seis pocillos que contiene 30 fisas cortadas. La puntuación es rápida, tal vez requiriendo media hora para cada placa replicada. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo amputar la fisa para visualizar los cambios morfológicos que ocurren durante la regeneración de un pólipo completo a partir de una pequeña sección de tejido aboral.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona etapas morfológicas en las que se pueden identificar los eventos moleculares que subyacen a la regeneración de un pólipo completo a partir de una copa de tejido visualmente uniforme. Al intentar este procedimiento, es importante recordar precondicionar a los animales con respecto a la historia nutricional, dividir en dos para excluir el mesenterio adulto y estandarizar el tamaño de los fisa regeneradores para reducir la variación dentro de los tratamientos. Siguiendo este procedimiento, se podrían evaluar los efectos de mutaciones genéticas o perturbaciones de la vía de señalización con moléculas pequeñas, por ejemplo.

O los cambios morfogenéticos podrían correlacionarse con el análisis microscópico de la autoproliferación, el rastreo del linaje o la expresión génica del sitio dos. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la biología de la regeneración exploren la biología celular, las vías de señalización y los procesos morfogenéticos que subyacen a la notable capacidad regenerativa de este organismo modelo.