도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

이 절차의 전반적인 목표는 에틸렌에 대한 박테리아 반응 연구를 위한 간단하고 안전한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 식물의 박테리아 접착 및 집락화에서 에틸렌이 수행하는 역할과 같은 식물-미생물 상호 작용에 관한 주요 질문에 답할 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비가 필요하지 않고 실험실에서 기체 에틸렌을 취급하는 것보다 훨씬 안전하다는 것입니다.

이 방법은 박테리아 셀룰로오스 생산이 에틸렌에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 에틸렌 매개 과정이 식물 집락화에 어떻게 관여하는지에 대한 시험관 내 연구를 위해 다른 식물 관련 미생물에도 적용할 수 있습니다. 준비 과정에서 애기장대 묘목을 위한 100ml의 성장 배지를 만들고 CEPA 분해를 위해 100ml의 박테리아 성장 배지를 만듭니다. 애기장대 배지가 템퍼링되면 40ml를 멸균 플라스크에 나누고 40마이크로리터의 10밀리몰 ACC로 부분 표본을 보충합니다.

이제 플레이트 사분면에 5ml의 배지를 로드하고 한천이 응고되도록 합니다. 모든 판의 반대쪽 사분면에는 박테리아 성장 매체와 애기장대 배지가 있습니다. 세 가지 다른 매체 구성을 사용합니다.

CEPA 치료는 프로토콜에서 나중에 진행됩니다. 각 플레이트 구성을 세 번으로 준비합니다. 한천이 냉각되면 애기장대 배지의 각 사분면에 약 50개의 종자를 고르게 분포시킵니다.

그런 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 3-4일 동안 플레이트를 배양합니다. 나중에 씨앗을 부화시킨 후 2시간 동안 형광등에 노출시킵니다. 그런 다음 10마이크로리터의 500밀리몰 CEPA 원액을 한 플레이트 구성의 박테리아 한천에 펴 바릅니다.

한천의 최종 CEPA 농도는 1밀리몰입니다. 이제 모든 플레이트를 실험실 필름으로 밀봉하고 호일로 감쌉니다. 그런 다음 한천 면이 아래로 향하게 하여 섭씨 23도의 어두운 환경에 플레이트를 놓고 씨앗을 발아시키기 위해 3일 동안 배양합니다.

씨앗이 발아한 후 화염 살균 겸자를 사용하여 각 처리에 해당하는 묘목을 제거합니다. 각 사분면에서 30개의 묘목을 선택하여 처리당 총 180개의 묘목을 선택합니다. 해부 현미경 또는 고해상도 디지털 카메라로 묘목을 스케일을 위한 자 옆의 검은색 배경에 대해 이미지화합니다.

그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 hypocotyl 길이를 측정합니다. 스트레이트 도구를 사용하여 10mm를 측정하고 분석 탭에서 스케일 설정을 선택하여 스케일을 설정합니다. 그런 다음 Straight Line 도구 아래의 Segmented 도구를 사용하여 각 하이포코틸을 측정하고 M을 눌러 길이를 계산합니다.

펠리클 분석은 박테리아 셀룰로오스 생산을 위한 표준 분석 도구입니다. PH 및 형태학적 분석은 섹스 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 준비 과정에서 스타터 배양에서 세포를 3회 수확하고 Petroff-Hauser 계수 챔버를 사용하여 세포를 정량화합니다.

그런 다음 CEPA 농도가 다른 4개의 중간 마스터 믹스를 준비합니다. 각 마스터 믹스에 대해 60ml의 pH 7 SH 매체를 제거하고 120마이크로리터의 0, 5, 50 또는 500 millimolar CEPA 원액을 첨가하여 0, 01, 0.1 또는 1.0 millimolar의 최종 CEPA 농도를 얻습니다. 플라스크를 휘젓아 이러한 매체를 혼합합니다.

세 가지 중 각각에 대해 한 세트의 미디어가 필요하고 네 번째 세트는 멸균 제어로 기능하기 위해 필요합니다. 따라서 각 60ml 배지 제제를 4개의 14ml 엘리콰트로 나눕니다. 그런 다음, 14 밀리리터 엘리쿼트를 사전 냉각한 후 밀리리터당 100, 000 세포의 최종 농도를 위해 각각의 스타터 배양액을 접종합니다.

셀룰로오스 생성을 방지하기 위해 접종된 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 14밀리리터 엘리콰테이트는 멸균 제어 웰에 사용합니다. 이제 각 14ml 마스터 믹스에서 2밀리리터 엘리쿼트를 멸균 24웰 플레이트의 6웰에 로드하여 분석된 스타터 배양당 총 4개의 로드된 플레이트를 사용할 수 있습니다.

파라핀 필름으로 플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 섭씨 30도에서 7일 동안 정적으로 배양합니다. 배양 중에 25ml의 액체 배양을 병렬로 배양하여 배지의 산도를 주기적으로 측정합니다. 산도가 PH 5 이하로 떨어지면 유기체의 성장은 CEPA가 에틸렌으로 분해되는 것을 억제하므로 이 분석과 양립할 수 없습니다.

일주일 후, 펠리클 습윤 중량, 두께, 건조 중량 및 결정도를 수확하고 측정합니다. 플레이트에서 펠리클을 모으려면 펠리클의 한쪽을 눌러 반대쪽 가장자리를 들어 올리고 집게로 집습니다. 그립을 유지하면서 새 종이 타월에 3초 동안 올려 여분의 매체를 제거합니다.

그런 다음 각 펠리클의 무게를 측정하고 이를 젖은 중량으로 기록합니다. 그런 다음 펠리클을 통치자에 따라 정렬하고 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 측면에서 사진을 찍습니다. 펠리클의 두께에 대해 이 사진을 분석합니다.

다음으로, 펠리클을 6개의 웰 플레이트의 웰로 개별적으로 옮깁니다. 12ml의 0.1 일반 수산화나트륨으로 섭씨 80도에서 20분 동안 세포를 이가 되도록 처리합니다. 그런 다음 수산화나트륨을 제거하고 6개의 웰 플레이트에서 12ml의 초순수로 24시간 동안 교반하여 철저히 세척하여 처리된 펠리클을 중화합니다.

이 부화 중에는 6시간마다 물을 갈아줍니다. 잠복기가 끝나면 펠리클은 흰색이 되어야 합니다. 그런 다음 펠리클을 실리콘 매트에 놓고 섭씨 50도에서 48시간 동안 건조시켜 건조 중량 측정을 준비합니다.

펠리클레스의 결정성은 푸리에 변환 적외선 분광법을 사용하여 분석할 수 있습니다. 짙게 자란 애기장대 탈리아나 묘목은 ACC의 존재 하에서 그리고 SH 배지에서 분해 CEPA를 통해 생성된 에틸렌의 존재 하에서 과장된 정점 갈고리를 가진 짧고 두꺼운 하이포코틸의 삼중 반응 표현형을 나타냈지만, 처리되지 않은 조건에서는 그렇지 않았다. 분명히, 처리된 종자의 하이포코틸 길이는 처리되지 않은 대조군보다 현저히 작았습니다.

따라서, 에틸렌은 생리학적으로 관련된 농도로 SH 배지에서 CEPA로부터 방출되었습니다. CEPA 유래 에틸렌의 모든 농도는 펠리클 습윤 중량을 유의하게 감소시켰지만, 펠리클 두께에는 영향을 미치지 않았으며, CEPA 유래 에틸렌의 모든 농도는 펠리클 건조 중량을 유의하게 증가시켰다. 또한, 펠리클 수화는 CEPA 유래 에틸렌의 모든 농도에 의해 감소되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 성장 배지의 PH를 측정하여 PH가 5 미만으로 떨어지지 않도록 하여 CEPA가 에틸렌으로 분해되는 것을 억제하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 분말 CEPA는 점막에 매우 위험하다는 것을 기억하십시오. 이 프로토콜을 수행할 때는 항상 적절한 주의를 기울여야 합니다.

이 기술을 통해 식물 박테리아 상호 작용에 관심이 있는 연구자들은 체외에서 에틸렌 매개 반응을 안전하게 탐색할 수 있습니다. 이것은 식물 신호가 박테리아 집락화와 부착을 어떻게 매개하는지 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 현재 이 분야는 연구가 부족합니다.