자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.

우리의 프로토콜에서, 우리는 펩티드로 만든 반응 구획을 형성하기 위해 작은 유리 구슬에서 필름 재 수화를 사용합니다. 실험에서 우리는 프로토콜의 단순성과 견고성의 이점을 누릴 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용된 조세포 추출물과 같은 민감한 샘플을 통합하는 기능입니다.

유기 용매와의 접촉은 시료에 크게 영향을 미칩니다. 이 절차를 시작하려면 원심 진공 농축기를 사용하여 ELP 용액을 1.1 밀리몰러에 집중합니다. 이 농축 용액의 마이크로리터 200개를 2~1개의 클로로폼 및 메탄올 혼합물의 1, 250 마이크로리터와 혼합합니다.

철저하게 혼합하는 용액을 소용돌이. 다음으로 1.5그램의 구형 유리 구슬을 10밀리리터 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. ELP와 클로로폼 메탄올 용액을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.

플라스크를 회전 증발기에 연결합니다. 속도를 150 RPM으로 조정하고 액체가 실온에서 증발 될 때까지 약 4 분 동안 20, 000 파스칼로 압력을 조절합니다. 끓는 지연으로 인해 회전 증발기를 사용할 때주의하는 것이 중요합니다.

그 후, 유리 구슬의 손실을 방지하기 위해 둥근 바닥 플라스크의 개구부 주위에 알루미늄 호일을 느슨하게 감싸고 플라스크를 적어도 한 시간 동안 건조기로 배치하여 남은 클로로폼과 메탄올이 증발되도록 합니다. 단일 실험을 위해, 혼합 100 펩티드 덮여 유리 구슬의 밀리그램 과 혼합 60 붓기 용액의 마이크로 리터. 이 샘플을 섭씨 25도에서 5분간 배양합니다.

테이블 상단 원심분리기를 사용하여 샘플을 신속하게 원심분리하고 유리 구슬을 퇴적시합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 소포가 들어있는 상체를 수집합니다. 첫째, 미리 정제된 플라스미드 DNA의 100마이크로리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 로티-페놀, 클로로폼 또는 이소하밀 알코올100마이크로리터를 혼합하여 더 나은 위상 분리를 가능하게 한다.

튜브를 최대 6회, 원심분리기를 16배, 000배, 실온으로 5분간 부드럽게 반전시면 됩니다. 그런 다음 상상에 200 마이크로리터를 추가하고 튜브를 최대 6회 반전시한다. 원심 분리는 샘플을 16, 000 배 g 및 실온에서 5 분 동안 분리합니다.

그 후, 상체피는 별도의 튜브에 피펫과 에탄올 강수량에 대한 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 10 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 80도에 차가운 에탄올 1밀리리터를 넣고 샘플을 섭씨 80도에서 1시간 동안 보관합니다. 다음으로, 16, 000배, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다.

상체를 데칭하고 섭씨 20도에서 차가운 70 %의 에탄올 1 밀리리터를 추가하십시오. 원심분리기는 16, 000배, 섭씨 4도에서 5분간. 그런 다음, 피펫팅에 의해 액체를 제거하고 DNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

샘플을 실온에 약 15분간 저장하여 나머지 에탄올을 증발시다. 그 후, 샘플 농도를 약 300 나노몰러로 조정하기 위해 시료에 초순수수를 첨가하여 260나노미터의 흡수로 측정한다. 전사 번역 반응을 준비하려면 준비된 원유 세포 추출 및 얼음에 대한 반응 버퍼를 따르십시오.

60 마이크로리터 반응 믹스의 경우, 혈장 DNA를 반응 완충제의 37.5 마이크로리터에 추가하고, 28.7 마이크로리터의 조세포 추출물을 추가하고, 58.8 마이크로리터의 최종 부피에 초순수수를 채웁니다. 반응이 시작되기 직전에 T7RNA 폴리머라제 용액의 1.2 마이크로리터를 넣고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 일반적으로 4 ~8 시간 인 실험 기간 동안 29섭씨에서 샘플 및 붓기 용액을 배양합니다.

소포의 전송 전자 현미경 이미지는 TX / TL 또는 심지어 PBS와 같은 다양한 붓기 용액이 소포를 형성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 두 솔루션 모두 크기 측정은 직선 전진 단계입니다. 다이나믹 라이트 산란은 유리 구슬 없이 제조된 소포가 직경 134나노미터의 결과이며, 유리 구슬을 사용할 때 25%의 다각형으로, 직경은 168나노미터로 생성되며, 직경은 21%의 다각성 도형성 단백질을 21%로 생성하며, 이는 2개의 형광 단백질의 형광 강도가 ELP를 이용하여 측정된다.

소포 형성 후, 소포와 외부 용액의 내용이 동일하므로 항생제 가나마이신이 단백질 발현을 억제하기 위해 외부 용액에 첨가된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 조절제로서, 카나마이신은 또한 베종 용액에 첨가되며, 이 경우 소포 내부의 단백질 발현이 억제된다. 이것은 카나마이신이 멤브레인을 통해 확산되지 않으며 항상 내부 표현을 지속적으로 억제한다는 것을 나타냅니다.

그런 다음 FRET 분석이 ELP가 멤브레인으로 통합된 것을 시연하기 위해 수행됩니다. 멤브레인 ELP의 발현시, 추가 펩타이드는 막에 통합되어 FRET 쌍 사이의 평균 거리를 증가시키고 기증자 신호의 증가를 초래합니다. 제시된 기술은 간단한 반응 용기를 생성하거나 펩티드 기반 멤브레인을 가진 인공 세포를 만드는 데 사용될 수 있다.

내부의 콘텐츠는 필요에 따라 선택할 수 있습니다. 이러한 펩티드 소포를 사용 하 여, 우리는 지금 그들 내에서 더 복잡 한 합성 반응에 기대할 수 있습니다.