Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

El objetivo general de este protocolo es utilizar herramientas de análisis digital para realizar rápidamente recuentos precisos de células en una suspensión o en una migración en una membrana de ensayo de invasión. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a cuantificar el número de células necesario para las técnicas comunes y los ensayos de motilidad celular in vitro. La principal ventaja de este método es que proporciona recuentos de células rápidos y precisos, al tiempo que incluye múltiples filtros y herramientas de análisis.

Para comenzar, ajuste la iluminación del microscopio al máximo. Cambie al objetivo 4x y asegúrese de que los filtros de contraste de fase estén en uso. A continuación, dentro del software del microscopio, establezca la configuración de captura de imágenes en sus valores predeterminados.

Ahora coloque un hemocitómetro estándar en la platina del microscopio y capture una imagen para el paso de calibración del volumen de la imagen. Ajuste el tiempo de exposición según sea necesario. En ImageJ, debajo de la calculadora de concentración de celdas, abra la imagen y haga clic en el botón Obtener dimensión de imagen.

Esta acción rellena los cuadros de texto de anchura y altura de la imagen con la resolución de la imagen en píxeles. A continuación, seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea recta a lo largo de toda la longitud del cuadrado p primario del hemocitómetro haciendo clic y arrastrando el cursor. A continuación, pulse la tecla M para mostrar la ventana de resultados.

Ahora, escriba el valor de la columna de longitud en el cuadro de texto de longitud p-cuadrado en la calculadora de concentración de celdas. Luego, haga clic en el botón Calcular volumen de imagen para generar el volumen de la imagen en el cuadro de texto del volumen de la imagen. Finalmente, haga clic en el botón Guardar para completar la calibración del complemento.

Para el análisis de muestras, cargue 10 microlitros de células en ambas cámaras de un portaobjetos de hemocitómetro y ajuste el enfoque de modo que el interior de las células sea más oscuro que la membrana celular para proporcionar el enfoque dentro de la sección transversal central de la célula y no en los polos. A continuación, ajuste aún más la exposición para que las células no queden sobreexpuestas. Las líneas de hemocitómetro ligeramente visibles son aceptables.

Ahora, capture de cinco a diez imágenes no superpuestas de la región central del hemocitómetro. La resolución y el aumento de cada imagen deben ser los mismos que los de la imagen de calibración de volumen. A continuación, en la calculadora de concentración de celdas, haga clic en Contar células y en la ventana emergente, seleccione una carpeta para contar.

A continuación, en el cuadro de entrada del número de muestra, introduzca el número de imágenes tomadas por cámara y haga clic en Aceptar. El plugin ahora recopilará los datos. Consulte el texto para obtener más detalles. Para comenzar, dentro del software del microscopio, establezca la configuración de captura de imágenes en sus valores predeterminados.

Para la etapa del visor de disección, use un fondo blanco sólido y use una fuente de luz por encima de la etapa, preferiblemente dos luces LED flexibles. Ahora, coloque un portaobjetos de membrana de ensayo de migración completo en la platina. Al observar la imagen en tiempo real mostrada por el software, ajuste manualmente la ampliación para que los bordes de una sola membrana estén justo dentro del campo de visión de la cámara.

A continuación, ajuste las posiciones de las fuentes de luz y los tiempos de exposición para reproducir, lo más fielmente posible, la imagen ideal. Que tiene un color de fondo mínimo y una membrana iluminada uniformemente. La precisión del recuento de células depende de la adquisición de imágenes de alta calidad.

Por lo tanto, es importante capturar la mejor imagen posible con la cámara del usuario para el uso más eficiente de los complementos. Ahora, retire el portaobjetos y haga el balance de blancos de la imagen en el software del microscopio para completar la calibración. Inmediatamente antes de la toma de imágenes, aplana cada membrana aplicando presión al cubreobjetos para eliminar tantas burbujas atrapadas como sea posible.

Ahora, dentro del software, establezca la ubicación de la carpeta de captura. A continuación, capture una imagen por membrana y guarde los archivos de imagen como TIF utilizando la convención de nomenclatura de la muestra 001 con aumentos incrementales en el número de cada imagen. Esta convención de nomenclatura es necesaria para que el plugin encuentre los archivos.

Si se desea la corrección de campo plano, para cada diapositiva busque un área vacía y tome una imagen en blanco. Guarde el archivo como nombre de muestra en blanco. A continuación, en ImageJ, abra el complemento TC.

Dentro de TC, haga clic en el botón Campo plano y, en el cuadro de diálogo Elegir directorio, seleccione la carpeta donde se guardaron las imágenes de membrana. Ahora, abra una imagen de membrana de ensayo de migración y seleccione Umbral de color. En la ventana, establezca el método en Shanbhag.

Establezca el color del umbral en blanco. Establezca el espacio de color en RGB y desmarque la opción de fondo oscuro. A continuación, ajuste los controles deslizantes superiores a cero y los controles deslizantes inferiores a 255 para que la imagen sea completamente blanca.

Una vez blanco, ajuste los controles deslizantes verde y rojo hasta que solo se vean los núcleos. En el plugin TC, copie los valores de los controles deslizantes RGB en los cuadros de texto del umbral RGB de los ajustes de configuración asociados. A continuación, haga clic en el botón Agregar/Modificar y sobrescriba la configuración.

En el panel de ajustes de configuración, haga clic en Guardar para escribir los ajustes en el disco duro. Ahora, para contar las imágenes con el plugin TC, haga clic en Contar carpeta y seleccione la carpeta que se va a contar. A continuación, el programa procesará las imágenes y añadirá automáticamente los datos a la tabla principal.

Ahora, en la tabla principal, habrá una marca de verificación en el menú ¿Calibrar? La columna de la imagen se marca para la calibración en función de su parecido con las métricas ideales. Seleccione todas las muestras marcadas para la calibración.

A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Recuento y tamaño sugerido. Esto contará las imágenes con el área de partícula mínima sugerida. A continuación, vuelva a hacer clic con el botón derecho y seleccione Mostrar trazado.

Una imagen ideal tendrá un gráfico que se asemeja a una distribución normal larga con cola derecha. Si es necesario, ajuste el rango de tamaño inferior o la configuración del umbral RGB seleccionando la muestra, haciendo clic con el botón derecho y seleccionando Recuento y Configuración manual. A continuación, introduzca la configuración deseada y haga clic en Contar para volver a contar la imagen.

Para ajustar los recuentos manualmente, seleccione las muestras, haga clic con el botón derecho en la tabla y seleccione Abrir imagen con recuentos. La imagen original se abrirá con marcas rojas que representan cada partícula contada por el plugin. Además, la opción Mostrar imagen binaria contada se puede utilizar para comprobar qué tan bien se resuelven las celdas individuales mediante el umbral de color.

Para agregar manualmente un recuento, mantenga presionada la tecla de control y haga clic con el botón izquierdo. Esto agregará un marcador en la ubicación del cursor que se agrega al recuento total. Para eliminar manualmente un marcador, haga clic con el botón derecho en la imagen y el complemento eliminará el marcador más cercano al cursor.

Para eliminar un grupo de marcadores, seleccione una región de interés y haga clic con el botón derecho en la región mientras mantiene pulsada la tecla de control. El proceso de la calculadora de concentración de celdas depende de la imagen de calibración de p-cuadrado y del cálculo de la longitud y los píxeles de p-cuadrado. El cuadrado p de un hemocitómetro tiene un volumen de 100 nanolitros y, dada esta constante, el volumen total de la imagen se puede calcular después de convertir píxeles a milímetros.

Una comparación de recuentos manuales y automatizados en 57 imágenes de varios experimentos y tipos de células, muestra que existe una correlación muy estrecha entre ambos métodos. Las concentraciones entre cinco millones y 2.000 células por mililitro se contaron con precisión utilizando el proceso automatizado. La métrica Q representa la claridad general de las imágenes en función de la distribución de distintos tamaños de partícula.

Un Q adecuado es mayor que 0,5. Al aplicar estos calificativos a una selección de imágenes de modestas a excelentes con respecto al brillo y el ruido de fondo, los recuentos de imágenes calibrados fueron significativamente más cercanos a los recuentos manuales que a los recuentos de imágenes no calibrados. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo contar de forma precisa y eficiente las células en suspensión y a partir de ensayos de motilidad celular utilizando los plugins CCC y TC ImageJ.

Una vez que se domina el complemento TC, en el que la adquisición, cuantificación y ajuste de los recuentos de células se puede realizar en menos de una hora. Ambos plugins se basan en la función de conteo de partículas de ImageJ y pueden modificarse editando las macros utilizadas por ImageJ. Esto ofrece una mayor flexibilidad para que el usuario amplíe el alcance de los plugins a otras partículas.