Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

El objetivo general de este protocolo es utilizar herramientas de análisis digital para realizar rápidamente conteos precisos de células en una suspensión o en una membrana de ensayo de migración e invasión. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a cuantificar el número de células necesario para técnicas comunes y ensayos de movilidad celular in vitro. La principal ventaja de este método es que proporciona conteos rápidos y precisos de células, incluyendo múltiples filtros y herramientas de análisis.

Para comenzar, ajuste la iluminación del microscopio al máximo. Cambie al objetivo de 4x y asegúrese de que se estén utilizando los filtros de contraste de fase. Luego, dentro del software del microscopio, configure los ajustes de captura de imagen a sus valores predeterminados.

Ahora coloque un hemocitómetro estándar sobre la platina del microscopio y capture una imagen para el paso de calibración del volumen de la imagen. Ajuste el tiempo de exposición según sea necesario. En ImageJ, dentro de la calculadora de concentración celular, abra la imagen y haga clic en el botón Obtener dimensión de la imagen.

Esta acción rellena los cuadros de texto de ancho y alto de la imagen con la resolución de la imagen en píxeles. A continuación, seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea recta a lo largo de toda la longitud del cuadrado principal p del hemocitómetro haciendo clic y arrastrando el cursor. Luego, presione la tecla M para mostrar la ventana de resultados.

Ahora, escriba el valor de la columna de longitud en el cuadro de texto de longitud del p-cuadrado en la calculadora de concentración celular. Luego, haga clic en el botón Calcular volumen de imagen para mostrar el volumen de la imagen en el cuadro de texto de volumen de imagen. Finalmente, haga clic en el botón Guardar para completar la calibración del complemento.

Para el análisis de la muestra, cargue 10 microlitros de células en ambas cámaras de una lámina de hemocitómetro y ajuste el enfoque de manera que el interior de las células sea más oscuro que la membrana celular, para enfocar la sección transversal central de la célula y no los polos. A continuación, ajuste aún más la exposición para que las células no queden sobreexpuestas. Es aceptable que las líneas del hemocitómetro sean ligeramente visibles.

Ahora, capture cinco a diez imágenes no superpuestas de la región central del hemocitómetro. La resolución y el aumento de cada imagen deben ser los mismos que se utilizaron para la imagen de calibración de volumen. A continuación, en la calculadora de concentración celular, haga clic en Contar células y, en la ventana emergente, seleccione una carpeta para realizar el conteo.

A continuación, en el cuadro de entrada de número de muestra, ingrese el número de imágenes tomadas por cámara y haga clic en Aceptar. El complemento recopilará ahora los datos. Consulte el texto para obtener más detalles. Para comenzar, dentro del software del microscopio, configure los ajustes de captura de imagen a sus valores predeterminados.

Para la etapa del microscopio de disección, utilice un fondo blanco sólido y una fuente de luz por encima de la etapa, preferiblemente dos luces LED flexibles. A continuación, coloque una laminilla con la membrana de un ensayo de migración completado sobre la etapa. Observando la imagen en tiempo real mostrada por el software, ajuste manualmente el aumento de modo que los bordes de una sola membrana queden justo dentro del campo de visión de la cámara.

A continuación, ajuste las posiciones de las fuentes de luz y los tiempos de exposición para reproducir, lo más fielmente posible, la imagen ideal, que presenta un color de fondo mínimo y una membrana uniformemente iluminada. La precisión del recuento celular depende de la adquisición de imágenes de alta calidad.

Por lo tanto, es importante capturar la mejor imagen posible lograda con la cámara del usuario para aprovechar de la manera más eficiente los complementos. Ahora, retire el portaobjetos y equilibre el blanco de la imagen mediante el software del microscopio para completar la calibración. Inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, aplane cada membrana aplicando presión sobre el cubreobjetos para eliminar la mayor cantidad posible de burbujas atrapadas.

Ahora, dentro del software, establezca la ubicación de la carpeta de captura. Luego, capture una imagen por membrana, guardando los archivos de imagen como TIF utilizando la convención de nomenclatura de la muestra 001 con aumentos incrementales en el número para cada imagen. Esta convención de nomenclatura es necesaria para que el complemento encuentre los archivos.

Si se desea una corrección de campo plano, para cada portaobjetos encuentre un área vacía y tome una imagen en blanco. Guarde el archivo como nombre de la muestra en blanco. A continuación, en ImageJ, abra el complemento TC.

Dentro de TC, haga clic en el botón Flatfield y, en el cuadro de diálogo Elegir directorio, seleccione la carpeta donde se guardaron las imágenes de la membrana. Ahora, abra una imagen de membrana de ensayo de migración y seleccione Umbral de color. En la ventana, configure el método en Shanbhag.

Establezca el color del umbral en blanco. Configure el espacio de color en RGB y desactive la opción de fondo oscuro. A continuación, ajuste los controles deslizantes superiores a cero y los controles deslizantes inferiores a 255 para que la imagen sea completamente blanca.

Una vez que esté blanco, ajuste los controles deslizantes de verde y rojo hasta que solo sean visibles los núcleos. En el complemento TC, copie los valores de los controles deslizantes RGB en los cuadros de texto correspondientes de configuración de umbral RGB. A continuación, haga clic en el botón Agregar/Modificar y sobrescriba la configuración.

En el panel de configuración, haga clic en Guardar para escribir la configuración en el disco duro. Ahora, para contar las imágenes con el complemento TC, haga clic en Contar carpeta y seleccione la carpeta que se desea contar. El programa procesará entonces las imágenes y agregará automáticamente los datos a la tabla principal.

Ahora, en la tabla principal, habrá una marca de verificación en la columna ¿Calibrar? si en la imagen se marca para calibración según su similitud con las métricas ideales. Seleccione todas las muestras marcadas para calibración.

Luego, haga clic derecho y seleccione Recuento y tamaño sugerido. Esto volverá a contar las imágenes con el área mínima de partículas sugerida. A continuación, haga clic derecho nuevamente y seleccione Mostrar gráfico.

Una imagen ideal tendrá un gráfico que se asemeja a una distribución normal con una cola larga hacia la derecha. Si es necesario, ajuste el rango inferior de tamaño o los valores umbral de RGB seleccionando la muestra, haciendo clic derecho y seleccionando Recuento y Configuración Manual. Luego, introduzca los valores deseados y haga clic en Contar para volver a contar la imagen.

Para ajustar los recuentos manualmente, seleccione las muestras, haga clic derecho en la tabla y elija Abrir imagen con recuentos. Se abrirá la imagen original con marcas rojas que representan cada partícula contada por el complemento. Además, se puede utilizar la opción Mostrar imagen binaria contada para verificar qué tan bien se están resolviendo las células individuales mediante el umbral de color.

Para agregar manualmente una cuenta, mantenga presionada la tecla de control y haga clic con el botón izquierdo. Esto añadirá un marcador en la ubicación del cursor, que se sumará al recuento total. Para eliminar manualmente un marcador, haga clic con el botón derecho en la imagen y el complemento eliminará el marcador más cercano al cursor.

Para eliminar un grupo de marcadores, seleccione una región de interés y haga clic derecho en la región mientras mantiene presionada la tecla de control. El proceso del calculador de concentración celular depende de la imagen de calibración del p-cuadrado y del cálculo de la longitud del p-cuadrado y los píxeles. El p-cuadrado de un hemocitómetro tiene un volumen de 100 nanolitros, y dado esta constante, se puede calcular el volumen total de la imagen después de convertir los píxeles a milímetros.

Una comparación entre recuentos manuales y automatizados en 57 imágenes procedentes de diversos experimentos y tipos celulares muestra una correlación muy estrecha entre ambos métodos. Se contaron con precisión concentraciones comprendidas entre cinco millones y 2.000 células por mililitro mediante el proceso automatizado. La métrica Q representa la claridad general de las imágenes basada en la distribución de tamaños de partículas distintas.

Un Q adecuado es mayor que 0,5. Al aplicar estos criterios a una selección de imágenes de calidad moderada a excelente en cuanto a brillo y ruido de fondo, los conteos de imágenes calibradas fueron significativamente más cercanos a los conteos manuales que los conteos de imágenes no calibradas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo contar células en suspensión y a partir de ensayos de motilidad celular de manera precisa y eficiente utilizando los complementos CCC y TC de ImageJ.

Una vez dominado el complemento TC, en el que se pueden realizar la adquisición, cuantificación y ajuste de los conteos celulares en menos de una hora. Ambos complementos dependen de la función de conteo de partículas de ImageJ y pueden modificarse mediante la edición de las macros utilizadas por ImageJ. Esto ofrece una mayor flexibilidad al usuario para ampliar el alcance de los complementos a otras partículas.