Name: Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar células en suspensión y ensayos de migración usando plugins de ImageJ. Este protocolo automatizado mejora la precisión y eficiencia en análisis de biología celular.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud para PC (OR 142730 y OR 89931). Nos gustaría agradecer a Jelena Brkic por su idea inicial del análisis de partículas binarias en ImageJ.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos críticos, solución de problemas y limitaciones La propia naturaleza de los métodos de cálculo automatizados, específicamente los de análisis de partículas, requiere la capacidad matemática para definir estas partículas. En consecuencia, tanto la exactitud de la calculadora de la concentración de células y el contador de ensayo de migración depende mayormente en la fidelidad de la imagen, es decir, cómo de cerca la imagen capturada se asemeja a la membrana de célula o muestra de ensayo...

En el recuento de células in vitro es una importante técnica básica en una amplia gama de experimentos de cultivo de tejidos. Determinar con precisión el número de células en un cultivo es esencial para la reproducibilidad experimental y 1,2 normalización. El recuento de células se puede realizar manualmente usando un hemocitómetro, así como el uso de una variedad de métodos automatizados, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 3,4,5. La mayoría de los métodos automatizados para el recuento de células pertenecen a una de dos clases, los que utilizan el principio de Coulter o citometría de flujo. Contador Coulter toman ventaja de las células resistencia eléctrica para determinar el número y tamaño de las células. Ellos son rápidos, precisos y más barato que los citómetros de flujo. Sin embargo, rara vez se utilizan sólo para el recuento de células debido a su costo considerable en comparación con el conteo manual 3. Citómetros de flujo, por otro lado, son caros pero tienen muchas aplicaciones tales como el recuento de células, el análisis de la forma de las células, structure y la célula de medida interna Marcadores de 4,5. Las máquinas que utilizan cualquiera de estos dos principios están disponibles de muchos fabricantes. Conteo manual es asequible, pero consume tiempo y sujeto a un sesgo, mientras que los métodos automatizados vienen con una fracción del tiempo necesario para que el recuento manual, pero el uso de máquinas costosas 6. Otros procedimientos de cultivo celular común están en ensayos de motilidad de las células in vitro, a saber, la migración celular y la invasión 7. ensayos de migración y la invasión se utilizan comúnmente para investigar la motilidad celular y la invasión en respuesta a una respuesta quimiotáctica. Además, se utilizan ampliamente para estudiar el desarrollo embrionario, la diferenciación, la respuesta inflamatoria, y la metástasis de múltiples tipos de células 7-11. Las células que han migrado o invadido través de la membrana porosa de un ensayo de migración se pueden cuantificar de dos maneras diferentes. En primer lugar, mediante la tinción de las células con un colorante fluorescente, la disociación from de la membrana, y la cuantificación utilizando un lector fluorescente 12. Una limitación de este método de cuantificación es que ningún registro puede ser retenido de las membranas y no hay posibilidad de un mayor análisis 13. El segundo método de cuantificación es para emigrado / células para ser fijados y teñidos con colorante fluorescente o más comúnmente, con colorantes citológicos como cristal violeta, colorante azul de toluidina o hematoxilina invadió; a continuación, las células se cuantificaron utilizando manualmente las imágenes microscópicas invertidas de estas membranas, que es una tarea que consume mucho tiempo 12,13. Para superar los inconvenientes de conteo de células manual, se desarrollaron dos contadores de células automatizadas fiables y precisos para la concentración de células y para el ensayo de migración. Estos algoritmos contador de células automatizado fueron desarrollados para ImageJ como un plugin usando lenguaje de programación Java de Oracle. ImageJ es una herramienta de procesamiento de imagen pública y ampliamente usada desarrollado por el Instituto Nacional del ciLTH (NIH) 14,15; por lo tanto, escribir estos plugins para ImageJ facilita una fácil integración en la comunidad biológica. Automatización de recuento de células garantiza un alto rendimiento y reproducibilidad en comparación con el conteo manual. Aunque otro software y plugins disponibles se pueden utilizar para calcular la concentración de células a través de análisis de imágenes 5,16,17, Cell Concentración Calculadora Plugin es rápido y también puede manejar diluciones de células y tratamientos. Por otra parte, todos los resultados y cálculos de estos dos contadores se pueden guardar y exportar. Los dos plugins descritos en este documento están optimizados para el uso de un microscopio de contraste de fases de imágenes de células vivas y gran campo de visión (toda la captura de membrana) de imágenes para membranas de ensayo de migración a través del uso de un microscopio de disección. Los plugins son de libre acceso para descargar las instrucciones de instalación de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Medios líquidos clásicos: RPMI 1640 - con L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>medios de cultivo celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero bovian fetal (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Suministro de medios</td></tr><tr><td>Línea celular de trofoblastos HTR8/SVneo</td><td>Las células se obtuvieron del Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Canadá)El</td><td></td> <td>software está diseñado para trabajar con cualquier línea celular.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Preparada al 0,20% (p/v) en 10 &micro; M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 10 cm</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Cualquier placa tratada con cultivo de tejidos será adecuada</td></tr><tr><td>Inserciones de membrana de poliéster Transwell - 8.0&nbsp; y micro; m Tamaño de poro</td><td>Costar 3422 pedido a Fisher Scientific 7200150</td><td></td><td>para placas de 24 pocillos; Tamaño de poro: 8.0 y micro; m; 6,5 mm de diámetro; 0,33 cm2 área de crecimiento</td></tr><tr><td>HARLECO Tinciones y reactivos para hematología, EMD Millipore - Soluciones 1, 2 y 3</td><td>EMD Millipore y pedidos de VWR</td><td>65044A, B y El</td><td>juego de tinción C Hemacolor consta de tres botellas de polietileno de 500 ml (16,9 oz) e incluye un fijador de metanol (Solución 1), una tinción de eosina o ácido (Solución 2) y una tinte básica o azul de metileno (Solución 3)</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar industriales de un solo filo</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Grosor: 0,30 mm (0,012")</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio - Prelimpios/lisos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimensiones: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos Fisherbrand - Rectángulos n.º 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Grosor: 0,13 a 0,17 mm; Tamaño: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Montaje Medio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscopio de disección estereoscópica Leica</td><td>Microsystems</td><td></td><td>El microscopio está equipado con una cámara microscópica Leica modelo MC170 HD y el software de la cámara es Leica App. Suite (LAS E2) Versión 3.1.1 [Compilación: 490]. Partes del microscopio:&nbsp; LED3000 Modelo de iluminación de luz puntual: MEB126, Leica M80 Modelo de portador óptico M80, objetivo acromático 1.0X, WD=90&nbsp; mm Modelo: MOB306 & Acromático objetivo 0.32X, WD=303&nbsp; mm Modelo: MOB315, Video Objective 0.5X Modelo: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Assistant Germany&nbsp;</td><td></td><td>0,100 mm Profundidad - 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida Olympus</td><td>Corporation CKX41SF</td><td></td><td>El microsope está equipado con Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & el software de la cámara es Infinity analyze Version 6.5.2</td></tr><tr><td>Cabina de flujo laminar 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 1375</td><td>Cualquier cabina de flujo laminar para trabajos de cultivo celular será adecuada&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos</td><td>celulares Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo: 370</td><td>Cualquier incubadora de cultivo celular será adecuada - Las células se cultivaron en un ambiente humidificado, 5% CO2, 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Versión 1.50e</td><td>Versión mínima requerida</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment Oracle</td><td></td><td>Versión 1.8.0_66</td><td>Versión mínima requerida</td></tr></tbody></table>

automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando imagej plugins

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

El Instituto Nacional de Salud de ImageJ es una suite de software de libre acceso de gran alcance, el procesamiento de imágenes. ImageJ tiene algoritmos de análisis de partículas integrales que se pueden utilizar con eficacia para contar diversas partículas biológicas. Al contar un gran número de muestras de células, el hemocitómetro presenta un cuello de botella en cuanto a tiempo. Del mismo modo, contando membranas a partir de ensayos de migración / invasión con la célula Contador ImageJ plugin, aunque precisa, es la mano de obra intensiva excepcionalmente, subjetiva, y la mala fama por causar dolor en la muñeca. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado dos plugins dentro de ImageJ con la única tarea de hemocitómetro automático (o volumen conocido) y el recuento de células de migración / invasión. Ambos plugins se basan en la capacidad de adquirir micrografías de alta calidad con el fondo mínimo. Son fáciles de usar y optimizado para el conteo rápido y análisis de muestras de gran tamaño con herramientas de análisis incorporadas para ayudar a la calibración de los recuentos. Al combinar el principio básicos de contador de células con un análisis automatizado algoritmo de recuento y post-conteo, esto aumenta en gran medida la facilidad con la que los ensayos de migración pueden ser procesados ​​sin pérdida de precisión.

Calculadora Concentración celular La Figura 1 presenta el proceso general de calibración CCC y adquisición de imágenes contable. Figura 1A y 1B representan la imagen de calibración P-cuadrado y cálculo de la longitud P-cuadrado en píxeles. CCC determina la concentración de células en un volumen dado mediante la fórmula: <img alt="Ecuación 1" src="/file...

Este artículo describe la cuantificación de hemocitómetros y micrografías de migración/invasión a través de dos nuevos complementos de código abierto de ImageJ: Cell Concentration Calculator y migration assay Counter. Además, describe los protocolos de adquisición y calibración de imágenes, así como analiza en detalle los requisitos de entrada de los complementos.

Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar herramientas de análisis digital para realizar rápidamente conteos precisos de células en una suspensión o en una membrana de ensayo de migración e invasión. Este protocolo puede ayudar a los investigadores a cuantificar el número de células necesario para técnicas comunes y ensayos de movilidad celular in vitro. La principal ventaja de este método es que proporciona conteos rápidos y precisos de células, incluyendo múltiples filtros y herramientas de análisis.Para comenzar, ajuste la iluminación del microscopio al máximo. Cambie al objetivo de 4x y asegúrese de que se estén utilizando los filtros de contraste de fase. Luego, dentro del software del microscopio, configure los ajustes de captura de imagen a sus valores predeterminados.Ahora coloque un hemocitómetro estándar sobre la platina del microscopio y capture una imagen para el paso de calibración del volumen de la imagen. Ajuste el tiempo de exposición según sea necesario. En ImageJ, dentro de la calculadora de concentración celular, abra la imagen y haga clic en el botón Obtener dimensión de la imagen.Esta acción rellena los cuadros de texto de ancho y alto de la imagen con la resolución de la imagen en píxeles. A continuación, seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea recta a lo largo de toda la longitud del cuadrado principal p del hemocitómetro haciendo clic y arrastrando el cursor. Luego, presione la tecla M para mostrar la ventana de resultados.Ahora, escriba el valor de la columna de longitud en el cuadro de texto de longitud del p-cuadrado en la calculadora de concentración celular. Luego, haga clic en el botón Calcular volumen de imagen para mostrar el volumen de la imagen en el cuadro de texto de volumen de imagen. Finalmente, haga clic en el botón Guardar para completar la calibración del complemento.Para el análisis de la muestra, cargue 10 microlitros de células en ambas cámaras de una lámina de hemocitómetro y ajuste el enfoque de manera que el interior de las células sea más oscuro que la membrana celular, para enfocar la sección transversal central de la célula y no los polos. A continuación, ajuste aún más la exposición para que las células no queden sobreexpuestas. Es aceptable que las líneas del hemocitómetro sean ligeramente visibles.Ahora, capture cinco a diez imágenes no superpuestas de la región central del hemocitómetro. La resolución y el aumento de cada imagen deben ser los mismos que se utilizaron para la imagen de calibración de volumen. A continuación, en la calculadora de concentración celular, haga clic en Contar células y, en la ventana emergente, seleccione una carpeta para realizar el conteo.A continuación, en el cuadro de entrada de número de muestra, ingrese el número de imágenes tomadas por cámara y haga clic en Aceptar. El complemento recopilará ahora los datos. Consulte el texto para obtener más detalles. Para comenzar, dentro del software del microscopio, configure los ajustes de captura de imagen a sus valores predeterminados.Para la etapa del microscopio de disección, utilice un fondo blanco sólido y una fuente de luz por encima de la etapa, preferiblemente dos luces LED flexibles. A continuación, coloque una laminilla con la membrana de un ensayo de migración completado sobre la etapa. Observando la imagen en tiempo real mostrada por el software, ajuste manualmente el aumento de modo que los bordes de una sola membrana queden justo dentro del campo de visión de la cámara.A continuación, ajuste las posiciones de las fuentes de luz y los tiempos de exposición para reproducir, lo más fielmente posible, la imagen ideal, que presenta un color de fondo mínimo y una membrana uniformemente iluminada. La precisión del recuento celular depende de la adquisición de imágenes de alta calidad.Por lo tanto, es importante capturar la mejor imagen posible lograda con la cámara del usuario para aprovechar de la manera más eficiente los complementos. Ahora, retire el portaobjetos y equilibre el blanco de la imagen mediante el software del microscopio para completar la calibración. Inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, aplane cada membrana aplicando presión sobre el cubreobjetos para eliminar la mayor cantidad posible de burbujas atrapadas.Ahora, dentro del software, establezca la ubicación de la carpeta de captura. Luego, capture una imagen por membrana, guardando los archivos de imagen como TIF utilizando la convención de nomenclatura de la muestra 001 con aumentos incrementales en el número para cada imagen. Esta convención de nomenclatura es necesaria para que el complemento encuentre los archivos.Si se desea una corrección de campo plano, para cada portaobjetos encuentre un área vacía y tome una imagen en blanco. Guarde el archivo como nombre de la muestra en blanco. A continuación, en ImageJ, abra el complemento TC.Dentro de TC, haga clic en el botón Flatfield y, en el cuadro de diálogo Elegir directorio, seleccione la carpeta donde se guardaron las imágenes de la membrana. Ahora, abra una imagen de membrana de ensayo de migración y seleccione Umbral de color. En la ventana, configure el método en Shanbhag.Establezca el color del umbral en blanco. Configure el espacio de color en RGB y desactive la opción de fondo oscuro. A continuación, ajuste los controles deslizantes superiores a cero y los controles deslizantes inferiores a 255 para que la imagen sea completamente blanca.Una vez que esté blanco, ajuste los controles deslizantes de verde y rojo hasta que solo sean visibles los núcleos. En el complemento TC, copie los valores de los controles deslizantes RGB en los cuadros de texto correspondientes de configuración de umbral RGB. A continuación, haga clic en el botón Agregar/Modificar y sobrescriba la configuración.En el panel de configuración, haga clic en Guardar para escribir la configuración en el disco duro. Ahora, para contar las imágenes con el complemento TC, haga clic en Contar carpeta y seleccione la carpeta que se desea contar. El programa procesará entonces las imágenes y agregará automáticamente los datos a la tabla principal.Ahora, en la tabla principal, habrá una marca de verificación en la columna ¿Calibrar? si en la imagen se marca para calibración según su similitud con las métricas ideales. Seleccione todas las muestras marcadas para calibración.Luego, haga clic derecho y seleccione Recuento y tamaño sugerido. Esto volverá a contar las imágenes con el área mínima de partículas sugerida. A continuación, haga clic derecho nuevamente y seleccione Mostrar gráfico.Una imagen ideal tendrá un gráfico que se asemeja a una distribución normal con una cola larga hacia la derecha. Si es necesario, ajuste el rango inferior de tamaño o los valores umbral de RGB seleccionando la muestra, haciendo clic derecho y seleccionando Recuento y Configuración Manual. Luego, introduzca los valores deseados y haga clic en Contar para volver a contar la imagen.Para ajustar los recuentos manualmente, seleccione las muestras, haga clic derecho en la tabla y elija Abrir imagen con recuentos. Se abrirá la imagen original con marcas rojas que representan cada partícula contada por el complemento. Además, se puede utilizar la opción Mostrar imagen binaria contada para verificar qué tan bien se están resolviendo las células individuales mediante el umbral de color.Para agregar manualmente una cuenta, mantenga presionada la tecla de control y haga clic con el botón izquierdo. Esto añadirá un marcador en la ubicación del cursor, que se sumará al recuento total. Para eliminar manualmente un marcador, haga clic con el botón derecho en la imagen y el complemento eliminará el marcador más cercano al cursor.Para eliminar un grupo de marcadores, seleccione una región de interés y haga clic derecho en la región mientras mantiene presionada la tecla de control. El proceso del calculador de concentración celular depende de la imagen de calibración del p-cuadrado y del cálculo de la longitud del p-cuadrado y los píxeles. El p-cuadrado de un hemocitómetro tiene un volumen de 100 nanolitros, y dado esta constante, se puede calcular el volumen total de la imagen después de convertir los píxeles a milímetros.Una comparación entre recuentos manuales y automatizados en 57 imágenes procedentes de diversos experimentos y tipos celulares muestra una correlación muy estrecha entre ambos métodos. Se contaron con precisión concentraciones comprendidas entre cinco millones y 2.000 células por mililitro mediante el proceso automatizado. La métrica Q representa la claridad general de las imágenes basada en la distribución de tamaños de partículas distintas.Un Q adecuado es mayor que 0,5. Al aplicar estos criterios a una selección de imágenes de calidad moderada a excelente en cuanto a brillo y ruido de fondo, los conteos de imágenes calibradas fueron significativamente más cercanos a los conteos manuales que los conteos de imágenes no calibradas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo contar células en suspensión y a partir de ensayos de motilidad celular de manera precisa y eficiente utilizando los complementos CCC y TC de ImageJ.Una vez dominado el complemento TC, en el que se pueden realizar la adquisición, cuantificación y ajuste de los conteos celulares en menos de una hora. Ambos complementos dependen de la función de conteo de partículas de ImageJ y pueden modificarse mediante la edición de las macros utilizadas por ImageJ. Esto ofrece una mayor flexibilidad al usuario para ampliar el alcance de los complementos a otras partículas.

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Investigación

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Biología

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El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Este método cuantifica la abundancia microbiana utilizando un formato de placa de 96 pocillos para unidades formadoras de colonias de placas (UFC) y se aplica al microbioma de Drosophila en muestras de homogeneización de mosca entera. Las CFU se cuentan con un software automatizado de análisis de imágenes que se proporciona aquí.

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

Este artículo describe métodos paso a paso para automatizar la cuantificación de núcleos basada en imágenes utilizando un programa ejecutable de código abierto validado en una variedad de densidades celulares. Este programa proporciona una alternativa que aborda las barreras relacionadas con el costo, la accesibilidad para los usuarios con habilidades tecnológicas limitadas y la validación específica de la aplicación que puede limitar la utilidad de las tecnologías existentes.

Uso de bibliotecas de visión artificial para optimizar la cuantificación de núcleos

Aprende a cuantificar células en suspensión y ensayos de migración usando plugins de ImageJ. Este protocolo automatizado mejora la precisión y eficiencia en análisis de biología celular.

Automatizado de cuantificación y análisis de los procedimientos de recuento de células usando ImageJ Plugins

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