Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

El objetivo general de este proceso de funcionalización de superficies de vidrio es permitir la captura y liberación suave de células de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la angiogénesis tumoral, posibilitando el cribado de biomarcadores celulares que indiquen resistencia a fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es completamente personalizable para prácticamente cualquier tipo celular de interés.

Mientras exista un anticuerpo específico para el tipo celular, la superficie puede adaptarse para su captura. Aunque este método puede proporcionar información sobre la angiogénesis del cáncer, también podría aplicarse a otras enfermedades, ya que se necesitan muestras purificadas para el desarrollo de tratamientos más personalizados. Tuvimos la idea inicial de este método cuando intentábamos desarrollar un mecanismo de liberación reversible para la captura de células, utilizando la interacción entre desthiobiótina y la familia de la avidina.

Después de limpiar una superficie de vidrio en una máquina de plasma de oxígeno durante cinco minutos según el protocolo descrito, prepare 2,5 mililitros de una solución al 2% de 3-Aminopropil trietoxisilano, o solución APTES, combinando 50 microlitros de APTES y 2,45 mililitros de etanol en un tubo cónico. Aplique la solución de APTES sobre las superficies de vidrio mediante pipeta, luego cúbralas y colóquelas en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante 50 minutos para distribuir uniformemente la capa de APTES. Mientras tanto, precaliente el horno a 55 grados Celsius para las placas de ocho y 24 pozos, o a 90 grados Celsius para las placas de vidrio.

Después de retirar las placas del agitador, use etanol para enjuagar las superficies de vidrio según el protocolo descrito en el texto. Seque las superficies con gas nitrógeno al 100 %. Luego coloque las placas de ocho y 24 pocillos en el horno durante dos horas, o las placas de vidrio en el horno durante una hora.

A continuación, prepare 2,5 mililitros de solución de d-Desthiobiotina, o DSB, mezclando 1,5 miligramos por mililitro de DSB en 37,5 microlitros de DMSO, y agregando cinco miligramos por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampón MES 0,1 Molar, pH 6. Luego combine las dos soluciones. Después de 15 minutos, agregue un microlitro de BME para detener la reacción entre DSB y EDC.

Retire las superficies de vidrio funcionalizadas con APTES caliente del horno y déjelas enfriar durante cinco a diez minutos. Añada tampón MES a las superficies de vidrio para enjuagarlas, sosteniendo la pipeta a un ángulo de 70 grados de manera que la punta no apunte directamente hacia la superficie. Luego, descargue y aspire el tampón desde un punto fijo, como la esquina del pocillo.

Luego, use el tampón MES para enjuagar dos veces más. Aplique la solución DSB sobre las superficies de vidrio. Trasférelas a una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri, tape la placa y retire a la nevera para incubar de 18 a 24 horas.

Después de la incubación a cuatro grados Celsius, use PBS para enjuagar cada superficie de vidrio tres veces, como se demostró anteriormente en este video. Luego, diluya la solución stock de estreptavidina, o SAV, hasta 0,4 miligramos por mililitro, y aplíquela uniformemente sobre las superficies de vidrio de modo que se forme una capa delgada. Después de incubar el vidrio durante 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para enjuagar cada superficie tres veces.

Luego humedezca una toalla de papel con agua desionizada y colóquela plana en una placa de Petri de 14 centímetros alrededor de las placas para retener la humedad en los pocillos. Cubra la placa de Petri con las superficies de vidrio y colóquela en un refrigerador de nivel de bioseguridad 1 a cuatro grados Celsius hasta que sea necesaria. Para realizar la captura celular, aspire el medio de los frascos T175 de células.

Luego, use PBS para enjuagar las células y aspire el tampón. Añada 10 mililitros de un agente de disociación no enzimático, como la Solución de Disociación Celular, al frasco. A continuación, incube a 37 grados Celsius durante seis minutos.

Después de seis minutos, agregue 10 mililitros de HBSS frío para diluir el agente de levantamiento. Luego, pipete 20 microlitros de las células y utilice un hemocitómetro para contarlas. Centrifugue la suspensión celular a 500 x g, a cuatro grados Celsius, durante cinco minutos.

Y use HBSS para resuspender las células a una concentración de un por diez a la sexta células por mililitro. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células en solución y reducir la formación de agregados celulares, que podría disminuir la unión de los anticuerpos. Luego, divida la suspensión celular en soluciones separadas de control y experimentales.

Agregue los anticuerpos biotinilados a las soluciones respectivas de células e incube en un mezclador rotatorio a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Use 150 microlitros de HBSS para lavar el vidrio funcionalizado en placas de ocho pocillos tres veces, como se demostró anteriormente en el video. Añada la solución celular a los pocillos e incube en hielo sobre el agitador durante 45 minutos.

Mientras tanto, prepare una solución de 20 milimolar de biotina en HBSS estéril. Luego, tras la incubación, use suavemente 150 microlitros de HBSS para enjuagar la solución celular del vidrio. Después de repetir el enjuague dos veces más, agregue 150 microlitros de la solución de biotina a cada pocillo de liberación respectivo e incube durante 20 minutos para permitir que transcurra la reacción.

Recolecte las células unidas de forma no específica utilizando HBSS para lavar las células. Luego, continúe con la imagen y el análisis de fluorescencia según el protocolo descrito en el texto. Incluya imágenes de células vivas en un matraz como control.

En este experimento, las células MCF7GFP fueron expuestas a la superficie funcionalizada. Se capturó el 60% de las células utilizando el anticuerpo HLA-ABC. Tras la exposición a biotina 20 milimolar, se liberó el 80% de las células capturadas.

Como se muestra aquí, cuando las células MCF7GFP se mezclaron con células RAW 264.7, se capturó el 50 % de los macrófagos RAW, y la adición posterior de 20 micromolar de biotina liberó el 80 % de las células RAW capturadas. Esta figura ilustra que los macrófagos RAW del control positivo no presentan actividad fluorescente. Sin embargo, las células MCF7GFP del control negativo son positivas para la fluorescencia de GFP.

Dado que un exceso de anticuerpo puede reducir la captura de células, la concentración de anticuerpo se optimizó mediante una titulación desde cero hasta 10.000 nanogramos por mililitro de anticuerpo HLA. Los resultados mostraron que la concentración ideal de anticuerpo estaba entre 100 y 1.000 nanogramos por mililitro. Además, experimentos de optimización celular determinaron que la concentración ideal de células que pueden ser capturadas está entre uno por diez a la quinta y uno por diez a la sexta células, ya que cantidades por debajo de ese número son inferiores al fondo.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días, con menos de seis horas de tiempo experimental, sin incluir las incubaciones nocturnas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recoger los lavados celulares durante los experimentos, ya que pueden proporcionar información vital sobre la eficacia de la superficie. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo para responder preguntas adicionales, como los niveles de expresión de receptores que puedan tener las células de interés.

Tras su desarrollo, la funcionalización de superficies ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de los biomateriales exploren la integración biocompatible de materiales, como implantes en pacientes para diversas enfermedades y lesiones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funcionalizar superficialmente superficies de vidrio para capturar y liberar células de interés, lo que permite su análisis posterior. No olvide que trabajar con células vivas en azida de sodio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como capacitación adecuada, equipo de protección personal (EPP) y eliminación segura al realizar este procedimiento.