Name: Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda un método de funcionalización de superficie con destiobiotina y estreptavidina para capturar y liberar células específicas. Esta técnica personalizable facilita el estudio de la angiogénesis tumoral y la resistencia a fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a la Sociedad Americana del Cáncer, División de Illinois (282802) y a la Fundación Nacional de Ciencias CBET (1512598) por su apoyo financiero. También nos gustaría agradecer a la Dra. Dianwen Zhang del Instituto Beckman de la Universidad de Illinois por su capacitación en microscopía. Finalmente, nos gustaría agradecer a Jared Weddell, Stacie Chen y Spencer Mamer por las discusiones perspicaces.

<ol><li>Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells%3A+a+novel+marker+of+endothelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage.</a> Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).</li>
<li>De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+expression+analysis+in+kidney+glomeruli+using+microdissection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques.</a> Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).</li>
<li>Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+VEGFRs%2C+NRP1%2C+and+PDGFRs+on+Endothelial+Cells+and+Fibroblasts+Reveals+Serum%2C+Intra-Family+Ligand%2C+and+Cross-Family+Ligand+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).</li>
<li>Cheung, L. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+captured+cancer+cells+under+flow+acceleration+in+a+bio-functionalized+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel.</a> Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).</li>
<li>Privorotskaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+thermal+lysis+of+cells+using+silicon-diamond+microcantilever+heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters.</a> Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).</li>
<li>Park, K., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capture+and+lysis+of+vaccinia+virus+particles+using+silicon+nano-scale+probe+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array.</a> Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).</li>
<li>Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+breast+cancer+and+gastric+cancer+circulating+tumor+cells+by+use+of+an+anti+HER2-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device.</a> Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).</li>
<li>Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+combinatorial+mixing+and+screening+of+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays.</a> Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).</li>
<li>Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+detection+of+cancer+cells+by+utilizing+integrated+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems.</a> Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a.</a> PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+pancreatic+circulating+tumour+cells+implicates+WNT+signalling+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis.</a> Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).</li>
<li>Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%3ECapture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">>Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).</li>
<li>Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791(2012).</li>
<li>Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+%26%2334%3Bcritical+shear+stress+level%26%2334%3B+applied+to+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of a &#34;critical shear stress level&#34; applied to adherent mammalian cells.</a> Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).</li>
<li>Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+anchor+targeted+cell+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Secondary anchor targeted cell release.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).</li>
<li>Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-by-cell+profiling+reveals+temporal+dynamics+of+VEGFR1+and+VEGFR2+membrane-localization+following+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Hear.+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia.</a> Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+profiling+of+VEGFRs+reveals+tumor+cell+and+endothelial+cell+heterogeneity+in+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts.</a> Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).</li>
<li>BD Biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CD+Marker+Handbook%3A+Human+and+Mouse%22">CD Marker Handbook: Human and Mouse</a>. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf</a> (2010).</li>
<li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).</li>
<li>Processing Blood. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US20140030238">https://www.google.com/patents/US20140030238</a> (2014).</li>
<li>Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+attenuates+the+fluid+shear+response+of+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).</li>
<li>dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+shear-stress-induced+VEGF+expression+in+endothelial+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival.</a> J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).</li>
<li>Allard, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+Diseases+Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+diseases.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.&#34.</a> Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QFlow+Cytometer-Based+Receptoromic+Screening%3A+A+High-throughput+Quantification+Approach+Informing+Biomarker+Selection+and+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Submiss%22%5BJournal%5D)">QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor.</a> Submiss. , (2016).</li>
<li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+migratory+activity+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+inversely+correlate+with+risk+factors+for+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease.</a> Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).</li>
<li>Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Avidin-Biotin+Technology%3A+Literature+Survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey.</a> Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+labeling+of+cancer+marker+Her2+and+other+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots.</a> Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).</li>
<li>Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).</li>
<li>Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.google.com/patents/US5512439">http://www.google.com/patents/US5512439</a> (1996).</li>
<li>Naranbhai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+blood+processing+variations+on+natural+killer+cell+frequency%2C+activation%2C+chemokine+receptor+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function.</a> J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).</li>
<li>Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las mejoras en las técnicas de aislamiento de células promueve estudios científicos en las relaciones estructura-función en la neurociencia 18, la programación celular en biología regenerativa, y la señalización angiogénica en la biología vascular 19 de vástago. De hecho, cultivo celular primario 20 (por ejemplo, HUVECs) en biología vascular se realiza principalmente a través del uso de técnicas de aislamiento de células. Aislamiento de células también fue utilizado recientement...

De sobremesa enfoques actuales de separación de células (por ejemplo, de células activada por fluorescencia 1, captura por láser micro-disección 2, inmuno-magnética separación del grano 1) puede tomar varias horas de preparación y de clasificación. Estas grandes escalas de tiempo pueden afectar los niveles de respuesta y fisiológicos de expresión, lo que resulta en análisis que no son representativos de la respuesta fisiológica 3. Sistemas que se necesitan rápida y eficiente puede aislar determinados tipos de células sin interrumpir los receptores de los niveles de la superficie celular con el fin de mejorar el aislamiento de células y el enriquecimiento para aplicaciones biomédicas. Por lo tanto, la razón de nuestro enfoque es el desarrollo de un enfoque suave para el aislamiento de células. El &quot;laboratorio en un chip&quot; concepto ofrece la promesa de órdenes de magnitud más rápido aislamiento de células (horas-minutos-a), y con mayor frecuencia implica la captura de células sobre una superficie y células o conte intracelular liberaciónn id a través física 4,5 o 6 métodos químicos. Aunque estos enfoques ofrecen algunas ventajas tales como la identificación de la expresión de proteína 7,8, la identificación de la expresión del ARN 9-11, o incluso proporcionar células para el cultivo in vitro 12,13, muchas de estas técnicas no pueden ser traducidos a los diagnósticos, tales como perfiles de receptor de la célula debido a sus entornos no fisiológicas. Agentes de elevación enzimáticos tales como colagenasas también pueden afectar a los receptores de estas cantidades, es decir, 14,15 técnicas de cuantificación del receptor de células que usan estos agentes de elevación no generará datos fisiológicos precisos. Lisis celular previene la diferenciación entre los receptores de la superficie nativas, y las que se internaliza previamente 16. Este protocolo describe un enfoque rápido y suave para el aislamiento de células.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl) trietoxisilano (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Se utiliza para hacer una solución de APTES al 2%</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma Pico</td><td>Diener</td><td>Modelo 1</td><td>Limpia superficies y permite la unión de PDMS al vidrio</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Utilizado como mecanismo de liberación en la superficie de captura celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Disuelve el DSB en solución</td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>Activa los ácidos carboxílicos y permite la unión de las proteínas a la superficie del vidrio.</td></tr><tr><td>portaobjetos de cultivo de 8 pocillos sin recubrimiento</td><td>BD Falcon</td><td>Caja de 24: 354118 Caja de 96: 354108</td><td>Se utiliza en experimentos celulares con microscopio de fluorescencia Zeiss, como los experimentos de cuantificación de captura y liberación</td></tr> inicial Fondo de <tr><td>vidrio Placas de 24 pocillos</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Se utiliza en experimentos celulares que involucran el lector de placas, como experimentos</td></tr> <tr><td></td><td>de valoración de anticuerpos y celulares.Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Se utiliza para apagar la reacción entre EDC y DSB</td></tr><tr><td>Ácido 4-morfolinoetanosulfónico hidrato (Hidrato MES 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Se utiliza para fabricar un tampón MES de 0,1 M para su uso en la reacción EDC</td></tr><tr><td>Horno de precisión</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Se utiliza en el curado de la capa PDMS y APTES.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Se utiliza para garantizar una distribución uniforme de APTES en las superficies.</td></tr><tr><td>1x Estreptavidina 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Proteína de unión a la biotina. Puede causar irritación.</td></tr><tr><td>Plato de vidrio de 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Utilizado en estudios HUVEC, así como en futuros estudios de perfilado.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 14 cm con tapa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Se utiliza para contener muestras que se están funcionalizando y transportarlas.</td></tr><tr><td>Células MCF7-GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Almacenado en nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>RAW264.7 macrófagos de ratón</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Obsequiado por el laboratorio Smith de la Universidad de Illinois. Almacenado en nitrógeno líquido.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Conservado en 100 ml a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Instalación</td><td>de medios celulares de medio Eagle modificado en la Facultad de Ciencias Químicas en UIUC</td><td>50003PC</td><td>Proveedor: Corning</td></tr><tr><td>Instalación de medios celulares de aminoácidos no esenciales en la Facultad de Ciencias Químicas en UIUC</td><td>25-025-CI</td><td></td><td>Ya agregado a DMEM por instalación. Proveedor: Corning.</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Pequeño 23 cm paquete de 50</td></tr><tr><td>Solución de disociación celular</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Se utiliza para levantar células de forma no enzimática para su uso en experimentos celulares</td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Se utiliza para contar células para la cuantificación de soluciones celulares y la efectividad de captura y liberación.</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Se utiliza para liberar células de la superficie.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Creado a partir de la receta</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para mantener las células vivas en suspensión, así como para lavar las superficies de unión no específica. Adaptado de los protocolos de Cold Spring Harbor: En 500 &nbsp; ml, use 4&nbsp; g NaCl, 0,2 y nbsp; g KCl, 0,0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H2O, 0.03&nbsp; g KH2PO4 y 0,5&nbsp; g de glucosa. Agregue agua desionizada para llegar a &nbsp; 500 ml, filtre y luego refrigere.</td></tr><tr><td>Anticuerpo HLA-ABC</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>Anticuerpo utilizado para capturar células MCF7gfp</td></tr><tr><td>Anticuerpo hIgG</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Anticuerpo utilizado para capturar células MCF7gfp</td></tr><tr><td>Células MCF7 GFP Cell</td><td>Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>línea de cáncer de mama luminal que ha sido transfectado con proteína fluorescente verde.</td></tr><tr><td>Surtido Cónicos</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml cónicos de plástico para almacenar soluciones y alícuotas.</td></tr><tr><td>Rotores de minitubos (mezclador de extremo a extremo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Se utiliza para incubar anticuerpos y mezclar otras soluciones celulares con el fin de mezclar</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (microscopio de fluorescencia)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscopio de fluorescencia invertida Zeiss Axiovert 200 M.</td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Zeba</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Se utiliza para purificar anticuerpos recién biotinilados después del uso del kit de biotinilación. Instrucciones proporcionadas en: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Kit de biotinilación de bajo peso</td><td>Termocientífico</td><td></td><td>Se utiliza para biotinilar anticuerpos para permitirles integrarse con la superficie de captura</td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>Se utiliza para medir cuantitativamente la intensidad fluorescente en los experimentos de valoración.</td></tr></tbody></table>

un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Uno de los factores limitantes para la adopción y el avance de la medicina personalizada es la incapacidad de desarrollar herramientas de diagnóstico para sondear los matices individuales en la expresión de un paciente a otro. Las metodologías actuales que intentan separar las células para llenar este nicho dan como resultado una interrupción de la expresión fisiológica, lo que hace que la técnica de separación sea inútil como herramienta de diagnóstico. En este protocolo, describimos la funcionalización y optimización de una superficie para la captura y liberación celular. Esta superficie funcionalizada integra anticuerpos biotinilados con una superficie de vidrio funcionalizada con un aminosilano (APTES), destiobiotina y estreptavidina. La liberación celular se facilita mediante la introducción de biotina, lo que permite la recolección y purificación de las células capturadas por la superficie. Esta liberación se realiza a través de la focalización de la fracción secundaria destiobitina, lo que da como resultado un paradigma de liberación mucho más suave. Esta reducción de los reactivos agresivos y las fuerzas de cizallamiento reduce los cambios en la expresión celular. La superficie funcionalizada captura hasta el 80% de las células en una mezcla de células individuales y ha demostrado una captura del 50% en una mezcla de células dobles. Se investigan las aplicaciones de esta tecnología a los xenoinjertos y a los estudios de separación del cáncer. También se describen las técnicas de cuantificación para la verificación de superficies, como el lector de placas y los análisis ImageJ.

El uso de este protocolo se muestra la captura de células (Figura 3A) y la liberación de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, así como controles de células vivas (Figura 4). Se cuantificó la captura de células en un 60% y el 80% fueron puestos en libertad (Figura 3C). Cuando nos extendió este enfoque a una mezcla de RAW 264.7 macrófagos y células MCF7GFP, 50% de los macrófagos RAW fueron capturados (Fig. 3D)</...

Este protocolo describe la funcionalización de superficie personalizable del sistema de destiobiotina, estreptavidina y APTES para aislar tipos celulares específicos de interés. Además, este manuscrito cubre las aplicaciones, optimización y verificación de este proceso.

Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

El objetivo general de este proceso de funcionalización de superficies de vidrio es permitir la captura y liberación suave de células de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la angiogénesis tumoral, posibilitando el cribado de biomarcadores celulares que indiquen resistencia a fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es completamente personalizable para prácticamente cualquier tipo celular de interés.Mientras exista un anticuerpo específico para el tipo celular, la superficie puede adaptarse para su captura. Aunque este método puede proporcionar información sobre la angiogénesis del cáncer, también podría aplicarse a otras enfermedades, ya que se necesitan muestras purificadas para el desarrollo de tratamientos más personalizados. Tuvimos la idea inicial de este método cuando intentábamos desarrollar un mecanismo de liberación reversible para la captura de células, utilizando la interacción entre desthiobiótina y la familia de la avidina.Después de limpiar una superficie de vidrio en una máquina de plasma de oxígeno durante cinco minutos según el protocolo descrito, prepare 2,5 mililitros de una solución al 2% de 3-Aminopropil trietoxisilano, o solución APTES, combinando 50 microlitros de APTES y 2,45 mililitros de etanol en un tubo cónico. Aplique la solución de APTES sobre las superficies de vidrio mediante pipeta, luego cúbralas y colóquelas en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante 50 minutos para distribuir uniformemente la capa de APTES. Mientras tanto, precaliente el horno a 55 grados Celsius para las placas de ocho y 24 pozos, o a 90 grados Celsius para las placas de vidrio.Después de retirar las placas del agitador, use etanol para enjuagar las superficies de vidrio según el protocolo descrito en el texto. Seque las superficies con gas nitrógeno al 100 %. Luego coloque las placas de ocho y 24 pocillos en el horno durante dos horas, o las placas de vidrio en el horno durante una hora.A continuación, prepare 2,5 mililitros de solución de d-Desthiobiotina, o DSB, mezclando 1,5 miligramos por mililitro de DSB en 37,5 microlitros de DMSO, y agregando cinco miligramos por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampón MES 0,1 Molar, pH 6. Luego combine las dos soluciones. Después de 15 minutos, agregue un microlitro de BME para detener la reacción entre DSB y EDC.Retire las superficies de vidrio funcionalizadas con APTES caliente del horno y déjelas enfriar durante cinco a diez minutos. Añada tampón MES a las superficies de vidrio para enjuagarlas, sosteniendo la pipeta a un ángulo de 70 grados de manera que la punta no apunte directamente hacia la superficie. Luego, descargue y aspire el tampón desde un punto fijo, como la esquina del pocillo.Luego, use el tampón MES para enjuagar dos veces más. Aplique la solución DSB sobre las superficies de vidrio. Trasférelas a una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri, tape la placa y retire a la nevera para incubar de 18 a 24 horas.Después de la incubación a cuatro grados Celsius, use PBS para enjuagar cada superficie de vidrio tres veces, como se demostró anteriormente en este video. Luego, diluya la solución stock de estreptavidina, o SAV, hasta 0,4 miligramos por mililitro, y aplíquela uniformemente sobre las superficies de vidrio de modo que se forme una capa delgada. Después de incubar el vidrio durante 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para enjuagar cada superficie tres veces.Luego humedezca una toalla de papel con agua desionizada y colóquela plana en una placa de Petri de 14 centímetros alrededor de las placas para retener la humedad en los pocillos. Cubra la placa de Petri con las superficies de vidrio y colóquela en un refrigerador de nivel de bioseguridad 1 a cuatro grados Celsius hasta que sea necesaria. Para realizar la captura celular, aspire el medio de los frascos T175 de células.Luego, use PBS para enjuagar las células y aspire el tampón. Añada 10 mililitros de un agente de disociación no enzimático, como la Solución de Disociación Celular, al frasco. A continuación, incube a 37 grados Celsius durante seis minutos.Después de seis minutos, agregue 10 mililitros de HBSS frío para diluir el agente de levantamiento. Luego, pipete 20 microlitros de las células y utilice un hemocitómetro para contarlas. Centrifugue la suspensión celular a 500 x g, a cuatro grados Celsius, durante cinco minutos.Y use HBSS para resuspender las células a una concentración de un por diez a la sexta células por mililitro. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células en solución y reducir la formación de agregados celulares, que podría disminuir la unión de los anticuerpos. Luego, divida la suspensión celular en soluciones separadas de control y experimentales.Agregue los anticuerpos biotinilados a las soluciones respectivas de células e incube en un mezclador rotatorio a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Use 150 microlitros de HBSS para lavar el vidrio funcionalizado en placas de ocho pocillos tres veces, como se demostró anteriormente en el video. Añada la solución celular a los pocillos e incube en hielo sobre el agitador durante 45 minutos.Mientras tanto, prepare una solución de 20 milimolar de biotina en HBSS estéril. Luego, tras la incubación, use suavemente 150 microlitros de HBSS para enjuagar la solución celular del vidrio. Después de repetir el enjuague dos veces más, agregue 150 microlitros de la solución de biotina a cada pocillo de liberación respectivo e incube durante 20 minutos para permitir que transcurra la reacción.Recolecte las células unidas de forma no específica utilizando HBSS para lavar las células. Luego, continúe con la imagen y el análisis de fluorescencia según el protocolo descrito en el texto. Incluya imágenes de células vivas en un matraz como control.En este experimento, las células MCF7GFP fueron expuestas a la superficie funcionalizada. Se capturó el 60% de las células utilizando el anticuerpo HLA-ABC. Tras la exposición a biotina 20 milimolar, se liberó el 80% de las células capturadas.Como se muestra aquí, cuando las células MCF7GFP se mezclaron con células RAW 264.7, se capturó el 50 % de los macrófagos RAW, y la adición posterior de 20 micromolar de biotina liberó el 80 % de las células RAW capturadas. Esta figura ilustra que los macrófagos RAW del control positivo no presentan actividad fluorescente. Sin embargo, las células MCF7GFP del control negativo son positivas para la fluorescencia de GFP.Dado que un exceso de anticuerpo puede reducir la captura de células, la concentración de anticuerpo se optimizó mediante una titulación desde cero hasta 10.000 nanogramos por mililitro de anticuerpo HLA. Los resultados mostraron que la concentración ideal de anticuerpo estaba entre 100 y 1.000 nanogramos por mililitro. Además, experimentos de optimización celular determinaron que la concentración ideal de células que pueden ser capturadas está entre uno por diez a la quinta y uno por diez a la sexta células, ya que cantidades por debajo de ese número son inferiores al fondo.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días, con menos de seis horas de tiempo experimental, sin incluir las incubaciones nocturnas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recoger los lavados celulares durante los experimentos, ya que pueden proporcionar información vital sobre la eficacia de la superficie. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo para responder preguntas adicionales, como los niveles de expresión de receptores que puedan tener las células de interés.Tras su desarrollo, la funcionalización de superficies ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de los biomateriales exploren la integración biocompatible de materiales, como implantes en pacientes para diversas enfermedades y lesiones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funcionalizar superficialmente superficies de vidrio para capturar y liberar células de interés, lo que permite su análisis posterior. No olvide que trabajar con células vivas en azida de sodio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como capacitación adecuada, equipo de protección personal (EPP) y eliminación segura al realizar este procedimiento.

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fuente: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradables para la detección, selección y aislamiento de bacterias. J. Vis. Exp. (2021).Este video demuestra la extracción de colonias bacterianas de un hidrogel fotodegradable utilizando luz ultravioleta. Se selecciona una colonia específica y se diseña una exposición a la luz con patrón para iniciar la degradación localizada del hidrogel. Después de ajustar la intensidad y la duración de la luz, se aplica la luz ultravioleta, liberando...

Aislamiento de colonias bacterianas dirigidas mediante degradación de hidrogel con patrón de luz

En este video, demostramos el aislamiento de células de cáncer epitelial que expresan EpCAM a partir de muestras de sangre periférica. La técnica implica el uso de un cable de grado médico funcionalizado con anticuerpos EpCAM para capturar las células objetivo. A continuación, las células capturadas se extraen en una solución tampón.

Aislamiento funcionalizado de células diana basadas en alambres: una técnica ex vivo para aislar células cancerosas de sangre periférica enriquecida

Dielectroforesis Contactless (CDEP) logra la clasificación y el enriquecimiento de las partículas a través de sus propiedades dieléctricas intrínsecas. Canales de electrodos Fluídicas reemplazar electrodos metálicos tradicionales para DEP, satisfaciendo CDEP para no dañar la caracterización estéril y clasificación de partículas biológicas. Demostramos cómo preparar un microdispositivo CDEP y llevar a cabo la caracterización de células y experimentos de clasificación.

Aislamiento libre de marca y el enriquecimiento de las células a través Contactless Dielectroforesis

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Se informa del uso de hidrogeles fotodegradables para aislar células bacterianas mediante el uso de una herramienta de pattering de luz de alta resolución. Se revisan los procedimientos experimentales esenciales, los resultados y las ventajas del proceso. El método permite el aislamiento rápido y económico de bacterias objetivo que muestran funciones raras o únicas de comunidades o poblaciones heterogéneas.

Interfaces de hidrogel fotodegradables para detección, selección y aislamiento de bacterias

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Aprenda un método de funcionalización de superficie con destiobiotina y estreptavidina para capturar y liberar células específicas. Esta técnica personalizable facilita el estudio de la angiogénesis tumoral y la resistencia a fármacos.

Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

Explorar más videos