Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

El objetivo general de este proceso de funcionalización de la superficie del vidrio es permitir la captura y liberación suave de las células de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la angiogénesis tumoral, permitiendo el cribado de biomarcadores celulares que indican resistencia a los fármacos. La principal ventaja de esta técnica es que es completamente personalizable, para prácticamente cualquier tipo de célula de interés.

Siempre que exista un anticuerpo específico para el tipo de célula, la superficie se puede adaptar para su captura. Aunque este método puede proporcionar información sobre la angiogénesis del cáncer, también se puede aplicar a otras enfermedades, ya que las muestras purificadas son necesarias para el desarrollo de regímenes de tratamiento más personalizados. La idea de este método fue cuando intentábamos desarrollar un mecanismo de liberación reversible para capturar células, utilizando la interacción entre la destiobiotina y la familia de las adivinaciones.

Después de limpiar una superficie de vidrio en una máquina de plasma de oxígeno durante cinco minutos de acuerdo con el protocolo de texto, prepare 2,5 mililitros de 3-aminopropil trietoxisilano reconstituido al 2%, o solución APTES, combinando 50 microlitros de APTES y 2,45 mililitros de etanol en un tubo cónico. Pipetee la solución de APTES sobre las superficies de vidrio, luego cubra las superficies y colóquelas en un agitador de plataforma a temperatura ambiente durante 50 minutos para distribuir uniformemente la capa de APTES. Mientras tanto, precaliente el horno a 55 grados centígrados para los platos de ocho y 24 pocillos, o a 90 grados centígrados para los platos de vidrio.

Después de retirar las placas del agitador, use etanol para enjuagar las superficies de vidrio de acuerdo con el protocolo de texto. Con 100% de gas nitrógeno, seque las superficies. Luego coloque las placas de ocho y 24 pocillos en el horno durante dos horas, o los platos de vidrio en el horno durante una hora.

A continuación, prepare 2,5 mililitros de d-destiobitina, o solución de DSB, mezclando 1,5 miligramos por mililitro de DSB en 37,5 microlitros de DMSO y añadiendo cinco miligramos por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampón MES 0,1 molar, pH 6. A continuación, combine las dos soluciones. Después de 15 minutos, agregue un microlitro de BME para apagar la reacción entre DSB y EDC.

Retire las superficies de vidrio funcionalizadas APTES calientes del horno y deje que se enfríen durante cinco a 10 minutos. Agregue tampón MES a las superficies de vidrio para enjuagarlas sosteniendo la pipeta en un ángulo de 70 grados para que la punta no apunte directamente a la superficie. A continuación, descargue y extraiga el tampón desde un punto fijo, como la esquina del pozo.

A continuación, utilice el tampón MES para enjuagar dos veces más. Aplique la solución DSB a las superficies de vidrio. Transfiéralos a una toalla de papel húmeda dentro de una placa de Petri, cubra la placa e incube en el refrigerador durante 18 a 24 horas.

Después de la incubación a cuatro grados centígrados, use PBS para enjuagar cada superficie de vidrio tres veces, como se demostró anteriormente en este video. A continuación, diluya la estreptavidina, o solución madre de SAV, a 0,4 miligramos por mililitro, y aplíquela uniformemente sobre las superficies del vidrio para que se forme una capa fina. Después de incubar el vidrio durante 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para enjuagar cada superficie tres veces.

Luego humedezca una toalla de papel con agua desionizada y colóquela plana en una placa de Petri de 14 centímetros que rodee las placas para retener la humedad en los pozos. Cubra la placa de Petri con las superficies de vidrio y colóquela en un refrigerador de nivel 1 de bioseguridad a cuatro grados centígrados hasta que la necesite. Para llevar a cabo la captura de células, aspire el medio de los matraces T175 de células.

A continuación, utilice PBS para enjuagar las células y aspirar el tampón. Añada 10 mililitros de agente elevante no enzimático, como la solución de disociación celular, al matraz. A continuación, incubar a 37 grados centígrados durante seis minutos.

Después de seis minutos, agregue 10 mililitros de HBSS frío para diluir el agente de elevación. A continuación, pipetea 20 microlitros de las células y utiliza un hemocitómetro para contarlas. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g, en cuatro grados centígrados, durante cinco minutos.

Y use HBSS para resuspender las células a una por 10 a la sexta celdas por mililitro. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células en solución y reducir la aglomeración celular que puede reducir la unión de anticuerpos. A continuación, divida la suspensión celular en soluciones separadas de control y experimentales.

Agregue los anticuerpos biotinilados a las soluciones celulares respectivas e incube en un mezclador de extremo a extremo a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Use 150 microlitros de HBSS para lavar el vidrio funcionalizado en placas de ocho pocillos tres veces, como se demostró anteriormente en el video. Agregue la solución celular a los pocillos e incube en hielo en el agitador durante 45 minutos.

Mientras tanto, prepare una solución de 20 milimolares de biotina en HBSS estéril. Luego, después de la incubación, use suavemente 150 microlitros de HBSS para enjuagar la solución celular del vidrio. Después de repetir el enjuague dos veces más, agregue 150 microlitros de la solución de biotina a cada pocillo de liberación respectivo e incube durante 20 minutos para permitir que la reacción continúe.

Recoja las células unidas de forma no específica mediante el uso de HBSS para lavar las células. A continuación, proceda a la obtención de imágenes de fluorescencia y al análisis de acuerdo con el protocolo de texto. Incluya imágenes de células vivas en un matraz como control.

En este experimento, se expusieron MCF7GFP células a la superficie funcionalizada y el 60% de las células se capturaron utilizando el anticuerpo HLA-ABC. Tras la exposición a 20 milimolares de biotina, se liberó el 80% de las células capturadas.

Como se muestra aquí, cuando las células MCF7GFP se mezclaron con células RAW 264,7, se capturó el 50% de los macrófagos RAW, y la adición de 20 biotina micromolar liberó posteriormente el 80% de las células RAW capturadas. Esta figura ilustra que los macrófagos RAW de control positivo no muestran actividad de fluorescencia. Sin embargo, las células MCF7GFP control negativas son positivas para la fluorescencia GFP.

Debido a que el exceso de anticuerpos puede disminuir la captura de células, la concentración de anticuerpos se optimizó mediante la valoración de cero a 10.000 nanogramos por mililitro de anticuerpo HLA. Los resultados mostraron que la concentración ideal de anticuerpos estaba entre 100 y 1.000 nanogramos por mililitro. Además, los experimentos de optimización de celdas determinaron que la concentración ideal de células que se pueden capturar está entre una vez 10 a la quinta, y una vez 10 a la sexta celda, ya que las cantidades por debajo de ese número son inferiores a las del fondo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días, con menos de seis horas de tiempo experimental, sin incluir las incubaciones nocturnas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recolectar los lavados celulares durante los experimentos, ya que pueden brindar información vital sobre la efectividad de la superficie. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo, para responder a preguntas adicionales, como qué niveles de expresión de receptores pueden tener las células de interés.

Después de su desarrollo, la funcionalización de superficies ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de los biomateriales exploren la integración biosegura de materiales, como los implantes, en pacientes para una variedad de enfermedades y lesiones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo funcionalizar las superficies de vidrio para capturar y liberar celdas de interés, lo que permite el análisis posterior. No olvide que trabajar con células vivas en azida de sodio puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la capacitación adecuada, el EPP y la eliminación mientras se realiza este procedimiento.