Un análisis basado en la citometría de flujo para identificar compuestos que alteran la Unión del ligando de quimiocina CXC marcada con fluorescencia 12 al CXC Chemokine Receptor 4

Un flujo de ensayo de enlace celular basado en la citometría se describe que se utiliza principalmente como una herramienta de detección para identificar compuestos que inhiben el atascamiento de un ligand de quimiocina CXC fluorescencia etiquetado 12 (CXCL12) para el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4).

El objetivo general del ensayo basado en células es identificar moléculas que se unen a un receptor acoplado a una proteína G. Se basa en su capacidad para competir con un ligando marcado con fluorescencia para unirse al receptor. El ensayo de unión a la competencia puede respaldar el descubrimiento de fármacos con receptores acoplados a proteínas G.

Como demostraremos con este protocolo para el receptor de quimiocinas, CXC4. La principal ventaja de este método es que se utilizan células vivas para analizar la unión receptiva en lugar de las preparaciones de memoria. Y que se evite el uso de sondas marcadoras de radiactividad.

Aunque este método se ha establecido inicialmente para estudiar la unión al receptor de quimiocinas CXCR4, también se puede desarrollar para otros GPCR para los que existen ligandos marcados con fluorescencia. Para comenzar, dispense 100 microlitros de solución compuesta en una placa inferior transparente de 96 pozos redondeados, de acuerdo con un diseño experimental predefinido. Añada 50 microlitros de suspensión celular de un depósito de reactivo a la placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal.

Incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de CXCL12 de 100 nanogramos por mililitro marcado con fluorescencia de un depósito de reactivo similar a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, centrifuga la placa de 96 pocillos a 400 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de las células peletizadas volteando la placa. Seque el plato sobre un pañuelo de papel.

Añada 200 microlitros de tampón SA fresco de un depósito de reactivos a los pocillos mediante una pipeta multicanal. Proceda inmediatamente a centrifugar la placa nuevamente, durante cinco minutos a 400 veces la gravedad a temperatura ambiente. Vuelva a retirar el sobrenadante, volteando la placa y luego secándola en un pañuelo de papel.

Finalmente, resuspenda suavemente el pellet celular en 200 microlitros de paraformaldehído al 1% disuelto en PBS. Este paso arreglará las celdas. Para analizar las muestras por citometría de flujo, ponga en marcha el dispositivo y abra el software correspondiente.

Seleccione los parámetros celulares que se visualizarán en un formato de bloque de puntos, como área de dispersión directa, área de dispersión lateral y, en una vista de histograma, el canal de detección de fluoro cuatro. Escoja una muestra. Por ejemplo, una muestra de control negativo, para realizar la compuerta de una población de células homogéneas definida en función de los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral.

Adapte la configuración para cargar las células en el dispositivo de citometría de flujo. Seleccione tres mezclas antes de la inyección. Seleccione la inyección automática de 100 microlitros de células fijadas y utilice un caudal de muestra de 1,5 microlitros por segundo.

Para ejecutar el ejemplo, seleccione adquirir datos. Los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral para esta muestra, así como la detección de fluoro cuatro, ahora aparecerán en la pantalla. Ahora, seleccione la herramienta de compuerta de software.

Sobre la base de la visualización del diagrama de puntos de dispersión directa y dispersión lateral, predefina una población de células homogénea y viable mediante compuerta. Seleccione esta opción para analizar 20.000 eventos por muestra. Esto significa que para cada muestra, se analizarán 20.000 células que se encuentran dentro de una puerta predefinida.

La adquisición de datos continuará hasta que se alcance este número de eventos. Inicie el recorrido seleccionando primero los pozos a analizar. A continuación, selecciona los pozos de ejecución.

El dispositivo de citometría de flujo ahora analizará estas muestras una por una, registrando la intensidad de fluorescencia media para cada muestra. Que corresponde a la señal fluorescente media de las 20.000 células que se encuentran dentro de la puerta predefinida. Por último, realice el análisis de datos como se describe en el protocolo.

Tras la preincubación de células jurkat con altas concentraciones de AMD3100, antagonista CXCR4 no establecido y específico. La intensidad media de fluorescencia que refleja la unión de CXCL12 marcado se reduce casi por completo a los niveles de fondo. Esto demuestra la unión altamente específica de CXCL12 a CXCR4 expresada en células jurkat.

Los compuestos que no pueden competir con CXCL12 marcados para unirse al receptor CXCR4, como el antagonista de CCR5 Maraviroc, no afectarán la intensidad media de fluorescencia. Por el contrario, los compuestos altamente activos harán esto de una manera dependiente de la dosis. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de unión receptiva de competencia utilizando células vivas y citometría de flujo.