Un análisis basado en la citometría de flujo para identificar compuestos que alteran la Unión del ligando de quimiocina CXC marcada con fluorescencia 12 al CXC Chemokine Receptor 4
10 de marzo de 2018
Un flujo de ensayo de enlace celular basado en la citometría se describe que se utiliza principalmente como una herramienta de detección para identificar compuestos que inhiben el atascamiento de un ligand de quimiocina CXC fluorescencia etiquetado 12 (CXCL12) para el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4).
El objetivo general del ensayo basado en células es identificar moléculas que se unen a un receptor acoplado a una proteína G. Se basa en su capacidad para competir con un ligando marcado con fluorescencia para unirse al receptor. El ensayo de unión a la competencia puede respaldar el descubrimiento de fármacos con receptores acoplados a proteínas G.
Como demostraremos con este protocolo para el receptor de quimiocinas, CXC4. La principal ventaja de este método es que se utilizan células vivas para analizar la unión receptiva en lugar de las preparaciones de memoria. Y que se evite el uso de sondas marcadoras de radiactividad.
Aunque este método se ha establecido inicialmente para estudiar la unión al receptor de quimiocinas CXCR4, también se puede desarrollar para otros GPCR para los que existen ligandos marcados con fluorescencia. Para comenzar, dispense 100 microlitros de solución compuesta en una placa inferior transparente de 96 pozos redondeados, de acuerdo con un diseño experimental predefinido. Añada 50 microlitros de suspensión celular de un depósito de reactivo a la placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal.
Incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de CXCL12 de 100 nanogramos por mililitro marcado con fluorescencia de un depósito de reactivo similar a los pocillos de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, centrifuga la placa de 96 pocillos a 400 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de las células peletizadas volteando la placa. Seque el plato sobre un pañuelo de papel.
Añada 200 microlitros de tampón SA fresco de un depósito de reactivos a los pocillos mediante una pipeta multicanal. Proceda inmediatamente a centrifugar la placa nuevamente, durante cinco minutos a 400 veces la gravedad a temperatura ambiente. Vuelva a retirar el sobrenadante, volteando la placa y luego secándola en un pañuelo de papel.
Finalmente, resuspenda suavemente el pellet celular en 200 microlitros de paraformaldehído al 1% disuelto en PBS. Este paso arreglará las celdas. Para analizar las muestras por citometría de flujo, ponga en marcha el dispositivo y abra el software correspondiente.
Seleccione los parámetros celulares que se visualizarán en un formato de bloque de puntos, como área de dispersión directa, área de dispersión lateral y, en una vista de histograma, el canal de detección de fluoro cuatro. Escoja una muestra. Por ejemplo, una muestra de control negativo, para realizar la compuerta de una población de células homogéneas definida en función de los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral.
Adapte la configuración para cargar las células en el dispositivo de citometría de flujo. Seleccione tres mezclas antes de la inyección. Seleccione la inyección automática de 100 microlitros de células fijadas y utilice un caudal de muestra de 1,5 microlitros por segundo.
Para ejecutar el ejemplo, seleccione adquirir datos. Los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral para esta muestra, así como la detección de fluoro cuatro, ahora aparecerán en la pantalla. Ahora, seleccione la herramienta de compuerta de software.
Sobre la base de la visualización del diagrama de puntos de dispersión directa y dispersión lateral, predefina una población de células homogénea y viable mediante compuerta. Seleccione esta opción para analizar 20.000 eventos por muestra. Esto significa que para cada muestra, se analizarán 20.000 células que se encuentran dentro de una puerta predefinida.
La adquisición de datos continuará hasta que se alcance este número de eventos. Inicie el recorrido seleccionando primero los pozos a analizar. A continuación, selecciona los pozos de ejecución.
El dispositivo de citometría de flujo ahora analizará estas muestras una por una, registrando la intensidad de fluorescencia media para cada muestra. Que corresponde a la señal fluorescente media de las 20.000 células que se encuentran dentro de la puerta predefinida. Por último, realice el análisis de datos como se describe en el protocolo.
Tras la preincubación de células jurkat con altas concentraciones de AMD3100, antagonista CXCR4 no establecido y específico. La intensidad media de fluorescencia que refleja la unión de CXCL12 marcado se reduce casi por completo a los niveles de fondo. Esto demuestra la unión altamente específica de CXCL12 a CXCR4 expresada en células jurkat.
Los compuestos que no pueden competir con CXCL12 marcados para unirse al receptor CXCR4, como el antagonista de CCR5 Maraviroc, no afectarán la intensidad media de fluorescencia. Por el contrario, los compuestos altamente activos harán esto de una manera dependiente de la dosis. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de unión receptiva de competencia utilizando células vivas y citometría de flujo.
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Descripción general
Este artículo describe un ensayo celular de unión basado en citometría de flujo dirigido a identificar compuestos que inhiban la unión de CXCL12 a CXCR4. El método utiliza células vivas para analizar la unión al receptor, evitando el uso de etiquetas radiactivas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ensayos de unión celular
- Receptores acoplados a proteínas G
- Descubrimiento de fármacos
Antecedentes
- El CXCL12 es una quimiocina que se une al CXCR4, un receptor acoplado a proteína G.
- La identificación de inhibidores de esta unión puede contribuir al desarrollo de fármacos.
- Los métodos tradicionales suelen implicar el uso de radioactividad, lo cual este ensayo busca evitar.
- El uso de células vivas proporciona una representación más precisa de las interacciones biológicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una herramienta de cribado para identificar compuestos que inhiban la unión de CXCL12 a CXCR4.
- Mostrar las ventajas del uso de células vivas en ensayos de unión.
- Apoyar los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para receptores acoplados a proteínas G.
Métodos Utilizados
- Citometría de flujo para analizar la unión celular.
- Uso de ligandos marcados con fluorescencia para evaluar la competencia de unión.
- Ensayos en células vivas para evaluar interacciones de receptores.
- Evitación del marcado radiactivo en el diseño experimental.
Resultados principales
- El ensayo identifica con éxito compuestos que inhiben la unión de CXCL12.
- El análisis en células vivas proporciona datos más relevantes en comparación con los métodos tradicionales.
- El método es eficaz para tamizar posibles candidatos a fármacos.
- Los resultados respaldan la viabilidad de utilizar este ensayo en el descubrimiento de fármacos.
Conclusiones
- El ensayo basado en citometría de flujo es una herramienta valiosa para identificar inhibidores de CXCR4.
- El uso de células vivas mejora la precisión de los estudios de unión.
- Evitar la radioactividad simplifica el proceso experimental.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo de unión competitiva basado en citometría de flujo permite a los equipos de biofármacos identificar moléculas pequeñas que interrumpen las interacciones entre CXCL12 y CXCR4, un objetivo clave en las líneas de desarrollo oncológico y de enfermedades inflamatorias. Mediante el uso de células vivas y ligandos fluorescentes, el método evita la radioactividad y proporciona datos de unión fisiológicamente relevantes. Apoya la validación temprana del blanco y la identificación de compuestos iniciales al ofrecer lecturas cuantitativas y reproducibles para la priorización de compuestos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de los efectos directos del compuesto sobre la unión receptor-ligando en un contexto celular nativo.
- Valor operativo: Proporciona una lectura funcional que reduce el riesgo asociado a CXCR4 como diana, mediante la confirmación mecanicista de la actividad del compuesto.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar compuestos con perfiles de inhibición dependientes de la dosis, indicativos de la interacción con la diana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de inhibición de unión mediante la intensidad de fluorescencia media, permitiendo el análisis de la relación estructura-actividad.
- Valor operativo: Adaptable al formato de placa de 96 pocillos, lo que aumenta el rendimiento para campañas de cribado manteniendo la consistencia del ensayo.
- Reutilización: Establece una plataforma estandarizada aplicable a otros receptores acoplados a proteínas G cuando existen ligandos fluorescentes disponibles, reduciendo el esfuerzo de redesarrollo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza células Jurkat vivas para reflejar la expresión fisiológica de receptores y la dinámica de unión, mejorando la relevancia traslacional.
- Valor operativo: Genera datos compatibles con evaluaciones preclínicas posteriores al confirmar los efectos de compuestos específicos para el blanco.
- Reducción de riesgos: Disminuye los falsos positivos al distinguir inhibidores específicos de CXCR4 de compuestos no específicos (por ejemplo, el maraviroc no muestra efecto).
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando datos de unión que orientan la progresión de golpe a líder. Complementa la selección fenotípica al añadir profundidad mecanicista a la caracterización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de la alteración inducida por compuestos en la unión de CXCL12 a CXCR4 en células vivas.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante pasos estandarizados de incubación, lavado y fijación compatibles con lecturas de citometría de flujo.
- Análisis: Proporciona la intensidad media de fluorescencia como resultado cuantitativo para comparar la potencia y eficacia de compuestos a diferentes dosis.
- Investigación Traducional: Utiliza una línea celular relevante para la enfermedad (Jurkat) que expresa CXCR4, vinculando los datos de unión con el posible impacto terapéutico en cáncer e inflamación.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma modular de unión transferible entre distintos objetivos GPCR, maximizando el retorno de la inversión en el desarrollo de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la interacción con el blanco al demostrar la unión específica y desplazable de CXCL12 a CXCR4.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de manipulación celular, tiempos de incubación y protocolos de selección de eventos en citometría de flujo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al filtrar compuestos que carecen de actividad específica sobre el blanco en las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al identificar compuestos con perfiles claros de inhibición dependientes de la dosis.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la operación de citometría de flujo, compensación y estrategias de selección de poblaciones de células viables.
- Depende del acceso a citómetros de flujo capaces de detectar señales fluorescentes en el canal apropiado (por ejemplo, FITC o equivalente).
- Necesita la estandarización de la preparación de células, dilución de compuestos y condiciones de incubación entre lotes de cribado.
- La adaptación a otros receptores acoplados a proteínas G requiere el desarrollo o adquisición de ligandos marcados con fluoróforos específicos para el receptor diana.
- Las limitaciones prácticas incluyen la duración del ensayo (~90 minutos más el tiempo de análisis) y la necesidad de optimizar la concentración del ligando para garantizar relaciones señal-ruido robustas.
