Name: Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar el autoensamblaje de proteínas in vivo mediante citometría de flujo DAmFRET con resolución de célula única. Este método de alto rendimiento permite estudiar barreras de nucleación en diversos organismos modelo.

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Nos gustaría agradecer a Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan y Ellen Ketter por su trabajo en el desarrollo del ensayo. Este trabajo se realizó para cumplir, en parte, con los requisitos para la investigación de tesis doctorales para T.S.K. y A.R.G como estudiantes registrados en la Open University, Reino Unido, y el Stowers Institute for Medical Research Graduate School, EE.UU., respectivamente. Puede encontrar información adicional relacionada con el ensayo en https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Este trabajo fue financiado por el Premio de Independencia Temprana del Director de NIH DP5-OD009152, la Beca No 5-FY17-32 de la Fundación March of Dimes y el Instituto Stowers para la Investigación Médica.
Las contribuciones de los autores son las siguientes. Conceptualización: T.S.K., S.V. y R.H.; Metodología: T.S.K., S.V., A.R.G., y A.B; Investigación: S.V., T.S.K., y A.R.G.; Análisis formal: S.V., y T.S.K. ; Curación de Datos: T.S.K.; Visualización: T.S.K, y S.V., Writing (Original Draft): S.V., y T.S.K.; Escritura (Revisión, Edición): R.H., S.V. y T.S.K.; y Adquisición de Fondos: R.H.

1. Preparación de Saccharomyces cerevisiae para el ensayo DAmFRET
<ol><li>Transforme cepas de levadura experimentalmente relevantes con un plásmido inducible en galactosa de 2o que exprese la proteína de interés8 etiquetada en la terminal C o N con mEos3.1 utilizando un protocolo estándar de acetato de litio12 .</li>
	<li>Cultivar la levadura en el cultivo líquido.<ol>
<li>Para cada proteína de consulta, inocular colonias de levadura (transformadas), en triplicado, cada una en 200 éL de medios de crecimiento no inductores apropiados (es decir, medios que contengan 2% de dextrosa, base de nitrógeno de levadura y aminoácidos para la selección del plásmido) en una placa de 96 pocillos ( Figura 1C).</li>
		<li>Incubar las células mientras se agita en un agitador de placas (ver la Tabla de Materiales)con órbita de 1,5 mm a 1200 rpm a 30 oC durante 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inducir la expresión del gen de interés (protocolo representativo para 16 h-algunas proteínas pueden tomar más o menos tiempo).<ol>
<li>Después de 16 h de inducción, gire la placa a 2200 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT0 para peletizar las muestras.</li>
		<li>Retire los medios por inversión contundente. Resuspender las células con 200 ml de medios de inducción apropiados (es decir, medios que contengan 2% de galactosa, base de nitrógeno de levadura y aminoácidos para la selección del plásmido). Vea la figura 1C.</li>
		<li>Incubar las células mientras se agita a 30oC durante 12 h.</li>
		<li>Centrífuga (ver la Tabla de Materiales)la placa a 2200 x g durante 2 min a RT para peletizar las muestras. Retire los medios por inversión contundente. Resuspenda las células con 200 s de los medios de inducción.</li>
		<li>Incubar las células mientras se agita a 1200 rpm a 30 oC durante 4 h más. Esta resuspensión en medios frescos debe ocurrir 4 horas antes de ejecutar DAmFRET, con el fin de reducir la autofluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Creación de plásmido mamífero
<ol><li>Construir un vector de mamíferos que tenga un promotor constitutivo y mEos3.1 con un marcador de posición para insertar el gen de interés y un vinculador entre ellos. NOTA: Construimos un vector compatible con golden gate, M1, a partir de un plásmido disponible públicamente (ver la Tabla de Materiales)con las siguientes modificaciones: un sitio BsaI existente fue eliminado por una mutación de punto G a A (en la posición 3719 según el depositado secuencia). mEos3.1 se obtuvo utilizando mutagénesis dirigida por el sitio del fluoróforo en I157V. Los sitios BsaI invertidos seguidos de un vinculador 4x (EAAAR) se insertaron, por ensamblaje Gibson, en fotograma entre el promotor CMV y mEos3.1 para producir el vector M1 final. La expresión proteica es impulsada por el potenciador y promotor del CMV; y terminación de transcripción por señal de poliadenilación SV40.</li>
	<li>Cree una biblioteca de inserciones, compatible con el vector construido. NOTA: Ordenamos nuestras inserciones para el montaje de Golden Gate como fragmentos lineales sintéticos (ver tabla de materiales) flanqueados por sitios BsaI para ligadura en M1 entre el promotor CMV y 4x(EAAAR)-mEos3.1.</li>
</ol>3. Cultivo celular de mamíferos y transfección
<ol><li>Cultivo de células HEK293T en DMEM + 10% FBS + 1x medios PenStrep a 37oC a 5% CO2.</li>
	<li>El día anterior a la transfección, semilla 5 x 105 células en una placa de 6 pocillos con 2 ml de medios.</li>
	<li>Células transfectadas con 2 g de ADN plásmido utilizando un reactivo de transfección (ver la Tabla de Materiales)en una proporción de 3:1 (reactivo de transfección:DNA). Mezclar los componentes en 150 l de medios séricos reducidos (ver la Tabla de Materiales)e incubarlos a RT durante 15 min, añadir la mezcla a cada pocal e incubar durante 48 h para la expresión de proteínas.</li>
	<li>Confirmar la expresión proteica después de 24 h por microscopía de epifluorescencia (488 nm excitación, 515 nm de emisión).</li>
</ol>4. Preparación de células de mamíferos para el ensayo DAmFRET
<ol><li>Después de 48 h de expresión proteica, retire los medios de cada poca y lave cuidadosamente las células con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de 37 oC (PBS). Después del lavado, aspirar el PBS.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml de ácido trypsin-etilendiaminatetraacético (EDTA) (0,25%) e incubar durante 5 min a 37oC.</li>
	<li>Agregue 0,5 ml de medios DMEM completos a cada poca, resuspenda las celdas y asegúrese de que no haya grumos grandes visibles.</li>
	<li>Transfiera todo el volumen de cada pozo en tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Células de giro durante 5 min a 1000 x g a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de PBS + 10 mM EDTA.</li>
	<li>Gire las células durante 5 min a 1000 x g en RT.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml 4% de paraformaldehído (PFA) + 10 mM EDTA en PBS.</li>
	<li>Fijar celdas durante 5 minutos en una mesa de agitación con movimiento constante.</li>
	<li>Células de giro durante 5 min a 1000 x g en RT.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de PBS + 10 mM EDTA.</li>
	<li>Células de giro durante 5 min a 1000 x g en RT.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el volumen adecuado de tampón para la ejecución de la citometría (para 1 pozo de un uso de placa de 96 pocillos 200 ol de PBS + 10 mM EDTA).</li>
	<li>Transfiera las células resuspendidas a un pozo de una placa redonda inferior de 96 pocillos.</li>
</ol>5. Fotoconversión de levaduras y células de mamíferos para el ensayo
<ol><li>Muestras de fotoconversión en una microplaca sin cubierta utilizando una lámpara UV (ver la Tabla de Materiales)equipada con un filtro de 320-500 nm (violeta) y un colimador de haz, situado 45 cm por encima de la placa, durante una duración de 25 minutos mientras se agita. Estas condiciones son apropiadas cuando la potencia del haz enla placa es de 11,25 mW/cm 2, con aproximadamente 17.000 mJ/cm2 de la dosis total de fotones8.</li>
</ol>6. Recopilación de datos DAmFRET
<ol><li>Ensayo de células utilizando un catómetro con láseres no colineales 488/561. Los siguientes datos son los requisitos mínimos para el cálculo de FRET.<ol>
<li>Utilice un canal de emisión de 488 nm excitación/ 515 nm para la recolección de la fluorescencia del donante.</li>
		<li>Utilice un canal de emisión de 488 nm de excitación/595 nm para la recogida de la fluorescencia de la señal FRET.</li>
		<li>Utilice un canal de emisión de 561 nm de excitación/595 nm (no colineal con el canal 488/595) para la recolección de la fluorescencia del aceptador.</li>
		<li>Utilice un canal de emisión de 405 nm de excitación/ 457 nm para la recogida de autofluorescencia8.</li>
		<li>Utilice un canal de imagen de campo brillante para el cálculo del volumen. NOTA:Los ajustes del citómetro de imagen para S. cerevisiae son los siguientes: objetivo de 60x a bajo caudal y alta sensibilidad; Potencias láser establecidas en 405 nm a 15 mW, 488 nm a 15 mW, 561 nm a 20 mW.Los ajustes del citómetro de imagen para las células HEK293T son los siguientes: objetivo 40x a bajo caudal y alta sensibilidad; Potencias láser establecidas en 405 nm a 15 mW, 488 nm a 15 mW, 561 nm a 20 mW.También tenga en cuenta que, nuestro citómetro de imagen fue diseñado a medida para tener láseres separados espacialmente 488 nm y 561 nm (es decir, en diferentes cámaras) con el fin de obtener una resolución clara de FRET de los oratos fluorescenscen sin validez Ce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recopile datos de 20.000-50.000 células individuales por muestra dentro de una compuerta positiva de fluorescencia.<ol>
<li>Compuerta las células individuales por una alta relación de aspecto y un área de celda pequeña en lugar de celdas agrupadas o escombros que tendrían una relación de aspecto baja y áreas celulares grandes o muy pequeñas respectivamente. NOTA: Los parámetros equivalentes en un citómetro sin imágenes son FSC (dispersión hacia adelante) para el tamaño aproximado de la celda y SSC (dispersión lateral) para la granularidad celular. Además, utilice la altura del pulso FSC frente al ancho del pulso como proxy para el gating de una sola célula. Además, es crucial no recopilar eventos que tengan valores de fluorescencia más allá del límite superior de sensibilidad del citómetro. En nuestro catómetro de imágenes, restringimos la recopilación de eventos a un valor de píxel máximo sin procesar de uno inferior al límite de saturación para cada canal fluorescente que recopilamos. Del mismo modo, para los citometros de flujo convencionales, no se deben analizar los puntos de datos en el contenedor de mayor intensidad (que incluye eventos que están más allá del rango dinámico de detección).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Realizar la compensación utilizando una muestra mEos3.1 no fotoconvertida para la señal de donante pura y DsRed2 monomérica, que tiene un espectro similar a la forma roja de mEos3.1, para la señal de aceptación pura13. Para obtener más sensibilidad, asegúrese de que el canal del detector FRET también se considere como un objetivo de contagio, en el programa de análisis.</li>
	<li>Muestras de compuerta para seleccionar solo células individuales que son positivas para la fluorescencia (como en la Figura2).</li>
	<li>Calcule el parámetro AmFRET como la relación entre la señal FRET total (488ex/595em) dividida por la señal total del aceptador FRET (561ex/595em).</li>
	<li>Visualice los datos mediante un software de citometría de flujo (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Las concentraciones citosólicas de S. cerevisiae en este estudio se calcularon con los ajustes siguientes como en Khan et al.8. El análisis de datos se realizó utilizando el software de citometría de flujo (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol><li>Krissinel, E., Henrick, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+macromolecular+assemblies+from+crystalline+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inference of macromolecular assemblies from crystalline state.</a> Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).</li>
<li>Kühner, S., van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+organization+in+a+genome-reduced+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteome organization in a genome-reduced bacterium.</a> Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).</li>
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<li>Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+basis+of+how+prion+conformations+determine+strain+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes.</a> Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).</li>
<li>Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+calculus+of+protein+filament+formation+under+spatial+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22New+journal+of+physics%22%5BJournal%5D)">Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement.</a> New journal of physics. , (2018).</li>
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<li>Cai, X., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Lu, A., Magupalli, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Zhang, M., Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+true+monomeric+and+bright+photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).</li>
<li>Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425(1992).</li>
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<li>Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+homo-heptamer+thermodynamics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+entropy-driven+assembly+of+co-chaperonin+protein+10%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10.</a> Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses en competencia.

DAmFRET es el método más completo para detectar el autoensamblaje de proteínas in vivo. DAmFRET combina la lectura directa de las interacciones homotípicas proteínas-proteínas en una amplia gama de concentración, con resolución de una sola célula y alto rendimiento. La lectura directa de DAmFRET y el hecho de que las proteínas fusionadas no requieren una localización subcelular específica o un estado insoluble elimina los falsos positivos y extiende su aplicabilidad a una amplia gama de proteínas en sus ubicaciones subcelulares nativas. En particular, al etiquetar los orgáyos con fluoróforos que son espectralmente compatibles con mEos3.1, como T-Sapphire y mCardinal, la localización subcelular de formas solubles y ensambladas de proteínas se puede determinar junto con DAmFRET.
Usando el citómetro de flujo de imágenes como se describe aquí, se necesitan 8 horas para analizar una placa de 96 pocillos con aproximadamente 20.000 células cerradas por pozo. Sin embargo, también realizamos rutinariamente DAmFRET con citometros estándar (sin imagen) que logran un rendimiento mucho mayor (hasta 20 muestras por minuto). De hecho, cualquier citómetro de flujo con láseres de 488 y 561 nm separados espacialmente que esté libre de artefactos de amplificador de registro y tenga los PMT y filtros adecuados para detectar señales de donante, FRET y aceptadores es suficiente para realizar DAmFRET. En la actualidad, esta ganancia en el rendimiento viene a expensas de la información de localización y la determinación del volumen, de modo que el autoensamblaje debe analizarse en función de la expresión de proteínas en lugar de la concentración. Esto no es un problema para los análisis cualitativos. Además, puede ser posible estimar el volumen citosólico fusionando un fluoróforo espectralmente distinto a una proteína endógena de "mantenimiento" cuya expresión se correlaciona estrechamente con el volumen citosólico.
Como hemos demostrado a través de nuestro despliegue de DAmFRET tanto en células de levadura como de mamíferos, DAmFRET se puede adaptar fácilmente a diferentes sistemas de expresión. Esto permite estudiar el autoensamblaje de proteínas en sus contextos celulares nativos. Además, ofrece la capacidad de comparar el ensamblaje de proteínas a través de modelos de cultivo celular ampliamente divergentes para estudiar la conservación de los mecanismos que rigen el autoensamblaje de proteínas.

Los ensayos para estudiar las interacciones homotípicas de las proteínas, o "autoensamblaje" son importantes porque el estado oligomérico y la solubilidad de las proteínas dictan su función. El proteome abunda con homo-multimers1,2,3,4, mientras que relativamente pocas proteínas funcionan como monómeros. Las proteínas también pueden ensamblar aberrantemente debido al estrés, la edad o la mala regulación, lo que conduce a cambios patológicos en la actividad. Identificar los factores que modulan tales eventos, o incluso la naturaleza física de las asambleas, a menudo es excepcionalmente difícil.
Un número creciente de proteínas ahora se reconoce a la autoensamblación con una cooperatividad extraordinaria y estaquiometría indeterminada, lo que resulta en su desmezcla de otros componentes celulares, como fases densas de proteínas. Estos toman la forma de condensados desordenados, como gotas y geles, o filamentos altamente ordenados, como fibras amiloideas. Las fluctuaciones de conformación asociadas a este último hacen su formación inicial, onucleación, inherentemente probabilística en el nivel molecular 5,6. Debido a que la probabilidad de escalas de nucleación con volumen, la formación de tales conjuntos puede ser altamente estocástico en los confines espaciales de las células vivas7,8. En el extremo de la separación de fase limitada por nucleación estocástica hay priones, conjuntos de proteínas altamente ordenados que rara vez se nuclean espontáneamente, pero una vez formados, plantillas su propio crecimiento indefinidamente. Una de estas proteínas, conocida como ASC, ejecuta un interruptor digital similar a un prión en la actividad de las células inmunitarias innatas de los mamíferos. El autoensamblaje de ASC se nucleiza por su interacción con proteínas específicas que se han oligomerizado sobre patrones moleculares asociados al tipo patógeno o peligro de unión. Los conjuntos ASC a su vez nucleanan a procaspase-1 para autoensamblar y activar, dando lugara la maduración de la citoquina y la piroptosis de la célula 9,10. La región de ASC responsable de su asamblea pertenece a la superfamilia del dominio de la muerte, que consiste en más de cien miembros en el proteome humano. A pesar de las funciones fundamentales de los dominios de la muerte en inmunidad innata y la muerte celular programada, la mayoría de ellos aún no se han caracterizado con respecto al autoensamblaje. El descubrimiento y caracterización de proteínas adicionales con este comportamiento se verá muy facilitado por una lectura directa de una sola célula del autoensamblaje de proteínas.
Los enfoques clásicos de bioquímica de proteínas para estudiar el autoensamblaje de proteínas, como la cromatografía de exclusión de tamaño y la ultracentrifugación, se limitan en gran medida a las evaluaciones a nivel de población. Sin embargo, la heterogeneidad de célula a célula resultante de transiciones de fase limitadas por nucleación no se puede modelar con este nivel de detalle. Los enfoques de una sola célula basados en la microscopía de fluorescencia recuperan esta capacidad, pero carecen del rendimiento necesario para cuantificar con precisión la nucleación o para detectar ensamblajes raros. Además, los autoensamblajes solubles, como la mayoría de las enzimas y los oligómeros preamiloide, son demasiado pequeños y móviles para ser resueltos por microscopía de luz estándar. Pueden ser detectados por enfoques más sofisticados como la espectroscopia de correlación de fluorescencia, pero estos son muy limitados en número de células y rendimiento.
Los ensayos basados en proximidad del ensamblaje de proteínas, como el FRET y la complementación de fluoróforos divididos, ofrecen una solución potencial a estos problemas. Sin embargo, generalmente requieren el uso de dos construcciones diferentes que expresan la proteína de interés fusionada con etiquetas complementarias: los fluoróforos del donante y del aceptador en el caso de FRET. Esto compromete el rendimiento experimental y también reduce la sensibilidad debido a la variación de célula a célula en los niveles relativos de donante y aceptador. Para evitar esto, diseñamos un ensayo que emplea un fluoróforo fotoconvertible, mEos3.111, que permite que una sola construcción exprese proteínas etiquetadas con donantes y aceptadores. El espectro de emisión de mEos3.1 (donante similar a la GFP) se superpone suficientemente con el espectro de excitación de mEos3.1 fotoconfizada (aceptador similar al rojo) para permitir que se produzca EL FRET cuando las moléculas están muy cerca (<10 nm). Por lo tanto, al exponer las células a una dosis empíricamente determinada de 405 nm de luz, que fotoconvierte una fracción óptima de mEos3.1 total en la forma de aceptador, logramos niveles relativos consistentes y reproducibles de donante y aceptador a través de múltiples muestras, niveles de expresión y experimentos. Medimos la fluorescencia del aceptador cuando se excita directamente con 561 nm de luz, o indirectamente (por transferencia de energía del donante) con 488 nm de luz (es decir, emisión sensificada FRET). Reportamos el ensamblaje de proteínas como la relación de estos dos valores y lo denominamos FRET anfífrico o AmFRET.
Para calcular la concentración de proteínas por citometría de flujo, primero calculamos la intensidad media de fluorescencia de Spc42 etiquetada con mEos3.1. Debido a que las células de levadura contienen aproximadamente 1000 moléculas de Spc42, luego calculamos la intensidad de fluorescencia de una sola molécula fluorescente verde mEos3.1. Al aprovechar la fotoconversión uniforme en todas las concentraciones celulares (Figura1E),correlacionamos los valores totales de fluorescencia mEos3.1 para todas las intensidades de los aceptadores después de la fotoconversión. A continuación, podemos dividir el número total de lunares de proteínas fluorescentes por el volumen citosólico aproximado (según se determine mediante citometría de flujo de imagen) para obtener la concentración citosólica total de la proteína de interés. Para cálculos exactos, consulte el manuscrito original8.
Al expresar la proteína fusionada mEos3.1 de un plásmido de 2o en levadura, sondeamos un rango de aproximadamente mil veces de concentración de proteínas en cada muestra8. Logramos lo mismo en las células HEK293T en virtud de la variación en la admisión de plásmidos durante la transfección y, por lo tanto, el número de copia variable.
La distribución resultante de AmFRET, o DAmFRET, para muchos miles de células revela la concentración-dependencia del autoensamblaje en el citosol para cualquier proteína de interés. En general, DAmFRET representa una metodología propanzante para descubrir y caracterizar el autoensamblaje de proteínas con una combinación sin precedentes de sensibilidad, rendimiento y reproducibilidad.
Si bien el uso de un catómetro de imágenes nos permite obtener mediciones de concentración de proteínas in vivo, estos citometros aún no están disponibles en la mayoría de las instituciones de investigación. Sin embargo, DAmFRET se puede ejecutar incluso en un catómetro típico sin imágenes para obtener distribuciones del ensamblaje de proteínas en el rango de expresión proteica.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Axygen</td><td>P96-450R-C-S</td><td></td></tr><tr><td>ASC 2-92 (plásmido de mamíferos)</td><td></td><td>rhm1.0095</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>ASC 2-92 (R41E) (plásmido de mamíferos)</td><td></td><td>rhm1.0096</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>ASC 2-92 (R41E) (plásmido de levadura)</td><td></td><td>rhx2432</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>ASC 2-92 (plásmido de levadura)</td><td></td><td>rhx2431</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>"centrífuga" en texto</td></tr><tr><td>CSM -Ura</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1004-100</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>EMD Millipore</td><td>DX0145-5</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td>DeNovo</td><td>FCS Express 6 Flow</td><td>"software de citometría de flujo" en texto</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VWR Life Science</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BioRad</td><td>ZE5</td><td>Citómetro de flujo sin imagen</td></tr><tr><td>FUGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>"reactivo de transfección" en texto</td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>VWR Life Science</td><td>0637-500g</td><td></td></tr><tr><td>HSPE1 ( plásmido de levadura)</td><td></td><td>rhx1531</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo de imagen</td><td>EMD Millipore</td><td>ImageStream X Mark II</td><td>"citómetro de flujo de imagen" en texto</td></tr><tr><td>Células de</td><td></td> mamífero <td></td> HEK293T <td></td></tr><tr><td>mEos3.1 (plásmido de mamíferos)</td><td></td><td>rhm1</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>mEos3.1 (plásmido de levadura)</td><td></td><td>rhx0935</td><td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>optiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>"medios de suero reducidos" en texto</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR Life Science</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de fotoconversión</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido #54525</td><td>Addgene</td><td>#54525</td><td>"plásmido disponible públicamente" en el texto</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Agitador de placas</td><td>Heidolph Instruments</td><td>1000</td><td>"agitador de placas" en el texto</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Cepa</td><td></td> de levadura <td>rhy1713</td><td>Disponible bajo pedido- S288c (MAT&alpha; lyp1&Delta; can1&Delta;::STE2pr_SpHIS5 his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 ura3 y Delta; 0 met15 y Delta; 0 cln3 y Delta; 0::GAL1pr_WHI5_hphMX)</td></tr></tbody></table>

detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en vivo por citometría de flujo

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

El autoensamblaje de proteínas rige la función proteica y compartiliza los procesos celulares en el espacio y el tiempo. Los métodos actuales para estudiarlo sufren de baja sensibilidad, lecturas indirectas, rendimiento limitado y/o nivel de población en lugar de resolución de una sola célula. Diseñamos una metodología única basada en citometría de flujo que aborda todas estas limitaciones: FRET amphfluoric distribuido o DAmFRET. DAmFRET detecta y cuantifica los autoensamblajes de proteínas mediante emisión sensibilizada FRET in vivo, permite el despliegue en sistemas modelo, desde la levadura hasta las células humanas, y logra lecturas sensibles, de una sola célula y de alto rendimiento, independientemente de la proteína localización o solubilidad.

Detección de oligómeros que no forman puncta
Anteriormente hemos aplicado DAmFRET para la caracterización de la separación de fase proteica, lo que normalmente resulta en la formación de grandes conjuntos de proteínas que también pueden ser detectados por microscopía de fluorescencia. Para demostrar la aplicabilidad de DAmFRET a los conjuntos de proteínas limitadas por difracción, analizamos una proteína bioquímicamente bien caracterizada que forma homo-heptameros discretos que son demasiado pequeños para ser visualizados por microscopía de luz: el humano co-chaperonina, HSPE114. Comparamos los perfiles DAmFRET de células de levadura que expresan mEos3.1 solo, o HSPE1-mEos3.1. El segundo exhibió valores uniformes positivos de AmFRET, mientras que el primero exhibió amFRET insignificante (figura3A). Las imágenes de las células adquiridas por el citómetro de flujo de imágenes (véase la Tabla de Materiales)revelaron fluorescencia difusa en todas las células de expresión de canales-donante, FRET y aceptador, tanto para las células mEos3.1- como para las células que expresan HSPE1-mEos3.1 (Figura3B). Para confirmar este hallazgo con una resolución óptica más alta, utilizamos la microscopía confocal para capturar pilas z para múltiples campos de células. De hecho, la fluorescencia se distribuyó uniformemente por todo el citosol, sin puncta detectable, ya sea que las células expresaran HSPE1-mEos3.1 o el fluoróforo solo (Figura3C). Tenga en cuenta que el Kd caracterizado de HSPE1 es alrededor de 3 M que está ligeramente por debajo de la sensibilidad de nuestro sistema, y por lo tanto no observamos la relación sigmoidal de FRET con la concentración que se esperaría para este homo-oligomero discreto. Sin embargo, llegamos a la conclusión de que DAmFRET detecta robustamente la homo-oligomerización soluble in vivo a una sola célula.
Detección de ensamblajes limitados por nucleación
Para mostrar la capacidad de DAmFRET para distinguir homo-oligomeros discretos de los conjuntos limitados de nucleación como priones, analizamos la proteína inflammasome humana ASC. Mientras que WT ASCPYD forma filamentos in vivo, el inactivo r41E mutante de ASCPYD no hace9,10. Expresamos en células de levadura mEos3.1 solo, o mEos3.1 fusionado a WT o R41E ASCPYD. Las células de levadura que expresan el fluoróforo solo o la forma mutante de ASCPYD mostraron AmFRET insignificante en todo el rango de concentración, lo que indica una incapacidad para autointeractuar. Por el contrario, WT ASCPYD exhibió un perfil DAmFRET con dos poblaciones: una con AmFRET insignificante y la otra con amFRET alto (figura4A). Como confirman las imágenes de fluorescencia (Figura4B),estas poblaciones representan células que contienen sólo proteínasoluble o en su lugar contienen principalmente proteína autoensamblada, respectivamente. La relación discontinua entre las poblaciones, y el hecho de que se producen a concentraciones superpuestas indica que una barrera de nucleación estabiliza la forma monomérica de la proteína y puede evitar que se ensamble durante la duración del experimento 8. La brecha en AmFRET entre las dos poblaciones indica que, una vez que se produce la nucleación, plantillas casi instantáneamente a otros monómeros a la forma ensamblada y alcanza un nuevo nivel de estado estacionario de AmFRET. DAmFRET corroboró datos estructurales anteriores de que el mutante de punto ASCPYD R41E interrumpió la nucleación a través de las concentraciones alcanzables por este sistema de expresión (Figura4A).
Aplicabilidad de DAmFRET en células de mamíferos
Aunque las células de levadura son células huésped ideales para DAmFRET, deseamos extender la aplicabilidad de DAmFRET a células de mamíferos. Para evitar la muerte celular causada por polímeros ASC funcionales, probamos DAmFRET en células HEK293T que carecen de expresión de caspasa-1. Expresamos las mismas proteínas en las células HEK293T que en las células de levadura en la Figura 4A. Los perfiles DAmFRET resultantes en células HEK293T se asemejan cualitativamente a los de las células de levadura (Figuras4A,C). DAmFRET, por lo tanto, sirve como el método in vivo más versátil para detectar y cuantificar autoensamblajes de proteínas nucleadas a resolución de una sola célula con alto rendimiento, independientemente de la presencia de puncta microscópicamente visible, así como el tipo de célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig1.jpg"> Figura 1 : Visión general del diseño experimental para S. cerevisiae. Esta figura ha sido adaptada de Khan et al.8 con permiso. (A) mapa plásmido de 2o que muestra el marco de lectura abierto para la proteína de interés, etiquetado con mEos3.1 fotoconvertible e impulsado por un promotor inducible. (B) Cuando se transforma en células de levadura, el sistema de replicación de 2o conduce a una alta variabilidad del número de copia entre las células. Esa variación, combinada con el ruido transcripcional del promotor GAL1, da como resultado una amplia distribución de la expresión proteica en una población de células. (C) Resumen experimental del ensayo DAmFRET de levadura. Para asegurar células sanas para el ensayo, las colonias se inoculan primero para la proliferación de más de 16 h en medios sintéticos que contienen la fuente de carbono no inductora, la dextrosa. Después de la proliferación, las células se transfieren a medios sintéticos que contienen la fuente de carbono inductora, galactosa, durante 16 h. Después de la inducción, las células se fotoconvierten parcial y uniformemente por exposición a 405 nm de luz. (D) A continuación, las muestras se analizan mediante citometría de flujo de imágenes. Los espectros e intensidades de mEos3.1 verde y rojo los hacen adecuados para un donante y un aceptor fret, respectivamente. Cuando están cerca unas de otras, como ocurre en el polímero representado en la célula inferior, las moléculas rojas fluorescencia tras la excitación de moléculas verdes (FRET). (E) Gráfica de intensidades de donante frente a aceptadores que muestran una estrecha relación lineal tras la fotoconversión, lo que muestra que la eficiencia de la fotoconversión no está influenciada por el nivel de expresión. (F) Gráfico de dispersión de las intensidades medias del aceptador frente a los donantes de las poblaciones de células que expresan una variedad de proteínas etiquetadas por mEos, tanto en formas solubles como amiloideas, que muestran que la eficiencia de la fotoconversión no está influenciada por la fusión pareja o solubilidad (las barras de error indican la desviación estándar de los triplicados biológicos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig2.jpg"> Figura 2 : Estrategia de gating DAmFRET para datos de citometría de flujo de imágenes. Estrategia de gating utilizada para analizar sólo células individuales enfocadas y sin descomponer que tienen baja autofluorescencia y expresan la proteína fluorescente. (A) Jerarquía de puertas para obtener células individuales bien enfocadas, vivas y para su análisis. (B) Histograma del gradiente RMS del canal de campo brillante. Esta medición permite la selección de células que están correctamente enfocadas bajo la luz transmitida. (C) Gráfica de densidad de circularidad frente a área que muestra la población cerrada de células únicas esféricas sin mover. (D) Gráfica de densidad que muestra la intensidad de la autofluorescencia (Ch07) frente a la fluorescencia del donante (Ch02) que muestra poblaciones separadas de células expressing (cerradas) y células oscuras. (E) Gráfico de dispersión de las intensidades del donante frente a los del aceptador que muestra una pérdida clara de fluorescencia del donante en un subconjunto de células, resultante de la FRET entre los fluoróforos del donante y del aceptador. (F) Gráfica final de DAmFRET. Las células que contienen proteína no ensamblada se centran alrededor de cero AmFRET, mientras que las células que contienen proteína autoensamblada presentan un valor de AmFRET positivo. Dos poblaciones superpuestas en la parcela son indicativas de una barrera finita para nucleating esa proteína en conjuntos de orden superior como amiloides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig3.jpg"> Figura 3 : Datos representativos de proteínas monoméricas y heptéricas por citometría de flujo y microscopía. (A) Perfil DAmFRET de proteína monomérica mEos3.1 (izquierda) e HSPE1 heptérico etiquetado con mEos3.1 (derecha) que muestra el aumento de ratiometric FRET resultante del ensamblaje homotípico. (B) Imágenes del citómetro, de células que expresan mEos3.1 (izquierda) y HSPE1 (derecha) mostradas en todos los canales capturados. (C) Imágenes representativas de células de levadura que expresan mEos3.1 monomérico3.1 (izquierda) y HSPE1 (derecha). Las imágenes son proyecciones de suma de sectores confocales. Al menos cincuenta células fueron imágenes para corroborar esta observación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59577/59577fig4.jpg"> Figura 4 : Los perfiles DAmFRET muestran un comportamiento de autoensamblaje similar de ASCPYD humano proteína en Células S. cerevisiae y HEK293T. (A) Gráficas de densidad que muestren AmFRET frente a la concentración citosólica (en mM) de mEos3.1 (izquierda), o mEos3.1 fusionada a WT (centro) o mutante moninamizante de ASCPYD (derecha) en S. cerevisiae. (B) Imágenes del citómetro, de celdas de las puertas inferior y superior (paneles izquierdo y central, respectivamente) que expresan WT ASCPYD; y de las células que expresan ASCPYD R41E de la puerta indicada (panel derecho). (C) Gráficas de densidad que muestran AmFRET versus intensidad de aceptación para la misma serie de proteínas que en (A) pero expresada en células HEK293T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59577/59577fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Comprender la base física del autoensamble de proteínas en las células está limitado por la falta de herramientas adecuadas. Los métodos actuales sufren de baja sensibilidad, lecturas indirectas, rendimiento limitado y/o resolución a nivel de población. Por el contrario, nuestro ensayo detecta y cuantifica la propensión de una proteína para el autoensamble in vivo con una lectura sensible, de una sola célula y de alto rendimiento, independientemente de la localización o solubilidad de proteínas.Al probar por primera vez el ensayo, obtener la conversión de la foto correcta puede requerir algunas pruebas empíricas para obtener condiciones óptimas para lograr una buena lectura en toda la placa. La sensibilidad del ensayo también podría verse comprometida si el citómetro no tiene filtros de detección separados para las señales FRET y acceptor. Demostrando el procedimiento conmigo estará Andrew Box, el gerente de laboratorio del núcleo de citometría.Para preparar un cultivo de levadura para DAmFRET, para cada proteína de consulta, inocular las colonias de levadura transformadas en triplicado en 200 microlitros de un medio de crecimiento no inductivo apropiado en pozos individuales de una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pozos. Incubar las células de levadura con temblores con una órbita de 1,5 milímetros a 1.200 rotaciones por minuto a 30 grados centígrados durante 16 horas. Al final de la incubación, sedimentar las células de levadura por centrifugación y eliminar los sobrenadantes por inversión contundente.Añadir 200 microlitros de un medio de inducción adecuado y devolver las células a la incubadora de agitación durante otras 12 horas. Al final de la incubación, sedimentar las células de levadura por centrifugación e inversión contundente, luego añadir 200 microlitros de medio de inducción fresco. Luego incubar las células con agitación durante cuatro horas adicionales para reducir la autofluorescencia.Para convertir fotos las muestras, coloque la placa sin la cubierta debajo de una lámpara ultravioleta equipada con un filtro de 320 a 500 nanómetros y un colimador de haz situado 45 centímetros por encima de la placa. Encienda la lámpara para convertir fotos las celdas durante 25 minutos con agitación. Para la recopilación de datos DAmFRET, cargue las células convertidas con foto en un citómetro de flujo de imágenes con láseres de nanómetros 488 y 561 no colineales y puerta cuatro células sin presupuestar individuales por alta circularidad y un área de células pequeñas.Luego recopile datos de dos a cinco veces 10 a las cuatro celdas individuales por muestra dentro de una puerta positiva de fluorescencia. Al final del análisis, utilice una muestra mEos3.1 no convertida en foto para la señal de donante puro y DsRed monomérico dos para la señal de aceptador puro para establecer la compensación. Para una mayor sensibilidad, asegúrese de que el canal del detector FRET también se considera como el objetivo de contagio en el programa de análisis.Calcule el parámetro AmFRET como la relación de la señal FRET total dividida por la señal total del aceptador FRET. Los perfiles AmFRET de células de levadura que expresan proteína fluorescente por sí solos exhiben AmFRET insignificante, mientras que las células de levadura que expresan como homooligomero estable fusionados a la proteína fluorescente demuestran valores positivos uniformes de AmFRET. Las imágenes de las células adquiridas por la citometría de flujo de imágenes revelan una fluorescencia difusa en todos los canales.La microscopía confocal de pilas Z para múltiples campos de células muestra una distribución uniforme de la fluorescencia a través del citosol de cada célula sin puncta detectable. Las células de levadura que expresan el fluoróforo solo o el fluoróforo más la forma mutante de una proteína inflammasoma humana exhiben AmFRET insignificante en todo el rango de concentración que indica una incapacidad para autointertravirse. Por el contrario, la proteína inflammasoma de tipo salvaje demuestra un perfil DAmFRET con una población AmFRET insignificante y una alta población de AmFRET.Tenga en cuenta que la proteína inflammasoma de tipo salvaje resiste el autoensamblaje incluso a altas concentraciones con el cambio de proteína a la forma autoensamblada en sólo una fracción de las células. Esto es una clara indicación de la existencia de una barrera de nucleación para el autoensamble. Como confirman las imágenes por fluorescencia, estas poblaciones representan células que contienen proteínas solubles solamente o en su mayoría proteínas autoensambladas respectivamente.De hecho, DAmFRET corrobora los datos estructurales previos que el mutante de punto en el inflammasome interrumpe la nucleación a través de las concentraciones alcanzables por este sistema de expresión. Tenga en cuenta que los perfiles de expresión de proteínas en células de mamíferos que carecen de expresión de Caspase-1 se asemejan a los observados en las células de levadura. El paso más importante a recordar es la conversión de fotos.Otros pasos cruciales incluyen la recopilación de un número suficiente de eventos que no están saturados para la señal de fluorescencia y obtener la compensación correcta. El seguimiento del ensayo con la bioquímica adecuada, la mutagénesis racional y los enfoques de biología estructural pueden ayudar a dilucidar completamente el mecanismo del autoensamble.

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Investigación

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Biología

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Aprende a detectar y cuantificar el autoensamblaje de proteínas in vivo mediante citometría de flujo DAmFRET con resolución de célula única. Este método de alto rendimiento permite estudiar barreras de nucleación en diversos organismos modelo.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

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