El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

El objetivo general de este procedimiento es mapear los sitios de interacción de ACAP LBC con PDE cuatro D tres. Midiendo la intensidad media de fluorescencia de biomolecular, fluorescencia, complementación o BC mediante citometría de flujo. Para ello, las células se transfectan con ACAP LBC y PDE cuatro fragmentos D tres fusionados a la porción terminal N o C de la proteína reportera fluorescente.

A continuación, se realiza la citometría de flujo de Venus para evaluar la fluorescencia, si los fragmentos de proteína interactúan con Venus se completa y la fluorescencia. Si los fragmentos de proteína no interactúan, no se detecta fluorescencia. Se realizan análisis de sangre occidentales complementarios para determinar los niveles relativos de expresión de proteínas.

A continuación, se calcula la fuerza de las interacciones proteína-proteína normalizando la intensidad de fluorescencia media de YFP con los niveles de expresión de proteínas. Los datos resultantes indican que la unión de PDE 43 a ACAP LBC está mediada por múltiples regiones dentro de PDE 43, principalmente a través de la región conservada aguas arriba o UCR uno. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos ya existentes como la coinmunoprecipitación y la BP C al microscopio son que es relativamente sencilla, es sensible y facilita el cribado rápido de un gran número de células.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína, también se puede utilizar para detectar factores que regulan las interacciones proteína-proteína para el descubrimiento de fármacos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es necesario determinar una respuesta B lineal. Una expresión de constructo debe ser similar para que el resultado del uso de diferentes fragmentos de proteínas se pueda comparar entre sí.

En los experimentos descritos aquí, las células se transfectan con un fragmento terminal N del derivado YFP, Venus fusionado a ACAP LBC de longitud completa y el fragmento terminal C de Venus se fusiona con uno de los siguientes PDE E 43 de longitud completa, la región conservada aguas arriba UCR uno de PDE E 43 o la región conservada aguas arriba dos más la región catalítica UCR R dos más CAT de PDE 43 el día antes de la transfección en Seis. Pues bien, las placas de cultivo de tejidos siembran 1,2 veces 10 al quinto HEC 2 9 3 células T por pocillo en dos mililitros de crecimiento completo. Semilla mediana, tres pocillos control más tres pocillos para cada uno de los ensayos.

Cotran incuba al 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, prepárese para la transfección de las construcciones de ADN plasmático BC y el vector CFP, que se transfecta con construcciones BS C como marcador. Para cada condición, agregue la cantidad adecuada de ADN a 250 microlitros de medio libre de suero Optum M1.

En un tubo estéril, un tubo es suficiente para transfectar tres pocillos. A continuación, añada tres microlitros de tránsito LT, un reactivo por cada microgramo a la mezcla de ADN diluida y pipetee suavemente para mezclar, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación a 250 microlitros de mezcla de transfección gota a gota a las células, luego incube al 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius, 24 horas.

Fluorescencia de verificación posterior a la transfección bajo un microscopio de epifluorescencia, las células deben expresar fluorescencia amarilla para la señal BC y fluorescencia CFP para informar la eficiencia de la transfección. Para preparar las células para el análisis de citometría de flujo, primero lávelas con dos mililitros de PBS helado, luego separe las células agregando 250 microlitros de tripsina al 0,05%; incube durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados. Luego, usando un microscopio, verifique el desprendimiento de células.

Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con un mililitro de DMEM. A continuación, transfiera un mililitro de células a un tubo de microcentrífuga, luego transfiera 0,25 mililitros de células a un segundo tubo de microcentrífuga. Gira los tubos a 500 quesos durante cinco minutos.

La muestra de 250 microlitros se procesará posteriormente para la citometría de flujo. Deje la muestra de un mililitro a un lado en hielo para el análisis de sangre occidental, que debe realizarse en paralelo después del centrifugado Resus. Suspenda las celdas en 250 microlitros de tampón de fax y colóquelas en hielo, las celdas también se pueden fijar en 1%Aldehído paraformado en PBS Si el análisis de citometría de flujo no será inmediato aquí, la citometría de flujo se realiza utilizando un cian Beckman Coulter, un DP equipado con láseres de estado sólido de 488 nanómetros, 405 nanómetros y 642 nanómetros, se utiliza el software summit para la adquisición y el análisis después de calibrar el citómetro de flujo utilizando perlas estándar, trazar la dispersión hacia adelante o FSC frente a la dispersión lateral SSC a escala lineal y la marcha en la población de células vivas.

A continuación, trace el SSC frente al voltaje, el ancho de pulso y la marcha en la población de células vivas no agregadas. A continuación, trace FSC en una escala lineal frente a la fluorescencia de CFP a 405 FL seis en este instrumento en una escala logarítmica y la marcha en las células vivas positivas de CFP no agregadas. Por último, se traza FSC a escala lineal frente a la fluorescencia YFP a 488 nanómetros FL uno en este instrumento a escala logarítmica para visualizar la intensidad de BC.

A continuación, ejecute la muestra de doble negativo Y-F-P-C-F-P y ajuste el tubo fotomultiplicador F-S-C-S-S-C FL one y FL six o el voltaje PMT para establecer el umbral de cada señal. A continuación, ejecute muestras positivas únicas YFP y CFP para futuras compensaciones sin conexión. Asegúrese de adquirir al menos 10.000 eventos cerrados.

Finalmente, recoja los datos para muestras experimentales después de la recolección de datos. Configure el protocolo de análisis según la adquisición con propagación con puerta uno en el diagrama de puntos CSC de FS para células vivas. Puerta dos en pulso FSC con diagrama de puntos de la puerta uno para células vivas no agregadas y puerta tres en ccfp FSC diagrama de puntos de la puerta dos para células vivas ccfp positivas no agregadas.

Después de compensar la señal YFP y CCFP en el diagrama de puntos Y fp CFP utilizando celdas positivas simples YFP y CFP, determinamos las líneas de corte para las celdas positivas CFP e YFP. Exporte la intensidad de fluorescencia media de YFP o MFI de las células CFP positivas para sobresalir en el trazado de datos, luego en Excel normalice Y-F-P-M-F-I al nivel de expresión de ACAP LBC PDE E 43 y la tubulina alfa de control de carga según lo determinado por Western blot para determinar el rango lineal de la intensidad de fluorescencia media de YFP. La CFP se seccionó con VN ACAP L BBC y cantidades variables de VC PDE E 43 en células HEC 2 93 y la interacción se evaluó mediante citometría de flujo bif como se describe en este video, este gráfico muestra el cambio relativo del pliegue en la expresión de VC PDE E 43 en función de VC PDE E 43 transfectado.

La intensidad media de fluorescencia de Venus en las células CFP positivas indicadas por los cuadrados azules se correlacionó con la expresión de VCDE 43 y fue consistente con los niveles de expresión determinados por el análisis de imágenes de un Western blot, que se indica mediante los triángulos rojos. Se observó una intensidad de fluorescencia media de CFP similar entre las muestras, como lo indican los cuadrados verdes, y se utilizó como control negativo para limitar las variaciones celulares. Estos resultados validan el uso de la citometría de flujo para cuantificar la interacción de ACAB LB C PDE 43 midiendo la intensidad de fluorescencia media de BS e y, al mismo tiempo, determinando la cantidad adecuada de construcciones BIC utilizadas para el cribado para mapear los sitios de unión de ACAP LBC dentro de PDE E 43 Análisis de BIC de la interacción de ACAP LBC con PDE E 43 fl de longitud completa.

La UCR una región de PDE 43 y la UCR dos y CAT de PDE 43 se evaluaron utilizando este método, como se ve aquí. La expresión de vn, ACAP, LBC, LBC y VC, PDE 43, UCR dos más CAT da como resultado una señal de BC más baja en comparación con VC, PDE 43, FL y VC PDE 43 UCR, se observó una expresión de proteína similar en todas las muestras de flujo, y la fluorescencia media se normalizó a los niveles de expresión relativos de ACAP, LBC, PDE 43 y alfa tubulina. Por lo tanto, el B-C-M-F-I normalizado indica que no hay diferencia en la intensidad de fluorescencia entre ACAP LBC PDE 43 FL y ACAP LBC PDE 43 UCR R uno, pero una señal mucho menor para ACAP LBC PDE 43 UCR dos más interacción CAT.

Estos resultados sugieren que hay múltiples regiones en PDE 43 que interactúan con ACAP LBC y que PDE 43 UCR R one es la región primaria de interacción con ACAP LBC. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo estudiar la proteína, la interacción de proteínas mediante el análisis de citometría de flujo de BP C. Al intentar este procedimiento, es importante recordar determinar la cantidad correcta de construcción de BP C utilizada para obtener una expresión de proteína similar y una respuesta lineal de BP C. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el péptido o el riesgo, para determinar qué aminoácidos dentro de PDE 40 D tres son responsables.

Sus interacciones ACAP RBC.