Name: El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a mapear sitios de interacción proteína-proteína mediante BiFC y citometría de flujo en células HEK293T. Este método cuantitativo de alto rendimiento permite analizar interacciones entre AKAP-Lbc y PDE4D3 con normalización de expresión proteica.

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Agradecemos el laboratorio O&#39;Bryan en la UIC para la evaluación experimental y la discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Beca 11SDG5230003 al Centro GKC y Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional - UIC Centro de Ciencias de la clínica y traslacional Grant UL1TR000050.

1. Transfección celular <ol><li> Células de la placa el día antes de la transfección, plateando el menor número de células de inmunofluorescencia. <ol><li> Por inmunofluorescencia: en una placa de 6 pocillos, escudo cubreobjetos de vidrio (1 por pocillo) con 0,02% de gelatina a 37 ° C durante al menos 4 horas, se lava una vez con medio, y para cada pozo, placa 1 x 10 5 células HEK 293T las células en 2 ml de medio de crecimiento completo [medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) más 10% de FBS]. </li><li> Para citometría de flujo y análisis de transferencia Western: placa de 1,2 x 10 5 células HEK 293T / pocillo en 2 ml de medio de crecimiento completo en placa de 6 pocillos (5 x 10 células HEK 293T 0,3 en 0,5 ml de medio de crecimiento completo por pocillo en placas de 24 pocillos ). </li></ol></li><li> Preparar ADN para la transfección de acuerdo con el protocolo de fabricación: Effectene (Qiagen) se utiliza para inmunofluorescencia. TransIT-LT1 (Mirus) se utiliza para citometría de flujo y análisis de transferencia de Western. Cantidad de ADN usada se enumeran a continuación. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> Placa de 24 pocillos (ng) </td><td> Placa de 6 pocillos (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vector </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (longitud completa PDE4D3) </td><td> 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR1 (un fragmento N-terminal de PDE4D3 que contiene el dominio UCR1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR2 + CAT (un fragmento C-terminal de PDE4D3 que contiene los dominios UCR2 y catalítica) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> La transfección utilizando Effectene (6 pocillos): <ol><li> Añadir cantidad indicada de ADN plásmido + 4 l potenciador a 100 l de tampón CE, la mezcla, y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l Effectene, mezclar e incubar durante 10 minutos atemperatura ambiente. Añadir gota a gota a las células. </li></ol> La transfección con tránsito LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Añadir cantidad indicada de ADN plásmido a 250 μl/50 l de Opti-MEM medio libre de suero que en un tubo estéril. </li><li> Añadir TransIT-LT1 reactivos a la mezcla de ADN diluido y pipetear suavemente para mezclar. (Tránsito-LT1 Reactivo: relación DNA es de 3 l de tránsito LT1 reactivo por 1 g de ADN). </li><li> Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y añadir, gota a gota a las células. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las células para citometría de flujo, Western Blot e inmunofluorescencia <ol><li> 24 h después de la transfección, compruebe fluorescencia al microscopio de epifluorescencia antes de recoger las células. </li><li> Preparación de las células para el análisis de citometría de flujo: <ol><li> Lavar las células con 0,5 ml / 2 ml de PBS enfriado en hielo para las placas 24-well/6-well. </li><li> Separar las células utilizando 50 μl/250 l 0,05% de tripsina. </li><li> Neutralizar la tripsina con 200 l / 1 ml de medio DMEM. </li><li> Collect 250 células l (tanto para la placa de 24 pocillos y 6 pocillos) por centrifugación a 500 xg durante 5 min, se utilizan las células restantes (1 ml) para análisis de transferencia Western. </li><li> Resuspender las células en 250 l de tampón FACS [PBS + 0,5% (w / v) de BSA + 2 mM de EDTA], almacenar en hielo para el análisis de citometría de flujo. Las células también pueden ser fijadas en paraformaldehído al 1% (en PBS) si el análisis de citometría de flujo no será inmediata. </li></ol></li><li> Preparación de las células para el análisis de Western blot: lleva a cabo en paralelo con la preparación de células para el análisis de citometría de flujo. <ol><li> Lavar las células 1 vez con 2 ml de PBS enfriado en hielo, lisar las células mediante la adición de 100 l de tampón de lisis celular [10 mM de tampón de fosfato de sodio, pH 6,95, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM EGTA, 1% de Triton X-100] . </li><li> Recoger lisado de células por centrifugación durante 10 min a 21.000 xg a 4 ° C. </li><li> Cuantificar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteínas Bradford, cargar la misma cantidad de proteína por carril para SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa para inmunotransferencia. </li></ol&gt; </li><li> Preparación de las células para inmunofluorescencia. <ol><li> Lavar las células 3 veces con 2 ml de PBS, fijar las células en 1 ml de paraformaldehído al 3,7% (en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente, a continuación, lavar 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 min. </li><li> Monte cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio, utilizando medio de montaje. Selle los bordes cubreobjetos utilizando esmalte de uñas si es necesario. </li><li> Guarde las diapositivas a 4 ° C antes del examen. </li></ol></li></ol> 3. Citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia <ol><li> La citometría de flujo se realizó utilizando un Beckman Coulter Cian ADP, equipada con 488 nm, 405 nm, 642 nm y los láseres de estado sólido. Cumbre software se utiliza para la adquisición y análisis. <ol><li> Calibrar citómetro de flujo usando perlas estándar. </li><li> Terreno dispersión frontal (FSC) / Inclinación de lado de dispersión (SSC) en una escala lineal para la población de células vivas de puerta. </li><li> Terreno FSC / tensión ancho de pulso de la población de células vivas no agregada gating. </li><li> Terreno count/FL6 (PPC fluorescence, 405 nm) en una escala logarítmica para las células PPC-positivos en vivo no agregadas de activación periódica. </li><li> Terreno count/FL1 (YFP fluorescencia, 488 nm) en una escala logarítmica de la intensidad BiFC. </li><li> Ejecutar las muestras negativas YFP-PPC-doble, ajuste FSC, SSC, FL1 y FL6 foto tubo multiplicador (PMT) para ajustar la tensión de umbral para cada señal. </li><li> Ejecute un solo positivo (tanto YFP y PPC + +) muestras para futuras compensaciones fuera de línea </li><li> Adquirir al menos 10.000 eventos cerradas (células no agregadas en vivo PPC +) para su análisis. </li></ol></li><li> La inmunofluorescencia se realizó con un LSM 510 microscopio confocal Zeiss Nota:. Es importante tener todas las configuraciones (como el zoom, pinhole, la ganancia del detector, amplificador de desplazamiento, tamaño, velocidad de exploración, exploración de la media, y la potencia del láser) consistente entre muestras para comparación adecuada de todos los datos. </li></ol> 4. Análisis de Datos (realizó utilizando el software Summit) <ol><li> Configurar el protocolo de análisis similar a la de acquisition con la selección adecuada: Puerta 1 en gráfico de puntos de FSC / SSC para las células vivas. Puerta 2 de FSC / ancho de pulso de la puerta 1 para las células vivas no agregados. Puerta 3 en el recuento / PPC de la puerta 3 de la PPC no agregada + células vivas. </li><li> Compensar YFP y PPC señal usando + y PPC + células positivas individuales YFP. </li><li> Vuelva a determinar las líneas de corte para las células CFP / YFP-positivo. </li><li> Export YFP intensidad media de fluorescencia (MFI) de PPC + células a Excel de datos de trazado. </li><li> Normalizar YFP IMF a los niveles de expresión de AKAP-Lbc, PDE4D3, y control de carga α-tubulina, según se determinó por Western blot. </li></ol>

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<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
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<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

BiFC es un método simple y sensible para estudiar la interacción proteína-proteína. Este método no se puede utilizar para identificar nuevas interacciones proteína-proteína, sin embargo, es especialmente conveniente para confirmar la interacción proteína-proteína dentro de las células y para estudiar las propiedades funcionales, tales como la localización subcelular de complejos de proteínas, mapeo de sitios de interacción proteína-proteína, y para la detección de pequeñas moléculas / péptidos que pueden modular la inte...

650.000 interacciones proteína-proteína se estima que existen en el interactome humana, jugando un papel crítico en el mantenimiento de las funciones celulares normales 1,2. Además de co-inmunoprecipitación (co-IP), el estándar de oro para el estudio de la interacción proteína-proteína a partir de lisado de células, varios ensayos de complementación de fragmentos de proteínas (PCA) se han desarrollado para mejorar la sensibilidad en la detección de la interacción proteína-proteína dentro de las células 3. Las técnicas incluyen la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) y complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) 4,5. BiFC se basa en la asociación facilitado de dos fragmentos de una proteína fluorescente (aquí usamos Venus; una variante YFP) que están cada uno fusionado a un potencial socio de interacción de proteínas (en este ejemplo utilizamos AKAP-Lbc y PDE4D3). La interacción de las dos proteínas de interés dentro de las células resultados en la fluorescencia funcional, que se pueden visualizar por fmicroscopía luorescence utilizando ya sea células vivas o fijas 6,7,8. En comparación con otros PCAs, BiFC es sensible y técnicamente menos exigente, con potencial para estudiar la localización celular en células vivas. Un inconveniente importante de esta técnica, sin embargo es que una vez formado, el complejo proteína fluorescente puede no ser revertida. Por lo tanto, no es un buen método para estudiar la interacción proteína-proteína dinámico. En este trabajo, utilizamos BiFC para asignar los sitios de interacción de PDE4D3 con AKAP-Lbc controlando la intensidad de fluorescencia de Venus. En comparación con el análisis tradicional utilizando microscopía de fluorescencia, que es mucho tiempo y mano de obra intensiva (si no se lleva a cabo utilizando maquinaria de alto rendimiento automatizado), citometría de flujo proporciona un análisis cuantitativo sencillo de miles de células en una población heterogénea durante un corto período de tiempo 9, 10. Aquí, mediante la realización de una comparación lado a lado de análisis de citometría de flujo-BiFC tradicional y co-IP, se demuestra que las dos métodos de proporcionar información comparable, sin embargo, el flujo de análisis de citometría de BiFC consume menos tiempo y utiliza menos material que puede ser más útil cuando las células de interés son limitados.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Águila modificada&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (pluma/estreptococo), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-bandera</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, tratamiento de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Células Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep kit de purificación de plásmidos, alta velocidad</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS), estéril 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo para tinción con FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración de oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de primera calidad Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CO2 con camisa de aire Incubadora</td><td>NuAIR DH de flujo</td><td></td><td></td>automático</tr><tr><td>Microscopio confocal LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis y transferencia</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis por citometría de complementación fluorescencia bimolecular: a high throughput método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Entre los métodos para el estudio de la interacción proteína-proteína dentro de las células, complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) es relativamente simple y sensible. BiFC se basa en la producción de fluorescencia utilizando dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente (Venus, una variante de la proteína fluorescente amarilla, se utiliza aquí). Fragmentos de Venus no fluorescentes (VN y VC) se fusionan a dos proteínas que interactúan (en este caso, AKAP-Lbc y PDE4D3), produciendo fluorescencia debido a la interacción VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 y la formación de una proteína fluorescente funcional dentro de las células. BiFC proporciona información sobre la localización subcelular de complejos de proteínas y la fuerza de las interacciones de proteínas basado en la intensidad de fluorescencia. Sin embargo, el análisis mediante microscopía BiFC para cuantificar la fuerza de la interacción proteína-proteína es mucho tiempo y es algo subjetivo debido a la heterogeneidad en la expresión de proteínas y la interacción. Por citometría de flujo de acoplamientoanálisis con metodología BiFC, la BiFC señal de la interacción proteína-proteína fluorescente se puede medir con precisión para una gran cantidad de células en un corto período de tiempo. Aquí, demostramos una aplicación de esta metodología para mapear regiones en PDE4D3 que se requieren para la interacción con AKAP-Lbc. Esta metodología de alto rendimiento se puede aplicar a la detección de factores que regulan la interacción proteína-proteína.

AKAP-Lbc y PDE4D3 construcciones (Figura 1B) se fusionaron a VN y fragmentos de VC, respectivamente. Interacción de AKAP-Lbc y PDE4D3 resultados funcionales en YFP fluorescencia (Figura 1A). Aquí se utiliza el método BiFC para asignar sitios AKAP-Lbc vinculantes en PDE4D3. Aguas arriba región conservada 1 (UCR1), región aguas arriba conservada 2 (UCR2) y la región catalítica (CAT) se conservan entre las proteínas de la familia de PDE4, por lo tanto, de longitud completa (FL), UCR1 y UCR...

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

El objetivo general de este procedimiento es mapear los sitios de interacción entre ACAP LBC y PDE cuatro D tres mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de la complementación biomolecular de fluorescencia o BC utilizando citometría de flujo. Para ello, las células se transfectan con fragmentos de ACAP LBC y PDE cuatro D tres fusionados a la porción N o C terminal de la proteína reportera fluorescente.Posteriormente se realiza citometría de flujo Venus para evaluar la fluorescencia si los fragmentos de proteína interactúan, ya que Venus se completa y produce fluorescencia. Si los fragmentos de proteína no interactúan, no se detecta fluorescencia. Se realiza un análisis complementario de sangre por inmunotransferencia (western blot) para determinar los niveles relativos de expresión proteica.La intensidad de las interacciones proteína-proteína se calcula entonces normalizando la intensidad media de fluorescencia de YFP con los niveles de expresión proteica. Los datos resultantes indican que la unión de PDE 43 a ACAP LBC está mediada por múltiples regiones dentro de PDE 43, principalmente a través de la región conservada ascendente uno o UCR uno. Las principales v

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Investigación

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Biología

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

En este vídeo, hemos demostrado la purificación de afinidad por complementación bimolecular, BiCAP, para detectar y aislar dímeros de proteínas específicas utilizando anticuerpos de dominio único específicos de conformación.

Purificación de afinidad de complementación bimolecular para aislar dos proteínas que interactúan

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Este manuscrito describe el protocolo para la purificación de afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP). Este novedoso método facilita el aislamiento específico y la caracterización proteómica aguas abajo de cualquier dos proteínas obran recíprocamente, mientras que excluyendo un complejado proteínas individuales como complejos formados con competidores socios de enlace.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

Este protocolo combina la fotometría de masas con un novedoso sistema de microfluídica para investigar las interacciones proteína-proteína de baja afinidad. Este enfoque se basa en la dilución rápida de complejos altamente concentrados en solución, lo que permite mediciones de baja afinidad y amplía la aplicabilidad de la fotometría masiva.

Análisis de la formación de complejos proteicos a concentraciones micromolares mediante el acoplamiento de microfluídica con fotometría de masas

Aprende a mapear sitios de interacción proteína-proteína mediante BiFC y citometría de flujo en células HEK293T. Este método cuantitativo de alto rendimiento permite analizar interacciones entre AKAP-Lbc y PDE4D3 con normalización de expresión proteica.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína (Video) | JoVE Journal

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

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