El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

El objetivo general de este procedimiento es mapear los sitios de interacción entre ACAP LBC y PDE cuatro D tres mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de la complementación biomolecular de fluorescencia o BC utilizando citometría de flujo. Para ello, las células se transfectan con fragmentos de ACAP LBC y PDE cuatro D tres fusionados a la porción N o C terminal de la proteína reportera fluorescente.

Posteriormente se realiza citometría de flujo Venus para evaluar la fluorescencia si los fragmentos de proteína interactúan, ya que Venus se completa y produce fluorescencia. Si los fragmentos de proteína no interactúan, no se detecta fluorescencia. Se realiza un análisis complementario de sangre por inmunotransferencia (western blot) para determinar los niveles relativos de expresión proteica.

La intensidad de las interacciones proteína-proteína se calcula entonces normalizando la intensidad media de fluorescencia de YFP con los niveles de expresión proteica. Los datos resultantes indican que la unión de PDE 43 a ACAP LBC está mediada por múltiples regiones dentro de PDE 43, principalmente a través de la región conservada ascendente uno o UCR uno. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes como la coinmunoprecipitación y la BP C mediante microscopio son que es relativamente sencilla, sensible y facilita el cribado rápido de un gran número de células.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína, también puede utilizarse para detectar factores que regulen dichas interacciones en el descubrimiento de fármacos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es necesario determinar una respuesta B lineal. La expresión del constructo debe ser similar para que los resultados obtenidos con diferentes fragmentos de proteína puedan compararse entre sí.

En los experimentos descritos aquí, las células se transfectan simultáneamente con el fragmento N-terminal del derivado de YFP, Venus fusionado a la proteína completa ACAP LBC y el fragmento C-terminal de Venus fusionado a uno de los siguientes: PDE E 43 completa, la región conservada upstream uno (UCR uno) de PDE E 43 o la región conservada upstream dos más la región catalítica (UCR R dos más CAT) de PDE 43. Un día antes de la transfección, en placas de cultivo celular de seis pocillos, sembrar 1,2 × 10⁵ células HEC 293 T por pocillo en dos mililitros de medio de crecimiento completo. Sembrar tres pocillos de control más tres pocillos para cada una de las pruebas.

Incubar Cotran al 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, preparar la transfección de los constructos de ADN plasmático BC y del vector CFP, que se transfecta simultáneamente con los constructos BS C como marcador. Para cada condición, añadir la cantidad adecuada de ADN a 250 microlitros de medio libre de suero Optum M1.

En un tubo estéril, un tubo es suficiente para transfectar tres pocillos. A continuación, añada tres microlitros del reactivo Transit-LT1 por cada microgramo a la mezcla de ADN diluido y pipetee suavemente para mezclar; incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, añada gota a gota 250 microlitros de la mezcla de transfección a las células y luego incube a 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Después de la transfección, revise la fluorescencia bajo un microscopio de fluorescencia epiescopia; las células deben expresar fluorescencia amarilla para la señal BC y fluorescencia CFP para informar la eficiencia de transfección. Para preparar las células para el análisis citométrico de flujo, primero lávelas con dos mililitros de PBS frío, luego desprenda las células añadiendo 250 microlitros de tripsina al 0,05 % e incube de dos a cinco minutos a 37 grados Celsius. A continuación, utilice un microscopio para verificar el desprendimiento celular.

Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina con un mililitro de DMEM. A continuación, transfiera un mililitro de células a un tubo microcentrífugo, luego transfiera 0,25 mililitros de células a un segundo tubo microcentrífugo. Centrifugue los tubos a 500 cheeses durante cinco minutos.

La muestra de 250 microlitros se procesará posteriormente para citometría de flujo. Separe la muestra de un mililitro sobre hielo para el análisis de sangre occidental, que debe realizarse en paralelo siguiendo el spin Resus. Suspender las células en 250 microlitros de tampón fax y colocarlas sobre hielo. Las células también pueden fijarse en paraformaldehído al 1 % en PBS si el análisis por citometría de flujo no será inmediato. Aquí, la citometría de flujo se realiza utilizando un Beckman Coulter Cyan ADP equipado con láseres de estado sólido de 488 nanómetros, 405 nanómetros y 642 nanómetros. El software Summit se utiliza para la adquisición y el análisis tras calibrar el citómetro de flujo utilizando perlas estándar. Representar la dispersión directa (FSC) frente a la dispersión lateral (SSC) en una escala lineal y seleccionar la población de células viables.

A continuación, grafique SSC frente al ancho del pulso de voltaje y seleccione la población de células vivas no agregadas. Luego, grafique FSC en una escala lineal frente a la fluorescencia de CFP en 405 FL seis en este instrumento en una escala logarítmica y seleccione las células vivas positivas para CFP no agregadas. Finalmente, grafique FSC en una escala lineal frente a la fluorescencia de YFP a 488 nanómetros FL uno en este instrumento en una escala logarítmica para visualizar la intensidad de BC.

A continuación, ejecute la muestra doble negativa Y-F-P-C-F-P y ajuste el voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) del canal FL uno y FL seis de F-S-C-S-S-C para establecer el umbral de cada señal. A continuación, ejecute ambas muestras positivas simples de YFP y CFP para la compensación futura fuera de línea. Asegúrese de adquirir al menos 10.000 eventos compuertados.

Finalmente, recopile datos para las muestras experimentales tras la recopilación de datos. Configure el protocolo de análisis según la adquisición, propagando la compuerta uno en el gráfico de dispersión de FS CSC para células viables. Compuerta dos en el pulso de FSC con gráfico de dispersión de la compuerta uno para células viables no agregadas y compuerta tres en el gráfico de dispersión de ccfp FSC de la compuerta dos para células viables positivas para ccfp no agregadas.

Después de compensar la señal de YFP y CCFP en el gráfico de dispersión Yfp CFP utilizando células individualmente positivas para YFP y CFP, determinamos las líneas de corte para células positivas para CFP y YFP. Exporte la intensidad media de fluorescencia o MFI de YFP de las células positivas para CFP a Excel para la representación gráfica de los datos; luego, en Excel, normalice la MFI de Y-F-P a los niveles de expresión de ACAP LBC PDE E 43 y al control de carga alfa-tubulina, determinados mediante inmunotransferencia, para establecer el rango lineal de la intensidad media de fluorescencia de YFP. CFP se transfectó conjuntamente con VN ACAP L BBC y cantidades variables de VC PDE E 43 en células HEC 2 93, y la interacción se evaluó mediante citometría de flujo bif como se describe en este video; este gráfico muestra el cambio relativo en la expresión de VC PDE E 43 en función de la cantidad de VC PDE E 43 transfectada.

La intensidad media de fluorescencia de Venus en células positivas para CFP, indicada por los cuadrados azules, se correlacionó con la expresión de VCDE 43 y fue consistente con los niveles de expresión determinados mediante análisis de imágenes de un blot western, lo cual se indica mediante los triángulos rojos. Se observó una intensidad de fluorescencia media similar de CFP entre las muestras, como indican los cuadrados verdes, y se utilizó como control negativo para limitar las variaciones celulares. Estos resultados validan el uso de citometría de flujo para cuantificar la interacción ACAB LB C PDE 43 mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de BS e, al mismo tiempo que se determina la cantidad adecuada de constructos BIC utilizados para el cribado, con el fin de mapear los sitios de unión de ACAP LBC dentro de PDE E 43. El análisis BIC de la interacción entre ACAP LBC y PDE E 43 de longitud completa (fl).

La región UCR uno de la PDE 43 y las regiones UCR dos y CAT de la PDE 43 se evaluaron mediante este método, como se observa aquí. La expresión de vn ACAP LBC y VC PDE 43 UCR dos más CAT produce una señal BC más baja en comparación con VC PDE 43 FL y VC PDE 43 UCR uno; se observó una expresión proteica similar en todas las muestras de citometría y la fluorescencia media se normalizó respecto a los niveles relativos de expresión de ACAP LBC PDE 43 y alfa-tubulina. Por lo tanto, el B-C-M-F-I normalizado indica que no hay diferencia en la intensidad de fluorescencia entre ACAP LBC PDE 43 FL y ACAP LBC PDE 43 UCR R uno, pero una señal mucho más baja para la interacción ACAP LBC PDE 43 UCR dos más CAT.

Estos resultados sugieren que existen múltiples regiones en la PDE 43 que interactúan con la LBC de ACAP y que la región UCR R de la PDE 43 es la zona principal de interacción con la LBC de ACAP. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la interacción entre proteínas mediante análisis de citometría de flujo de la BP C. Al intentar este procedimiento, es importante recordar determinar la cantidad correcta del constructo de BP C utilizada para obtener una expresión proteica similar y una respuesta lineal de BP C. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como péptidos o riesgo, con el fin de determinar qué aminoácidos dentro de la PDE 40 D tres son responsables de ello.

Sus interacciones entre ACAP y GR.