Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

El objetivo general de este método es sintetizar una nanopartícula magnética dentro de una jaula de proteínas y luego funcionalizar la proteína de manera que permita la unión rápida de la nanopartícula magnética a las células. Este método se puede utilizar para generar nanopartículas magnéticas que permiten un marcaje magnético rápido y eficiente de las células, lo cual es importante para aplicaciones como la resonancia magnética o la separación magnética de células. La principal ventaja de esta técnica es que la magnetización celular se puede lograr utilizando bajas concentraciones de nanopartículas y tiempos de incubación cortos, lo que evita posibles efectos adversos debido a la exposición a nanopartículas.

Para comenzar, desoxigena 500 mililitros de agua desionizada colocando un tubo conectado a un cilindro de gas nitrógeno en el agua y sellando el recipiente con una película adhesiva. Luego, burbujee el gas nitrógeno durante aproximadamente 60 minutos. Caliente un baño de agua conectado al recipiente de reacción de doble camisa a 65 grados centígrados.

A continuación, añada 75 mililitros de tampón HEPES de 50 milimolares, pH 8,6 en el recipiente de reacción. Selle el recipiente y desoxigene burbujeando gas nitrógeno a través de la solución tampón durante aproximadamente 20 minutos. Al mismo tiempo, agite la solución tampón con un agitador magnético.

Después de desoxigenar la solución tampón HEPES, retire el tubo de nitrógeno del tampón, manteniéndolo suspendido sobre la solución para mantener una atmósfera de nitrógeno. Agregue apoferritina para lograr una concentración final de 3 miligramos por mililitro. Continúe con la agitación magnética, pero reduzca la velocidad de agitación si se produce espuma.

Para la síntesis de magnetoferritina, utilice dos bombas de jeringa para inyectar simultáneamente 10,1 mililitros del precursor de hierro-cobalto y 10,1 mililitros de peróxido de hidrógeno en la solución de apoferritina a un caudal de 0,15 mililitros por minuto. Continúe con los pasos de síntesis como se describe en el protocolo de texto. A continuación, cargue la muestra en una columna que contenga una matriz catiónica utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 10 mililitros por minuto.

Lave la columna con aproximadamente 100 mililitros de tampón de funcionamiento utilizando una bomba de gradiente a un caudal de 10 mililitros por minuto. Para eluir la proteína, lave la columna con 150 mililitros de concentraciones crecientes de cloruro de sodio y tampón tris a 10 mililitros por minuto. Como la proteína eluye a una concentración de cloruro de sodio de 500 milimolares, recójala en fracciones de 50 mililitros utilizando un colector de fracciones automatizado.

Concentre los 150 mililitros de magnetoferritina a un volumen de aproximadamente dos mililitros utilizando una unidad de filtro centrífugo de 15 mililitros seguida de una unidad de volumen de cuatro mililitros. Consulte las instrucciones del fabricante de las unidades de filtro centrífugo para obtener un protocolo detallado de este procedimiento. A continuación, cargue la muestra concentrada en una columna de filtración de gel mediante un circuito de inyección.

Lave la columna con tampón de funcionamiento a un caudal de 1,3 mililitros por minuto. Recoja fracciones de seis mililitros utilizando un colector de fracciones automatizado. Los monómeros de proteínas eluyen en último lugar.

En este punto, la magnetoferritina purificada puede almacenarse a cuatro grados centígrados hasta la cationización. Para 10 miligramos de magnetoferritina, pese 374 miligramos de DMPA y disuelva en 2,5 mililitros de tampón MES de 200 milimolares. Ajuste el pH de la solución a aproximadamente siete usando ácido clorhídrico concentrado.

Los humos tóxicos se liberan cuando se ajusta el pH de la solución de DMPA con ácido clorhídrico. Asegúrese de manipular estos materiales en una campana extractora. Agregue 2,5 mililitros de solución de magnetoferritina a cuatro miligramos por mililitro.

Agregue un agitador magnético y revuelva durante dos horas para equilibrar. Después de ajustar la solución a pH 5.0, agregue 141 miligramos de polvo de EDC a la solución de magnetoferritina DMPA. Continúe revolviendo durante tres horas y media.

Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar cualquier precipitado y dializar la proteína como se describe en el protocolo de texto. Cultive las hMSC como se describe en el protocolo de texto. Lave las celdas chapadas con dos mililitros de PBS a temperatura ambiente.

Luego, agregue un mililitro de la solución de magnetoferritina catiónica esterilizada a las celdas en placa antes de incubar durante el período de tiempo deseado. Lave las células con PBS y luego recoséjelas agregando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de agregar un mililitro de medio de cultivo para inactivar la tripsina EDTA, transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 524 veces G. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 0.5 mililitros de tampón de separación magnética.

A continuación, fije el imán al soporte múltiple y añada una columna de separación magnética al imán. Coloque un filtro de preseparación en la columna. A continuación, añade 0,5 mililitros de tampón de separación magnética al filtro de preseparación y deja que pase por el filtro y la columna para lavarlos.

A continuación, coloque un tubo de centrífuga de 15 mililitros debajo de la columna y agregue 0,5 mililitros de la suspensión de la celda al depósito del filtro de la columna de separación magnética. Cuando el depósito esté vacío, agregue 0,5 mililitros de tampón de separación magnética. Cuando el depósito se vacíe de nuevo, añada otros 0,5 mililitros de tampón de separación magnética.

Repita el lavado una vez más, para obtener un volumen total de tampón de separación magnética de 1,5 mililitros. Este paso de lavado eluye todas las células no magnetizadas de la columna. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo de centrífuga nuevo de 15 mililitros.

A continuación, retire el filtro del depósito de la columna. Agregue 1 mililitro del tampón de separación magnética al depósito e inmediatamente empuje a través de la columna usando el émbolo suministrado por el fabricante. Esto eluye las celdas magnetizadas de la columna hacia el tubo de centrífuga.

Proceda a realizar la cuantificación de hierro como se describe en el protocolo de texto. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de muestras de magnetoferritina teñidas con negativos mostraron que se han formado nanopartículas dentro de la jaula de proteínas. Las mediciones de potencial zeta confirman que la magnetoferritina obtuvo una carga superficial positiva después de la cationización.

La exposición de células madre mesenquimales humanas a magnetoferritina catiónica durante un minuto dio como resultado la magnetización del 92% de la población celular y la entrega de 3,6 picogramos de hierro por célula. El aumento del tiempo de incubación a 15 minutos dio como resultado la magnetización de toda la población celular. Después de ver este video, debería comprender cómo sintetizar una nanopartícula magnética dentro de la cavidad de apoferritina mediante la adición secuencial de precursores de sales metálicas a la solución de proteína.

Y luego, cómo catiizar químicamente la proteína usando el acoplamiento TMPA. Una vez dominada, la síntesis, purificación y cationización de la magnetoferritina se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante evitar la contaminación por oxígeno y mantener la temperatura y el pH correctos durante la síntesis de magnetoferritina.

Siguiendo con este procedimiento, otras cargas, como puntos cuánticos o agentes terapéuticos, se pueden encapsular en la jaula de apoferritina catiónica para lograr una entrega más eficiente de esos materiales a las células. Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la manipulación de células magnéticas exploren el etiquetado magnético en células que exhiben una mala absorción de nanopartículas o que son muy sensibles a la exposición prolongada a nanopartículas o concentraciones elevadas de nanopartículas.