Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

El objetivo general de este método es sintetizar una nanopartícula magnética dentro de una jaula proteica y luego funcionalizar la proteína de manera que permita la unión rápida de la nanopartícula magnética a las células. Este método puede utilizarse para generar nanopartículas magnéticas que permitan una marcación magnética rápida y eficiente de células, lo cual es importante para aplicaciones como la resonancia magnética (MRI) o la separación magnética de células. La principal ventaja de esta técnica es que la magnetización celular puede lograrse utilizando bajas concentraciones de nanopartículas y tiempos cortos de incubación, lo que previene posibles efectos adversos derivados de la exposición a las nanopartículas.

Para comenzar, desoxigene 500 mililitros de agua desionizada colocando un tubo conectado a un cilindro de gas nitrógeno en el agua y sellando el recipiente con una película plástica adhesiva. Luego, burbujee gas nitrógeno durante aproximadamente 60 minutos. Caliente un baño de agua conectado al recipiente de reacción de doble camisa a 65 grados Celsius.

Luego, agregue 75 mililitros de tampón HEPES 50 milimolar, pH 8,6 al recipiente de reacción. Selle el recipiente y desoxigene burbujeando gas nitrógeno a través de la solución tampón durante aproximadamente 20 minutos. Al mismo tiempo, agite la solución tampón utilizando un agitador magnético.

Después de desoxigenar la solución tampón HEPES, retire el tubo de nitrógeno del tampón, manteniéndolo suspendido sobre la solución para conservar una atmósfera de nitrógeno. Añada apoferritina para alcanzar una concentración final de 3 miligramos por mililitro. Continúe con la agitación magnética, pero reduzca la velocidad de agitación si se produce espumación.

Para la síntesis de magnetoferritina, utilice dos bombas de jeringa para inyectar simultáneamente 10,1 mililitros del precursor de hierro-cobalto y 10,1 mililitros de peróxido de hidrógeno en la solución de apoferritina a un caudal de 0,15 mililitros por minuto. Continúe con los pasos de síntesis según se describe en el protocolo del texto. A continuación, cargue la muestra en una columna que contenga una matriz catiónica utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 10 mililitros por minuto.

Lave la columna con aproximadamente 100 mililitros de tampón de corrida utilizando una bomba de gradiente a un flujo de 10 mililitros por minuto. Para eluir la proteína, lave la columna con 150 mililitros de concentraciones crecientes de cloruro de sodio y tampón tris a 10 mililitros por minuto. Dado que la proteína se eluye a una concentración de cloruro de sodio de 500 milimolar, recójala en fracciones de 50 mililitros usando un colector de fracciones automatizado.

Concentre los 150 mililitros de magnetoferritina hasta un volumen de aproximadamente dos mililitros utilizando una unidad de filtro centrífugo de 15 mililitros seguida de una unidad de volumen de cuatro mililitros. Consulte las instrucciones del fabricante de las unidades de filtro centrífugo para obtener un protocolo detallado de este procedimiento. A continuación, cargue la muestra concentrada en una columna de filtración en gel utilizando un bucle de inyección.

Lave la columna con tampón de corrida a un flujo de 1,3 mililitros por minuto. Recolecte fracciones de seis mililitros utilizando un colector de fracciones automatizado. Los monómeros de proteína eluyen al final.

En este punto, la magnetoferritina purificada puede almacenarse a cuatro grados Celsius hasta la cationización. Para 10 miligramos de magnetoferritina, pese 374 miligramos de DMPA y disuélvalos en 2,5 mililitros de tampón MES 200 milimolar. Ajuste el pH de la solución a aproximadamente siete utilizando ácido clorhídrico concentrado.

Se liberan humos tóxicos al ajustar el pH de la solución de DMPA con ácido clorhídrico. Asegúrese de manipular estos materiales en una campana extractora. Añada 2.5 mililitros de solución de magnetoferritina a cuatro miligramos por mililitro.

Agregue un agitador magnético y agite durante dos horas para equilibrar. Después de ajustar la solución a pH 5,0, agregue 141 miligramos de polvo de EDC a la solución de magnetoferritina DMPA. Continúe agitando durante tres horas y media.

Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones para eliminar cualquier precipitado y diализar la proteína según se describe en el protocolo del texto. Cultive las hMSCs según se describe en el protocolo del texto. Lave las células en placas con dos mililitros de PBS a temperatura ambiente.

Luego, agregue un mililitro de la solución esterilizada de magnetoferritina cationizada a las células en la placa antes de incubar durante el período de tiempo deseado. Lave las células con PBS y luego récogalos agregando 0,5 mililitros de tripsina-EDTA e incubando a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Después de agregar un mililitro de medio de cultivo para inactivar la tripsina-EDTA, transfiera la solución a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 524 veces G. Descarte el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 0,5 mililitros de tampón de separación magnética.

A continuación, fije el imán al soporte múltiple y coloque una columna de separación magnética sobre el imán. Coloque un filtro previo a la separación en la columna. Luego, añada 0,5 mililitros de tampón de separación magnética al filtro previo a la separación y deje que pase a través del filtro y de la columna para lavarlos.

A continuación, coloque un tubo centrífugo de 15 mililitros debajo de la columna y agregue 0,5 mililitros de la suspensión celular al depósito del filtro de la columna de separación magnética. Cuando el depósito esté vacío, agregue 0,5 mililitros de tampón de separación magnética. Cuando el depósito se vacíe nuevamente, agregue otros 0,5 mililitros de tampón de separación magnética.

Repita el lavado una vez más, para un volumen total de tampón de separación magnética de 1,5 mililitros. Este paso de lavado eluye todas las células no magnetizadas de la columna. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo cónico nuevo de 15 mililitros.

Luego, retire el filtro del depósito de la columna. Añada 1 mililitro del tampón de separación magnética al depósito e inmediatamente páselo a través de la columna utilizando el émbolo suministrado por el fabricante. Esto eluye las células magnetizadas de la columna hacia el tubo del centrífugo.

Proceda a realizar la cuantificación de hierro según se describe en el protocolo escrito. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de muestras de magnetoferritina teñidas negativamente mostraron que se han formado nanopartículas dentro de la jaula proteica. Las mediciones del potencial zeta confirman que la magnetoferritina obtuvo una carga superficial positiva tras la cationización.

Exponer células madre mesenquimales humanas a magnetoferritina cationizada durante un minuto provocó la magnetización del 92 % de la población celular y la entrega de 3,6 picogramos de hierro por célula. Aumentar el tiempo de incubación a 15 minutos resultó en la magnetización de toda la población celular. Tras ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo sintetizar una nanopartícula magnética dentro de la cavidad de la apoferritina mediante la adición secuencial de precursores de sales metálicas a la solución proteica.

Y luego, cómo cationizar químicamente la proteína utilizando el acoplamiento con TMPA. Una vez dominadas, la síntesis, purificación y cationización de magnetoferritina pueden realizarse en tres días si se llevan a cabo adecuadamente. Durante el intento de este procedimiento, es importante evitar la contaminación con oxígeno y mantener la temperatura y el pH correctos durante toda la síntesis de magnetoferritina.

Tras este procedimiento, otras cargas como puntos cuánticos o agentes terapéuticos pueden encapsularse en la jaula de apoferritina cationizada para lograr una entrega más eficiente de esos materiales a las células. Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la manipulación magnética celular exploren el marcado magnético en células que presentan una baja absorción de nanopartículas o que son muy sensibles a la exposición prolongada a nanopartículas o a concentraciones elevadas de estas.