La eliminación del biofilm El uso de aerosoles de dióxido de carbono sin purga de nitrógeno

El objetivo general de este experimento es evaluar la eficacia de la eliminación de biopelículas utilizando aerosoles de dióxido de carbono sin una purga de nitrógeno. Los aerosoles de dióxido de carbono se pueden utilizar para eliminar biopelículas utilizando la transferencia de impulso y la acción de surfactante sobre los aerosoles. Este es un método efectivo y confiable para eliminar biopelículas en un corto período de tiempo, y también es una técnica de limpieza en fase gaseosa de biopelículas.

Para comenzar el experimento, use chips de acero inoxidable cortados mecánicamente de 1 milímetro de espesor tres cero cuatro, de 10 x 10 milímetros cuadrados en su interior. A continuación, limpie por ultrasonidos los chips en acetona, metanol y agua desionizada o desionizada secuencialmente. Enjuague las virutas con agua desionizada corriente durante cuatro segundos, luego seque las virutas con flujo de gas nitrógeno durante cuatro segundos.

Recupere una culata de Pseudomonas putida KT2440 almacenada a 80 grados centígrados. Descongele el cultivo a temperatura ambiente durante un minuto, cuando la capa superior de la solución madre congelada se convierta en aguanieve. Sumerja un bucle en la capa derretida de la solución madre y coloque las bacterias en un caldo Luria, o placa LB que contenga 1,5% de agar.

Incubar la placa durante la noche a 30 grados centígrados. Al día siguiente, agregue 10 mililitros de LB en un tubo cónico de 50 mL. Use un lazo nuevo para recoger una sola colonia del plato e inocular el LB. Incuba el caldo en una incubadora agitadora.

Recoja cada una de las papas fritas preparadas con pinzas y sumérjalas en etanol al 70% cinco veces durante 1-2 segundos cada una para esterilizar la superficie de cada viruta. A continuación, enjuague cada chip con agua desionizada o desionizada esterilizada en autoclave. Luego, en LB secuencialmente para eliminar el etanol restante.

Coloque las virutas en placas de cultivo de seis pocillos con dos virutas en cinco milímetros de caldo LB por pocillo. Luego, diluya el cultivo bacteriano hasta que la concentración en el caldo LB alcance 8 x 10 a la octava célula por mililitro. Inocular cada pocillo con 50 microlitros del cultivo bacteriano diluido.

Luego, incuba las placas. Sumerja las virutas de forma biofilmada en tampón de acetato de amonio de 10 milimolares cinco veces para eliminar las bacterias planctónicas y poco adheridas. Luego, seque las virutas en una cabina de bioseguridad donde el aire fluya suavemente.

Inmediatamente después del secado, coloque una viruta en el lugar de carga, a 20 milímetros de la boquilla de dióxido de carbono a lo largo del eje del chorro. Incline el eje del chorro a un ángulo de 40 grados. A continuación, ajuste las presiones de estancamiento del dióxido de carbono y el gas nitrógeno utilizando reguladores de presión de gas.

Aplique el chorro de aerosol en la parte central del chip. Abra la válvula solenoide para dióxido de carbono durante cinco segundos y luego apáguela durante tres segundos periódicamente usando un interruptor controlado manualmente. Si es necesario utilizar una purga de nitrógeno, abra la válvula solenoide para obtener un suministro continuo de nitrógeno.

Una vez completada la configuración, trate los chips con aerosoles de dióxido de carbono con y sin purgas de nitrógeno y compare los chips con diferentes tiempos de tratamiento de aerosoles. Retener las fichas sin tratamiento como controles negativos. Prepare un micromolar de tinción de ácido nucleico de fluorescencia verde en agua desionizada para teñir las células bacterianas en los chips tratados con control y aerosol.

Coloque la solución de tinción en los pocillos con las astillas e incube. Después de la incubación, enjuague suavemente las virutas con agua desionizada que fluye para eliminar el exceso de tinte fluorescente. Luego, seque las virutas con flujo de gas nitrógeno.

Tome imágenes microscópicas de fluorescencia de cinco campos de visión aleatorios para cada chip utilizando un microscopio de epifluorescencia. Por último, pasemos a los cálculos. Las imágenes microscópicas de fluorescencia de biopelículas de Pseudomonas putida cultivadas durante 24 horas se trataron con aerosoles de dióxido de carbono durante cero, 16, 40 y 88 segundos sin purgas de nitrógeno.

Las eficiencias de remoción calculadas en base a las intensidades de fluorescencia de las biopelículas sin purgas de nitrógeno fueron mayores que las eficiencias de remoción con purgas de nitrógeno. Como has visto en este vídeo, la técnica de limpieza trifásica elimina eficazmente el biofilm en un corto periodo de tiempo. Se puede aplicar a una amplia variedad de superficies biocontaminadas.