Metodologías para el estudio B. subtilis Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

Las biopelículas bacterianas son importantes para la salud humana, ya que protegen a sus residentes bacterianos de las agresiones ambientales y los agentes antimicrobianos. El objetivo de este procedimiento fue desarrollar un sistema modelo para evaluar los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas en la formación de biopelículas. Estos métodos pueden ayudar a establecer un conjunto de herramientas esenciales para el campo de las biopelículas para seleccionar inhibidores de moléculas pequeñas que se dirijan específicamente a la formación de biopelículas.

La principal ventaja de estas metodologías es que parten de un marco experimental consistente y robusto, y proporcionan información cuantitativa y cualitativa sobre el mecanismo de acción de los inhibidores específicos de la biopelícula. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre las biopelículas de Bacillus subtilis, también se pueden aplicar a otras bacterias formadoras de biopelículas, como Pseudomonas aeruginosa o el patógeno de plantas Xanthomonas citri. La microscopía electrónica de barrido puede ser esencial para analizar el efecto de moléculas pequeñas en la formación de biopelículas, ya que permite la observación de la matriz extracelular y proporciona una resolución de una sola célula.

Para comenzar, primero seleccione una colonia individual apropiada y transfiérala a tres mililitros de caldo LB. Coloque este cultivo iniciador en una incubadora agitadora durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, tome 1,5 mililitros del cultivo iniciador y centrifugue durante cuatro minutos.

Retire con cuidado el sobrenadante y luego vuelva a suspender el pellet en 1,5 mililitros de medio MSgg. Para cultivar películas, prepare una placa de cultivo celular de 12 pocillos agregando tres mililitros de MSgg a cada pocillo. A algunos de estos pocillos, se añade MSgg con una pequeña molécula inhibidora en un rango de concentración, distribuyendo la ubicación de las diferentes concentraciones alrededor de la placa, para evitar efectos de borde.

Mida la densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo iniciador resuspendido. La referencia cultural debe estar entre 0,6 y uno. Esto es fundamental para la robustez del sistema.

Inocular cada pocillo de la placa de cultivo con 3 microlitros del cultivo iniciador resuspendido. Luego, incube la placa a 23 grados centígrados durante tres días en condiciones estáticas. Luego, retire la placa de la incubadora y observe las películas.

Para cultivar biopelículas, use una plantilla y localice simétricamente cuatro gotas separadas de 1,5 microlitros de cultivo iniciador sin lavar en una placa MSgg de 1,5% de agar seca de 8,5 centímetros. Deje que las gotas se absorban en el medio antes de mover el plato. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante tres días.

Utilizando un prismático con una exposición homogénea de la iluminación, compruebe que las colonias de biofilm se han desarrollado y formado una estructura arrugada tridimensional. Primero, tome una hoja de afeitar limpia y corte las colonias de biofilm en dos partes iguales con la ayuda de la plantilla. Levante con cuidado la mitad de la colonia con una espátula limpia y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que contiene 500 microlitros de PBS.

Tome la segunda mitad de la colonia y transfiérala a un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de etanol al 50%. Estos se utilizarán para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes. Posteriormente, tome de manera similar la primera mitad de la colonia tratada con D-lisina y colóquela en PBS.

Luego, tome la segunda mitad de esta colonia y transfiérala al etanol. Incubar todos los tubos que contienen las mitades del biofilm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y luego, centrifugarlos durante cinco minutos a 18.000 veces g.

Con una pipeta, retire con cuidado el sobrenadante. Agregue 300 microlitros de PBS y luego sonique las celdas a un ajuste bajo, con un sonicador de micropunta. Agregue 700 microlitros adicionales de PBS para un volumen final de un mililitro.

A continuación, realice una dilución en serie de 10 a menos siete en PBS. Tome 100 microlitros de una de las diluciones e inocule una placa de Agar LB al 1,5%. Repita este paso para otras dos diluciones por muestra.

Extienda el inóculo con perlas de vidrio y luego incube las placas durante la noche a 30 grados centígrados. Examine las placas y cuente las unidades formadoras de colonias, o UFC. Después de calcular el valor de UFC por mililitro, calcule el porcentaje de sobrevivientes en los tratamientos con PBS en comparación con el etanol.

Para comenzar la fijación de la muestra, primero prepare suficiente solución fijadora fresca para el número deseado de colonias de biopelícula. Agregue con cuidado cinco mililitros de fijador a cada placa de Petri y evite pipetear directamente sobre las colonias. Las colonias comenzarán a desprenderse del agar y a flotar.

Selle cuidadosamente las placas con parafilm e incube en un agitador giratorio durante dos horas a temperatura ambiente. Transfiera las placas a cuatro grados centígrados para almacenarlas durante la noche. Retire suavemente el líquido fijador con una pipeta Pasteur, conectada a una aspiradora.

Agregue 10 mililitros de cacodilato de sodio de 100 nanomolares, tampón de cloruro de calcio de cinco milimolares para lavar la biopelícula e incube durante cinco minutos. Separe con cuidado el centro de la colonia de biofilm de la placa de agar con una pipeta Pasteur. Para secar las colonias al aire, corte el papel de filtro de celulosa en cuartos y luego sumerja una sección en etanol al 100%.

Transfiera con cuidado una colonia de biopelícula flotante al papel. Coloque el papel en una placa de Petri forrada con papel de filtro seco. Luego, cubre el plato y déjalo secar en una campana química durante la noche.

Con el fin de preservar la morfología de la colonia de biopelícula, es importante recubrir completamente la biopelícula flotante con el papel de celulosa. Una vez en el papel, la biopelícula no se puede reajustar. Cubra un trozo de microscopía electrónica con cinta de carbón y luego use pinzas para transferir cuidadosamente las colonias de biopelícula al talón.

Después de conectar cada colonia al talón, agregando un puente delgado de cinta de carbón, guarde los talones en un desecador durante 24 horas o hasta que los necesite. Este paso requiere una mano firme y precisa, porque en esta etapa las biopelículas son muy frágiles y se fracturan fácilmente. El reto consiste en montar una parte sustancial del biofilm sin grietas.

El día del examen, coloque las colonias en un recubridor de pulverización catódica de oro y paladio. Cubra las muestras durante dos minutos en un ángulo de 60 grados. Repita este paso dos veces, girando las muestras 120 grados entre ellas.

Finalmente, cubra las muestras una vez durante tres minutos desde la parte superior. Las muestras ya están listas para la obtención de imágenes en el SEM. Estas imágenes muestran la formación pelicular de B. subtilis cultivada en medio MSgg inductor de biopelícula.

Con la adición de la pequeña molécula inhibidora D-lisina, se reduce el desarrollo de la película. Y a medida que aumenta la concentración del inhibidor, la formación de películas muestra una disminución correlativa. Este gráfico muestra el efecto de la exposición al etanol en la supervivencia de las células dentro de las colonias de biopelícula, tratadas con un inhibidor de la D-lisina o sin tratar.

Las colonias tratadas con D-lisina y expuestas a etanol al 50% durante 10 minutos mostraron una reducción drástica de la supervivencia en comparación con la fracción no tratada. Las imágenes binoculares de arriba hacia abajo muestran que las colonias cultivadas en presencia de D-lisina eran más pequeñas en general y formaban arrugas menos pronunciadas que las que no se trataban. Las imágenes de microscopio electrónico de barrido de colonias de biopelícula seca de punto crítico revelan aún más el desarrollo alterado de la biopelícula.

La matriz de sustancias poliméricas extracelulares, o EPS, se parecía más a una telaraña en las muestras no tratadas, y las muestras tratadas mostraban menos organización. Finalmente, el examen de la resolución de las células bacterianas individuales muestra que las células tratadas tienen un aspecto alargado, menos cubiertas de EPS y no están tan estrechamente conectadas con sus vecinas como las células no tratadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que establecer un marco coherente para estudiar los inhibidores de la biopelícula es esencial para obtener resultados reproducibles.

Una vez dominado, se puede realizar una detección de moléculas pequeñas para la inhibición de la biopelícula en menos de una semana si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la investigación de la expresión génica en células de biopelícula individuales, para obtener información adicional sobre el objetivo del inhibidor de molécula pequeña. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar el efecto general de inhibidores específicos de la biopelícula en el desarrollo de la biopelícula y la resistencia a los antibióticos.