Name: Metodologías para el estudio B. subtilis Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda metodologías reproducibles para estudiar inhibidores de biopelículas en Bacillus subtilis. Estas técnicas permiten evaluar efectos de moléculas pequeñas y comprender mecanismos de acción con resolución de célula individual.

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Las imágenes de microscopio electrónico se llevaron a cabo en la Unidad de Microscopía Electrónica del Instituto Weizmann de Ciencias, con el apoyo en parte del Centro Irving y Cherna Moskowitz para Imágenes Nano y Bio-Nano. Esta investigación también fue apoyada por la beca ISF I-CORE 152/1, el Sr. y la Sra. Dan Kane, la Sra. Lois Rosen, por una beca de investigación Yeda-Sela, por la Fundación Benéfica Larson, por el Programa de Becarios Ruth y Herman Albert para Nuevos Científicos, por el Instituto Ilse Katz para Ciencias de los Materiales y la Investigación en Resonancia Magnética, por la subvención del Ministerio de Salud para métodos de investigación alternativos, y por el Programa de Investigación Francia-Israel Cooperación - Maimónido-Israel. IKG es beneficiario de la Cátedra de Desarrollo Profesional Rowland y Sylvia.

1. Evaluar el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas en Pellicle y la formación de biopelículas Colonia <ol><li> Preparar una solución 2x de medio de 25 MSgg biofilm inductor definido sin el cloruro de calcio y de hierro (III) hexahidrato de cloruro. Después de la esterilización del filtro, añadir el cloruro de calcio. El medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Preparar la dilución 1x MSgg en el día del experimento. <ol><li> Diluir el medio 2x MSgg a 1x con agua destilada estéril (unas películas) o (80 ° C) de 3% agar caliente estéril (biofilms) y añadir de hierro (III) hexahidrato de cloruro a una concentración final de 50 mM (unas películas) o 250 mm ( biofilms). Añadir antibióticos o inhibidores de moléculas pequeñas a la concentración deseada y se mezcla bien. Por ejemplo, para obtener una concentración final de 0,5 mM D-leucina en 30 ml de establecer unas películas o biofilms, agregar 196,6 l de un 76,3 mM (10 mg / ml) solución madre de D-leucina. NOTE:. La composición final 1x MSgg se describe en la Tabla 1 en comparación con la receta original 25, el medio contenía 50 mg / ml treonina y la concentración de hierro para crecer colonias de biopelícula en medio MSgg sólido se incrementó 2,5 veces para optimizar la morfología de las colonias arrugada . </li></ol></li><li> Después de la solidificación del agar, se secan las placas MSgg sólidos en una campana biológica de 30 a 45 min antes de la inoculación. </li><li> Para seleccionar inhibidores específicos que interfieren con los mecanismos de formación de película (Figura 1), descartan que las concentraciones utilizadas afectan planctónicas y el crecimiento estática. <ol><li> Determinar el crecimiento planctónicas (aumento de la densidad óptica con el tiempo en cultivo líquido) en una curva de crecimiento sencilla mediante la medición de la densidad óptica a 600 nm cada hora hasta que la fase de crecimiento estacionario. </li><li> Para confirmar que la turbidez del cultivo medido representa el recuento de células vivas, determinar el número de unidades formadoras de colonias (CFU)de las células en la fase de crecimiento planctónicas de un cultivo en agitación después de varios puntos de tiempo. </li><li> Para evaluar el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en el crecimiento película estática, las células de la cosecha al final de una incubación de 3 días a 23 ° C a partir de una de 24 pocillos de cultivo celular bien, se inocularon en las mismas condiciones como se describe en las secciones 1,7-1,9 y determinar la CFU. Para este control, utilizar una cepa deficiente en película que carece de los operones que codifican para los componentes de la matriz extracelular (es decir, B. subtilis Δ EpsH, Δ TASA). NOTA: Esta cepa es capaz de crecer en condiciones estáticas, pero en contraste con un tipo salvaje de formación de película-, es deficiente en la capacidad de flotar a la interfaz aire-líquido, donde el crecimiento es favorecido debido al aumento de los niveles de oxígeno 26. Por lo tanto, esta Matriz extracelular y la tensión película es deficiente en una cepa de referencia recomendado para evaluar el crecimiento en condiciones estáticas. NOTA: Para el ex específicaamplia de la D-amino ácido D-leucina no canónica describe a continuación, un efecto sobre el crecimiento del plancton y estática en concentraciones que interferían con la formación de película se descartó 12,17. Los métodos para determinar planctónicas y el crecimiento estática se describen en detalle 17. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general conceptual para la identificación de una configuración experimental sólida para evaluar la inhibición específica de la formación de biopelículas. Criterios de selección de inhibidores de moléculas pequeñas que indican interferencia específica con la formación de biopelículas sin efecto pronunciado sobre el crecimiento del plancton. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <ol start="5"><li> Consecutivas a cabo B. subtilis de una reserva de C -80 ° (LB culture de 10 9 células / ml congelados en glicerol al 20%) para aislar colonias individuales sobre una placa de agar LB-1,5% con una punta estéril o aplicador. </li><li> Crecer durante la noche a 30 ° C. </li><li> Paso crítico: Para una inhibición película sólida por los D-aminoácidos no canónica tales como D-leucina, crecer una sola colonia recogió de la placa de agar LB-1.5% en 3 ml de caldo LB a 37 ° C durante 4 horas en una sacudiendo incubadora (velocidad de agitación 200 rpm). Reemplazar el caldo LB con medio MSgg biofilm inductor antes de la inoculación mediante la centrifugación de cultivo 1,5 ml de arranque durante 4 minutos a 6.000 xg, eliminando cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1,5 ml de medio MSgg. El resto de la cultura puede ser desechada. Importante: Para garantizar la robustez del sistema, la densidad óptica a 600 nm (OD 600) del cultivo iniciador se lavó debe estar entre 0,6 y 1. </li><li> Durante el crecimiento del cultivo iniciador, preparar una placa de cultivo celular multiplaca de 12 pocillos containinG 3 ml de medio de MSgg sin o con un rango de concentración del inhibidor de molécula pequeña (por ejemplo, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Para descartar los efectos de borde, distribuir la ubicación de las diferentes concentraciones a través de la placa de multiplaca. Alternativamente, utilizar de 24 pocillos de cultivo celular placas multiplaca que contienen 1,5 ml de medio de MSgg. </li><li> Inocular los pocillos de la placa multiplaca de cultivo celular de 12 pocillos con 3 l de cultivo iniciador se lavó (dilución 1: 1000). NOTA: una relación de dilución inferior, es decir, 1: 500 puede ser utilizado. Esto disminuye el tiempo de desarrollo de las unas películas. </li><li> Cultivar las unas películas a 23 ° C bajo condiciones estáticas durante tres días. No mueva las unas películas durante este tiempo, ya que puede afectar a la morfología de la superficie final de la película. </li><li> Adquirir imágenes con una exposición binocular y homogénea de un rayo. Como alternativa, tomar una imagen de las unas películas con una cámara de alta resolución. Para evitar artefactos causados ​​por inconsisángulos y sombras luz de la tienda, toman de arriba hacia abajo imágenes con la cámara fija en un trípode y el uso de una fuente de luz suave y grande a 45 ° de ambos lados. NOTA: Un método alternativo para estudiar B. subtilis pluricelularidad es el ensayo de colonias de biopelícula en medio sólido, biofilm inductor MSgg. Al igual que unas películas, este ensayo permite el estudio de los procesos espacio-temporales. Una vez que se determina el intervalo activo de los inhibidores de molécula pequeña, su efecto sobre la formación de colonias biofilm puede ser estudiado. </li><li> Para crecer colonias de biopelícula, simétricamente detectar 1,5 l de la pre-cultivo sin lavar (Paso 1.7) en la placa de agar 1,5% MSgg seca con la ayuda de una plantilla - 4 gotas por placa Petri de diámetro de 8,5 cm. Deje que las gotas se adsorben a la placa antes de moverlos. NOTA: La plantilla de ayuda a conseguir una distribución equitativa de las colonias de biofilm dentro del área donde se cultivan las células. Para preparar la plantilla, dibujar la superficie total del crecimiento en las escalas originales, dividirlo a la igualdad de sectaORS y marque el centro. Para un plato redondo Petri de 8,5 cm de diámetro, este asigna 14 cm 2 a una colonia biofilm. </li><li> Incubar las placas a 30 ° C durante tres días. Durante este tiempo, las colonias de biopelículas se desarrollan y forman una estructura tridimensional, arrugada. </li><li> Tomar fotografías como en el paso 1.11. </li></ol> 2. El etanol Ensayo de Resistencia <ol><li> Crecer biopelículas como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Después de 68 h de crecimiento a 30 ° C, cortar las colonias de biopelículas en dos partes iguales con la ayuda de una cuchilla de afeitar y la plantilla. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Ejemplo de diseño experimental para evaluar la resistencia de las células de colonias de biopelículas de agentes esterilizantes. Plantilla (A) utilizada para la distribución equitativa de las colonias de biopelícula a través de una placa de Petri y para el corte. (B)las imágenes de arriba hacia abajo sin tratar de biopelícula de tipo salvaje cultivadas durante 68 horas en un medio sólido, definido biopelícula que inducen MSgg a 30 ° C. La ampliación muestra cómo una colonia de biopelículas se puede cortar en dos mitades iguales. (C) Las dos mitades iguales biopelículas son tratados por igual (control, PBS) o con PBS o agente esterilizante y se procesa como se ha descrito. Barra de escala:. 1 cm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Levante con cuidado cada mitad de la colonia de la biopelícula de la placa de agar con una pequeña espátula y moverlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Si es necesario, raspar las células restantes de la placa y transferirlos al tubo de microcentrífuga también. NOTA: El segundo medio de la colonia biofilm se trata diferencialmente, dependiendo de si es el control o para probar la resistencia a la Steriagentes Lizing. </li><li> Para el control, se incuba la segunda mitad de la colonia de biopelículas en 500 l de PBS como en el paso 2.3. Para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes, transferir la segunda mitad de la colonia biopelícula a 500 l 50% (v / v) de etanol. NOTA: Alternative esterilización agentes tales como el hipoclorito de sodio se puede utilizar. Para todos los agentes de esterilización utilizados, determinar la concentración y tiempo de incubación activo en un experimento preliminar. </li><li> Incubar las colonias de biofilm por 10 min en el banco-tapa a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las colonias biofilm durante 5 minutos a 18.000 xg y retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Añadir 300 l de PBS. </li><li> Sonicar las células ligeramente (amplitud 10%, pulso 5 seg), con la micropunta de un aparato de ultrasonidos. NOTA: La energía de ultrasonidos debe ser suficiente para los agregados de biopelícula separadas. Sin embargo, demasiado duro sonicación puede lisar las células. Confirmar con antelación por microscopía de luz que la energía de ultrasonidosutilizadas no lisar las células y que todos los agregados se disuelven. </li><li> Añadir 700 l de PBS a un volumen final de 1 ml. Realizar una dilución en serie (a 10 -7) en PBS y se extendió 100 l de 3 diluciones en una placa de agar LB 1.5%-usando perlas de vidrio estériles. NOTA: Las diluciones óptimas para ser plateado debe determinarse en un experimento preliminar, ya que esto depende de la cantidad de células en la colonia biofilm de interés y la tasa de supervivencia de las células en respuesta al agente de esterilización. </li><li> Incubar las placas durante la noche a 30 ° C, contar el CFU y determinar CFU / ml. Desde el final de UFC / ml de cada una de las colonias de la mitad de la biopelícula, se calcula el porcentaje de supervivientes. NOTA: Cuando se realiza y se analizaron como se ha descrito, las dos mitades de la colonia de control de la biopelícula y el no tratado frente a un medio de etanol-tratada de la colonia de la biopelícula no tratada debe producir diferencias a continuación 10% en los recuentos de células viables, la verificación de la simetría o la resistencia de la colonia , respectively. Alternativamente, los resultados pueden ser representados en total CFU. Los recuentos de células de control y colonia biofilm sin tratar deben permanecer en el mismo orden de magnitud. Por el contrario, se espera que los recuentos de células de la mitad tratados con etanol de una pequeña colonia de biopelículas molécula tratados de pasar por un mínimo de dos órdenes de magnitud a reclamar por un aumento de la sensibilidad al agente esterilizante. </li></ol> 3. El biofilm colonia Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido <ol><li> Crecer colonias de biopelícula como se describe en los pasos 1,1-1,7 y 1.12-1.14. </li><li> Preparar un nuevo lote de 2% (v / v) de glutaraldehido, 3% (v / v) de solución de paraformaldehído en cacodilato de sodio 100 mM, 5 mM de tampón de cloruro de calcio, pH 7,3. Preparar 5 ml de fijador para cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro. PRECAUCIÓN: glutaraldehído y paraformaldehído son peligrosos. Manejarlos con el equipo de seguridad dentro de una campana química. Descartar las soluciones y los materiales contaminados a la ZACresiduos peligrosos. </li><li> añadir con cuidado el fijador a las colonias de biopelícula, sin dispensar directamente en la parte superior de las biopelículas. NOTA: Debido al carácter hidrófobo de la colonia biofilm, las colonias se desprenden lentamente del agar y comienzan a flotar. </li><li> sellar cuidadosamente las placas con una tira de Parafilm. Incubar en un agitador rotatorio durante 2 horas a temperatura ambiente y, posteriormente, transferir las placas a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, retire con cuidado el líquido con una pipeta Pasteur de vidrio conectado a una bomba de vacío. </li><li> Añadir cuidadosamente 10 ml 100 mM de cacodilato de sodio, tampón de cloruro de calcio 5 mM para lavar el biofilm y se incuba durante 5 min. Retire con cuidado el líquido con la pipeta Pasteur de vidrio desde la esquina de la placa para evitar dañar la biopelícula y añadir solución de lavado fresca por pipeteo suave. Repita este paso una vez. </li><li> Para la deshidratación de las colonias de biopelícula, continúe con los siguientes pasos: 2x 5 min en ddH2O; 2x 20 min en 30% de etanol; 2x 20 min en 50% de etanol; 2x 20 min en 70% de etanol; 2x 20 min en 96% de etanol; 2x 30 min en 100% de etanol. <ol><li> Añadir 15 ml de líquido por cada placa de Petri de 8,5 cm de diámetro en cada paso y eliminar el líquido cuidadosamente después de cada incubación. </li></ol></li><li> Utilizar uno de dos métodos diferentes para el secado de las muestras en etanol. <ol><li> Para el secado al aire a partir de etanol: <ol><li> Cortar un papel de filtro de celulosa (diámetro de 9 cm) en cuartos. Brevemente sumergir una cuarta parte en etanol al 100%, y luego transferir cuidadosamente una colonia flotante de biopelículas en la misma. Ponga el papel de filtro húmedo en una placa de Petri forrada con un papel de filtro. Cubrir la placa de Petri y dejar que las colonias biofilm secar durante la noche en una campana química. </li></ol></li><li> Por punto crítico (CP) SECADO utilizando dióxido de carbono (CO 2) como fluido de transición: <ol><li> Llenar 75% de la cámara de la máquina punto de secado crítico con 100% de etanol. La transferencia de las muestras en un soporte, cada muestra en su propia cHamber. Si es necesario, cortar el biofilm con tijeras en trozos más pequeños. Deje las muestras sumergidas en etanol durante toda la manipulación. A continuación, transferir el soporte en la cámara y cerrar la cámara herméticamente. </li><li> Se enfría la cámara a 7 ° C y empezar a agitar. Llenar la cámara completamente con CO2 líquido. Durante un tiempo de incubación de 7 minutos, dejar que la mezcla de etanol con el CO 2. A continuación, la descarga 25% de la solución. NOTA: No vaciar la cámara por debajo del nivel de la muestra. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cuatro veces. </li><li> Repita el paso 3.8.2.2 cinco veces con un tiempo de incubación de tan sólo 5 min. Finalmente, el etanol debe ser completamente sustituido por CO 2. </li><li> Durante la última ronda, vacío sólo el 5% de la cámara. Apagar la agitación y el enfriamiento. Iniciar el calentamiento de la cámara a 42 ° C. A una temperatura de 31,1 ° C y una presión de 73,9 bar, el CO2 líquido alcanza su punto crítico, el estado en el que el pH gaseosaASE tiene la misma densidad que la fase líquida del disolvente 27. Una vez que la temperatura alcanza 42 ° C, se incuba durante 10 min. A 42 ° C, las emisiones de CO 2 en la cámara existe como gas supercrítico. NOTA: comprobar constantemente la presión de la cámara. La presión no debe superar los 120 bar a 42 ° C. </li><li> Comience lentamente para liberar el gas con calentamiento continuo. Esto mantiene las muestras en la fase de CO 2 -gas y previene la deformación de la morfología de la muestra a través de la tensión superficial del líquido. Ajuste el medidor de flujo a 5 L / hr por el ajuste fino de la válvula dosificadora controlar el medidor de caudal. Espere hasta que se suelta el que toda la presión en la cámara. Ahora abre la cámara y retirar las muestras cuidadosamente del soporte. </li></ol></li></ol></li><li> Escudo una microscopía electrónica de talón con cinta de carbono. Con la ayuda de pinzas, transferir cuidadosamente las colonias biofilm sobre el trozo. Conectar cada colonia para el talón mediante la adición de un delgado puente de cocheBon cinta, que es crucial para la eliminación de carga bajo el haz de electrones. En esta etapa, manejar las colonias de biopelícula con cuidado, ya que son muy frágiles. Almacenar las muestras en un desecador durante al menos 24 horas o hasta que el examen. </li><li> El día del examen con el microscopio electrónico de barrido, por pulverización catódica-capa de las colonias de biopelícula para 2 min en un ángulo de 60 ° en un oro-paladio por bombardeo iónico revestidor. Repita este paso dos veces y girar las muestras en 120 ° en el medio. Al final, por pulverización catódica abrigo de las muestras una vez durante 3 minutos desde la parte superior. La capa delgada 20 nm de oro-paladio mejora la conductividad y mejora el contraste de la muestra para la formación de imágenes en el SEM. </li><li> Almacenar las muestras en un desecador para evitar la rehidratación de la muestra 28 hasta la formación de imágenes con un microscopio electrónico de barrido 29,30. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Bacillus subtilis formas robustas y altamente estructurados biopelículas tanto en estado líquido (unas películas) y en medio sólido (colonias). Por lo tanto, sirve como un organismo modelo ideal para caracterizar el modo de acción de los inhibidores de biopelículas específicas. En medio sólido, las células forman estructuras multicelulares con rasgos distintivos que no son evidentes en unas películas, como las arrugas que irradian desde el centro hasta el borde. Por lo tanto, unas películas y las colonias son s...

comunidades bacterianas multicelulares juegan un papel importante en entornos naturales y antropogénicos, y pueden ser beneficiosos o perjudiciales altamente. Estas colonias multicelulares se conocen como las biopelículas, en donde las células individuales están incrustadas en un (EPS) matriz de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia. Los EPS se adhieren fuertemente a las células a la superficie que colonizan. Ellos sirven como un escudo contra las fuerzas mecánicas y químicas y crean un estrecho contacto entre las células vecinas, lo que facilita la comunicación celular 1. Una biopelícula puede ser vista como una comunidad diferenciada, donde las células uso altamente regulados, procesos orquestada para coordinar sus actividades dentro de la comunidad, así como en todas las especies 2-5. La transición de un planctónicas, el modo de vida libre de crecimiento a un estado de biopelícula se asocia a menudo con los procesos de desarrollo. Un buen ejemplo es la bacteria del suelo Bacillus subtilis Gram-positivas, y por lo tanto, una undomecepa sticated sirve como un modelo sólido organismo para estudiar las etapas de desarrollo que conducen a la formación de biopelículas. En esta bacteria, células móviles se organizan en estructuras multicelulares visibles que llevan a cabo tareas especializadas 4. Un grupo de células, la matriz-productores secretan exopolisacáridos 6, la proteína amiloide TASA 7,8, y la proteína de hidrofobicidad de la superficie BSLA 9,10; todos los cuales participan en el montaje de las EPS 11-13. Dada la abundancia de biopelículas en nichos naturales y antropogénicos y el daño fatal putativa que pueden causar, hay una necesidad urgente de encontrar formas de prevenir su formación. inhibidores de moléculas pequeñas pueden ayudar en el descubrimiento de nuevas rutas reguladoras, enzimas y proteínas estructurales que participan en la formación de biopelículas, y por lo tanto promover puntos de vista en los complejos procesos de montaje comunidad multicelular. Como B. subtilis es un modelo bien estudiado para bioformación de película 14,15, que puede ser utilizado para evaluar los efectos de varios inhibidores de biopelículas. Este estudio fuerza a cuatro métodos fundamentales que son clave para evaluar la respuesta de las biopelículas a los inhibidores de moléculas pequeñas. En primer lugar, para asegurar que estos inhibidores tienen un objetivo del biofilm específica, la separación del efecto sobre el crecimiento planctónicas del efecto sobre la formación de biopelículas es crítica. La mayoría de los agentes antibacterianos dirigen a las células en su fase de crecimiento del plancton, pero las moléculas que se dirigen a la forma de vida de biopelículas son raros. Adicionalmente, como moléculas que no afectan el crecimiento planctónica no son tóxicos, pueden reducir la presión selectiva que favorece mutantes resistentes a los antibióticos 16. Por ejemplo, cuando biofilms se tratan con D-aminoácidos o ciertas otras moléculas pared interferir celular, o bien son perturbados o desmontados, pero estos inhibidores sólo afectan ligeramente 12,17 crecimiento planctónicas. Por el contrario, muchos antibióticos alteran dramáticamente el crecimiento del plancton, con little o ningún efecto sobre la formación de biopelículas 17. En segundo lugar, se establece un marco experimental consistente y robusta para estudiar el efecto de las moléculas pequeñas es crucial. Hemos observado que el intervalo de concentración activa de inhibidores de moléculas pequeñas era sensible a las condiciones de pre-cultivo y para la configuración experimental utilizada para estudiar el efecto de estos inhibidores de molécula pequeña. Varios informes, en particular los que estudian B. subtilis, reveló variaciones en el rango de concentración en la que D-aminoácidos inhiben la formación de unas películas - las biopelículas bacterianas flotantes 12,17-19. Los resultados presentados aquí sugieren que los siguientes factores explican las diferencias en el rango de concentración activa: las condiciones de pre-cultivo (12,17 logarítmica frente fase de crecimiento del 20-estacionaria tardía), el medio de cultivo utilizado en la condición de pre-cultivo (rico, indefinido [caldo Luria, LB] frente define [glutamato monosódicoglicerol, MSgg]), la relación de la inoculación y, especialmente, la eliminación del medio de pre-cultivo antes de la inoculación. La temperatura de crecimiento de película estática mostró un papel menos importante en la gama de actividad de la inhibidor de molécula pequeña D-leucina, un ácido D-amino representativo utilizado en este estudio. Por último, una vez que las biopelículas son tratados con inhibidores específicos de biopelícula, se requieren métodos robustos e informativas para caracterizar los efectos de estos inhibidores sobre la aptitud de biopelículas. Aquí, se describen dos métodos para caracterizar de forma independiente el efecto de inhibidores de moléculas pequeñas en detalle: (1) El efecto sobre las células individuales dentro de una colonia biofilm y su resistencia a los agentes antimicrobianos. Las células en las biopelículas son típicamente más resistentes a los antibióticos en comparación con bacterias de vida libre 21-23. Aunque este fenómeno es multifactorial, la capacidad de los EPS para reducir la penetración de antibióticos se considera a menudo como una explicación atractiva 24 </sup&gt;. Este método evalúa la supervivencia de las células del biofilm preestablecidos después de la exposición a las sustancias antibacterianas. (2) El efecto sobre la arquitectura colonia biofilm, de la gran a la pequeña escala. colonias Biofilm se caracterizan por su estructura tridimensional y la presencia de los EPS. Utilizando microscopía electrónica de barrido, los cambios en la morfología celular, estructura colonia biofilm y la arquitectura y la abundancia de los EPS se pueden visualizar desde la grande (mm) a la pequeña escala (micras).

<table><tbody><tr><td>Caldo Luria, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potasio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potasio dibásico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)ácido propanosulfónico</td><td>Fisher Scientific, 209,27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio hexahidratado&nbsp;</td><td>Merck, 203,30 g/mol;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio anhidro</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de manganeso (II) tetrahidratado</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de hierro (III) hexahidratado&nbsp;</td><td>Sigma, 270,30 g/mes)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de zinc anhidro&nbsp;</td><td>Acros Organics, 136,29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de tiamina</td><td>Sigma, 337,27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-triptófano</td><td>Fisher Scientific, 204,1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma, 165,19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma, 119,12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerol anhidro</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>sales monosódicas de ácido L-glutámico hidrato&nbsp;</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucina</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>etanol anhidro</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr> hoja <tr><td>de afeitar</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td>papeles de</tr><tr><td>filtro de celulosa circular</td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehído</td><td>EMS (Electronic Micoscopy Science), 25% en agua</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído&nbsp;</td><td>EMS, 16% en agua</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato de sodio</td><td>Merck, 214,05 g/mol&nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio 2-hidrato</td><td>Merck, 147.02 g/mol&nbsp;</td><td></td><td></td>1172113</tr><tr><td>soporte de aluminio</td><td>EMS, cabeza ranurada</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>cinta adhesiva de carbono</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &deg; C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Centrífuga de mesa Eppendorf 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador digital, modelo 250, utilizado con Microtip de doble paso</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 30 &deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 23 &deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, 500 ml, poliestireno</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Secador de punto crítico</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido ambiental</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologías para el estudio<em&gt; b. subtilis</em&gt; las biopelículas como modelo para la caracterización de pequeño biofilm inhibidores de moléculas

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Este trabajo evalúa diferentes metodologías para estudiar el impacto de los inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas, como los D-aminoácidos, en el desarrollo y la resiliencia de las biopelículas de Bacillus subtilis. En primer lugar, se presentan métodos que seleccionan inhibidores de moléculas pequeñas con objetivos específicos de biopelícula con el fin de separar el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas sobre el crecimiento planctónico de su efecto sobre la formación de biopelículas. A continuación, nos centramos en cómo las condiciones de inoculación afectan a la sensibilidad de los cultivos multicelulares flotantes de B. subtilis a los inhibidores de moléculas pequeñas. Los resultados sugieren que las discrepancias en los efectos reportados de tales inhibidores, como los D-aminoácidos, se deben a condiciones inconsistentes antes del cultivo. Además, se describe un protocolo desarrollado recientemente para evaluar la contribución de los tratamientos con moléculas pequeñas a la resistencia de los biofilms a sustancias antibacterianas. Por último, se presentan las técnicas de microscopía electrónica de barrido (SEM) para analizar la disposición espacial tridimensional de las células y su matriz extracelular circundante en un biofilm de B. subtilis. SEM facilita la comprensión de la arquitectura tridimensional de la biopelícula y la textura de la matriz. Una combinación de los métodos descritos aquí puede ser de gran ayuda para el estudio del desarrollo de biopelículas en presencia y ausencia de inhibidores de biopelículas, y arrojar luz sobre el mecanismo de acción de estos inhibidores.

El ensayo de película es un método para estudiar los procesos altamente regulados y dinámicas de B. pluricelularidad subtilis. Además de esto, el ensayo de película es adecuado para ensayar una serie de cualquiera de las condiciones pre-arranque o pequeñas concentraciones de moléculas en una placa única multiplaca de cultivo celular en un experimento. Sin embargo, B. formación de película subtilis es sensible a las condiciones de pre-cultivo (por ejemplo, medio de crecimiento...

Este estudio presenta el desarrollo de metodologías reproducibles para estudiar los inhibidores de biopelículas y sus efectos sobre la multicelularidad de Bacillus subtilis.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Los biofilms bacterianos son importantes para la salud humana, ya que protegen a las bacterias que los habitan frente a agresiones ambientales y agentes antimicrobianos. El objetivo de este procedimiento fue desarrollar un sistema modelo para evaluar los efectos de inhibidores de moléculas pequeñas sobre la formación de biofilms. Estos métodos pueden ayudar a establecer un conjunto de herramientas esencial para el campo de los biofilms, con el fin de seleccionar inhibidores de moléculas pequeñas que especifiquen como diana la formación de biofilms.La principal ventaja de estas metodologías es que parten de un marco experimental consistente y robusto, y proporcionan información cuantitativa y cualitativa sobre el mecanismo de acción de inhibidores específicos de biopelículas. Aunque estos métodos pueden ofrecer información sobre las biopelículas de Bacillus subtilis, también pueden aplicarse a otras bacterias formadoras de biopelículas, como Pseudomonas aeruginosa o el patógeno vegetal Xanthomonas citri. La microscopía electrónica de barrido puede ser esencial para analizar el efecto de moléculas pequeñas sobre la formación de biopelículas, ya que permite la observación de la matriz extracelular y ofrece resolución a nivel celular.Para comenzar, seleccione primero una colonia individual adecuada y transfiérala a tres mililitros de caldo LB. Coloque este cultivo inicial en un incubador con agitación durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Tras la incubación, tome 1,5 mililitros del cultivo inicial y centrifugue durante cuatro minutos.Retire cuidadosamente el sobrenadante y luego resuspenda el precipitado en 1,5 mililitros de medio MSgg. Para cultivar películas, prepare una placa de cultivo celular de 12 pocillos añadiendo tres mililitros de MSgg a cada pocillo. A algunos de estos pocillos, añádales MSgg con un inhibidor de molécula pequeña en un rango de concentración, distribuyendo la ubicación de las diferentes concentraciones alrededor del recipiente, para evitar efectos de borde.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros de la cultura inicial re-suspendida. La cultura debe estar entre 0,6 y uno. Esto es crítico para la robustez del sistema.Inocule cada pocillo de la placa de cultivo con 3 microlitros de la suspensión inicial reconstituida. A continuación, incube la placa a 23 grados Celsius durante tres días en condiciones estáticas. Posteriormente, retire la placa del incubador y observe las películas.Para cultivar biopelículas, utilice una plantilla y coloque simétricamente cuatro gotas separadas de 1,5 microlitros de cultivo inicial sin lavar sobre una placa de Agar MSgg seca de 8,5 centímetros con una concentración del 1,5%. Deje que las gotas se absorban en el medio antes de mover la placa. Incube las placas a 30 grados Celsius durante tres días.Utilizando un binocular con exposición homogénea de iluminación, verifique que las colonias de biopelícula se hayan desarrollado y formado una estructura tridimensional arrugada. Primero, tome una cuchilla de afeitar limpia y corte las colonias de biopelícula en dos partes iguales con la ayuda de la plantilla. Levante cuidadosamente una mitad de la colonia con una espátula limpia y transfiérala a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de PBS.Tome la segunda mitad de la colonia y transfiérala a un tubo de microcentrifugado que contenga 500 microlitros de etanol al 50%. Estos se utilizarán para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes. Posteriormente, tome de forma similar la primera mitad de la colonia tratada con D-lisina y colóquela en PBS.Luego, tome la segunda mitad de esta colonia y transfiera al etanol. Incube todos los tubos que contienen las mitades del biofilm durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifúgelos durante cinco minutos a 18.000 × g.Utilizando una pipeta, retire cuidadosamente el sobrenadante. Añada 300 microlitros de PBS y luego someta las células a sonicación con un sonificador con microsonda en un ajuste bajo. Añada un volumen adicional de 700 microlitros de PBS para obtener un volumen final de un mililitro.A continuación, realice una dilución seriada de 10 a la menos siete en PBS. Tome 100 microlitros de una de las diluciones e inocule una placa de LB con agar al 1,5 %. Repita este paso para otras dos diluciones por muestra.Extender el inóculo utilizando perlas de vidrio y luego incubar las placas durante la noche a 30 grados Celsius. Examinar las placas y contar las unidades formadoras de colonias, o UFC. Después de calcular el valor de UFC por mililitro, determinar el porcentaje de supervivientes en los tratamientos con PBS frente a etanol.Para comenzar la fijación de la muestra, prepare primero suficiente solución fijadora fresca para el número deseado de colonias de biopelícula. Añada cuidadosamente cinco mililitros de fijador a cada placa de Petri, evitando pipetear directamente sobre las colonias. Las colonias comenzarán a desprenderse del agar y flotarán. Cierre cuidadosamente las placas con parafilm e incube en un agitador rotatorio durante dos horas a temperatura ambiente. Transfiera las placas a almacenamiento a cuatro grados Celsius durante la noche. Retire suavemente el líquido fijador con una pipeta de Pasteur conectada a un vacío.Añada 10 mililitros de cacodilato de sodio 100 nanomolar, tampón de cloruro de calcio 5 milimolar para lavar el biofilm e incube durante cinco minutos. Desprenda cuidadosamente el centro de la colonia de biofilm desde la placa de Agar con una pipeta de Pasteur. Para secar al aire las colonias, corte papel de filtro de celulosa en cuartos y luego sumerja una sección en etanol al 100%.Transfiera cuidadosamente una colonia de biopelícula flotante sobre el papel. Coloque el papel en una placa de Petri forrada con papel de filtro seco. Luego, tápela y déjela secar durante la noche en una campana química.Para preservar la morfología de la colonia de biopelícula, es importante cubrir completamente la biopelícula flotante con el papel de celulosa. Una vez sobre el papel, no se puede volver a ajustar la biopelícula. Recubra un soporte para microscopía electrónica con cinta de carbono y luego use pinzas para transferir cuidadosamente las colonias de biopelícula al soporte.Después de conectar cada colonia al soporte, agregando un puente delgado de cinta de carbono, guarde los soportes en un desecador durante 24 horas o hasta que sean necesarios. Este paso requiere una mano firme y precisa, ya que en esta etapa los biofilms son muy frágiles y se fracturan fácilmente. El desafío consiste en montar una parte considerable del biofilm sin grietas.El día del examen, coloque las colonias en un cubriente de oro-paladio por pulverización catódica. Cubra las muestras durante dos minutos a un ángulo de 60 grados. Repita este paso dos veces, rotando las muestras 120 grados entre cada paso.Finalmente, cubra las muestras una vez durante tres minutos desde la parte superior. Las muestras ya están listas para su observación en el MEB. Estas imágenes muestran la formación de películas de B.subtilis cultivado en medio MSgg que induce biofilm.Con la adición del inhibidor de molécula pequeña D-lisina, el desarrollo de la película superficial se reduce. Y a medida que aumenta la concentración del inhibidor, la formación de la película muestra una disminución correlacionada. Esta gráfica muestra el efecto de la exposición al etanol sobre la supervivencia de las células dentro de colonias de biopelículas, tratadas con un inhibidor de D-lisina o sin tratar.Las colonias tratadas con D-lisina y expuestas al 50% de etanol durante 10 minutos mostraron una reducción drástica en la supervivencia en comparación con la fracción no tratada. Las imágenes binoculares desde arriba muestran que las colonias cultivadas en presencia de D-lisina fueron en general más pequeñas y formaron arrugas menos pronunciadas que las no tratadas. Las imágenes de microscopio electrónico de barrido de colonias de biopelícula secadas por punto crítico revelan aún más el desarrollo alterado de la biopelícula.La matriz de sustancias poliméricas extracelulares, o EPS, parecía más una telaraña en las muestras no tratadas, mientras que en las muestras tratadas se observaba menos organización. Finalmente, el examen a la resolución de células bacterianas individuales muestra que las células tratadas tienen un aspecto alargado, están menos cubiertas con EPS y no están tan firmemente conectadas a sus vecinas como las células no tratadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que establecer un marco consistente para estudiar inhibidores de biopelículas es esencial para obtener resultados reproducibles.Una vez dominada, una cribado de moléculas pequeñas para la inhibición de biopelículas puede realizarse en menos de una semana si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la investigación de la expresión génica en células individuales de biopelícula, con el fin de obtener información adicional sobre el blanco del inhibidor de molécula pequeña. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar el efecto general de inhibidores específicos de biopelículas sobre el desarrollo de biopelículas y la resistencia a antibióticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Tay, S. B., et al. Disrupción antivirulenta de biopelículas patógenas mediante lactonasas modificadas que apagan el quórum.  J. Vis. Exp. (2016)El vídeo demuestra un método para cuantificar biomasa de biofilm en una bacteria patógena, comparando controles no tratados con muestras tratadas con una enzima que apaga el quorum. La enzima interrumpe la señalización bacteriana durante la incubación temprana, reduciendo la adhesión celular. Tras el lavado y una incubación adicional, los pozos...

Cuantificación de la supresión de biopelículas inducida por enzimas en bacterias patógenas

Fuente: Tay, S. B., et.al. Disrupción antivirulenta de biopelículas patógenas mediante lactonasas modificadas que apagan el quórum.  J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra el proceso de inhibir la formación de biopelículas introduciendo una enzima que interrumpe la señalización celular bacteriana. La enzima impide que las bacterias produzcan sustancias poliméricas extracelulares, reduciendo así el desarrollo de biofilm en una microplaca con fondo de cristal. Finalmente, la estructura de la...

Evaluación microscópica de la inhibición mediada por enzimas de la formación de biopelículas

Fuente: Bucher, T., et al. Metodologías para el estudio de biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo muestra un ensayo de formación de películas utilizando Bacillus subtilis para evaluar inhibidores de moléculas pequeñas que interrumpen la síntesis de matrices y el desarrollo de biopelículas, proporcionando un modelo para detectar compuestos que inhiben selectivamente el crecimiento asociado a la...

Evaluación de los efectos inhibidores en la formación de películas en Bacillus subtilis

Fuente: Bucher, T., et al. Metodologías para el estudio de biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demuestra cómo la integridad de la matriz de biofilm influye en la resistencia bacteriana al etanol comparando unidades formadoras de colonias en biopelículas no tratadas y con inhibidores alterados. La reducción de las UFC en muestras tratadas con inhibidores demuestra que la matriz extracelular es...

Ensayo de resistencia al etanol para evaluar la integridad de la matriz de biofilm

Fuente: Bucher, T., et al., Metodologías para estudiar biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp.(2016)Este vídeo demuestra la preparación de colonias bacterianas maduras de biofilm para imágenes de alta resolución. Cubre los pasos de fijación, deshidratación, montaje y recubrimiento metálico para preservar y visualizar la morfología de la biopelícula.

Preparación de colonias de biofilm bacteriano para análisis morfológicos

Las enzimas que apagan el quórum son opciones antivirulentas y antibacterianas que pueden mitigar la patogénesis sin riesgo de incurrir en resistencia, al prevenir la expresión de factores de virulencia y genes asociados con la resistencia a los antibióticos y la formación de biopelículas. En este estudio, presentamos un método que demuestra la eficacia de las enzimas que extinguen el quórum en la disrupción de la biopelícula bacteriana.

Interrupción Anti-virulenta de patógenos biopelículas utilizando Engineered Quórum para saciar lactonasas

La mayoría de las infecciones bacterianas producen una biopelícula. En virtud de su entorno, las bacterias asociadas a la biopelícula suelen ser fenotípicamente resistentes a los fármacos. Por lo tanto, las nuevas moléculas antibacterianas que matan las bacterias en las biopelículas son una alta prioridad. Establecemos un ensayo para detectar rápidamente compuestos antimicrobianos que sean eficaces para erradicar las biopelículas.

Orientación de Biofilm Asociadas<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Las infecciones por biofilm muestran una alta tolerancia a la quimioterapia. Ningún ensayo por sí solo capta la complejidad de las biopelículas. En su lugar, se necesitan ensayos complementarios. Presentamos una plataforma de cribado (desarrollada para S. aureus) que combina ensayos de viabilidad, biomasa y matriz de biopelícula. Permite el descubrimiento de fármacos anti-biopelícula, incluida la evaluación de los efectos quimioterapéuticos a largo plazo.

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

Los productos naturales representan prometedores puntos de partida para el desarrollo de nuevos fármacos y agentes terapéuticos. Sin embargo, debido a la alta diversidad química, encontrar nuevos compuestos terapéuticos de las plantas es una tarea difícil y que consume mucho tiempo. Describimos un enfoque simplificado para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales.

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

Este protocolo presenta una metodología para realizar mediciones de crecimiento de biopelículas y biomasa utilizando dispositivos de placa de PCR de pozo profundo autoensamblados para la detección de biopelícula estática de tapa fijada de 96 pocillos de alto rendimiento.

Generación de mayor biomasa de biopelícula bacteriana utilizando dispositivos de microplacas de pozo profundo de placas pcr

Este protocolo describe un enfoque que combina métodos estáticos y dinámicos para evaluar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para erradicar las biopelículas en la industria láctea. Este enfoque también se puede utilizar para probar la eficacia de nuevas formulaciones biológicas o químicas para controlar las biopelículas.

Evaluación de la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para la erradicación de biofilms lácteos utilizando un enfoque que combina métodos estáticos y dinámicos

Aprenda metodologías reproducibles para estudiar inhibidores de biopelículas en Bacillus subtilis. Estas técnicas permiten evaluar efectos de moléculas pequeñas y comprender mecanismos de acción con resolución de célula individual.

Metodologías para el estudio B. subtilis Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas (Video) | JoVE Journal

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