De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en

El objetivo general del procedimiento es utilizar robótica y ensayos estandarizados para agilizar el aislamiento de mutaciones letales sensibles a la temperatura en Chlamydomonas, con el fin de determinar los genes y vías esenciales en este organismo. Estamos interesados tanto en la conservación como en la divergencia de funciones celulares esenciales en eucariotas. Y la forma en que nos gusta estudiar esto es mediante mutaciones que interrumpen genes esenciales en estos procesos.

Para que esto funcione bien, se necesita una colección realmente exhaustiva de mutantes, y los métodos que conocerá a continuación son nuestra forma de generar dicha colección. Estamos trabajando con la alga verde Chlamydomonas reinhardtii como representante del reino vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que es probable encontrar mutaciones letales sensibles a la temperatura en cada vía esencial.

El método no requiere conocimientos previos ni mutagénesis dirigida. La función molecular del gen mutado se sugiere inmediatamente a partir del fenotipo letal. Esto nos ayuda a seleccionar mutaciones interesantes que interrumpen diversas vías de siala más allá del control del ciclo celular.

Para llevar a cabo la mutagénesis por UV, cultive células de Chlamydomonas hasta una DO750 de 0,2 a 0,5 en 100 mililitros de Tris-Acetato-Fosfato, o TAP, bajo luz a 25 grados Celsius y agitación a 100 rpm. La mutagénesis por UV se realiza independientemente en dos fondos genéticos según el protocolo descrito en el texto. Examine una muestra de cada cultivo al microscopio para asegurarse de que las células estén viables y no estén contaminadas.

A continuación, diluya el cultivo hasta una DO 750 de 0,003 y envuelva el frasco con papel de aluminio para garantizar una densidad homogénea, ya que la cepa es motil y nada direccionalmente en respuesta a la luz. Tras ajustar la densidad de la suspensión según el protocolo descrito en el texto, coloque un pequeño casete de tubo compatible con un dispensador de líquidos y realice una serie de lavados para esterilización, según las instrucciones del fabricante, con el fin de prevenir contaminaciones. Utilizando un casete dispensador de líquidos de ocho jeringas, distribuya cuatro veces 96 gotas de dos microlitros cada una del cultivo sobre placas rectangulares secas.

Toque suavemente el borde de la placa para asegurar la fusión de todas las gotas en una capa delgada de líquido y cubra inmediatamente las placas para evitar la exposición a la luz. Una vez secas, coloque las placas bajo una lámpara germicida de UV durante períodos de tiempo determinados empíricamente para obtener un rendimiento óptimo de mutantes ts entre los sobrevivientes. A continuación, transfiera las placas a la oscuridad durante ocho a 24 horas a temperatura ambiente.

Luego, coloque las placas en un incubador a 21 grados Celsius con iluminación. Tras aproximadamente 10 días, cuando las colonias hayan crecido pero no se hayan fusionado, cargue las placas en la pila correspondiente como fuentes para la selección robótica de colonias. A continuación, seleccione colonias para matrices de 384 en placas rectangulares y cultívelas a 21 grados Celsius con iluminación durante aproximadamente una semana.

Mediante un robot de replicación por transferencia, condense las matrices de 384 en una matriz de 1536 y deje crecer las placas en el incubador a 21 grados Celsius durante aproximadamente tres días. Replicar las matrices de 1536 en dos placas cada una y coloque una en el incubador a 21 grados Celsius y la otra en un incubador a 33 grados Celsius. Tras 24 horas a 33 grados Celsius, replique las placas procedentes del incubador a 33 grados Celsius en un nuevo conjunto de placas precalentadas y colóquelas en el incubador a 33 grados Celsius.

Tras tres días de crecimiento a 33 grados Celsius y cinco días de crecimiento a 21 grados Celsius, utilice una cámara digital para fotografiar una placa de cuadrícula marcada con nueve indicadores de alineación. Luego, fotografíe las placas, alternando placas de 21 grados Celsius seguidas por las placas correspondientes de 33 grados Celsius, colocando todas las placas en un marco fijo para conservar la orientación exacta. Procese las imágenes emparejadas de placas de 21 y 33 grados Celsius con un software personalizado de análisis de imágenes en laboratorio matte para eliminar el fondo y segmentar las imágenes en una matriz de 1536.

El programa determinará la biomasa detectada como intensidad total de píxeles en cada posición. Cargue la lista de colonias seleccionadas generada por el software como un archivo de instrucciones para el robot de selección individual de colonias. Luego prepare las placas de origen y destino según las instrucciones del robot y permita que el robot seleccione las colonias indicadas y las transfiera a una matriz.

Coloque las placas objetivo en el incubador a 21 grados Celsius durante aproximadamente cinco días para obtener una placa de reserva. Después de realizar un segundo ensayo de acumulación de biomasa y replicar las placas de 100 bloques según el protocolo descrito en el texto, replique la copia fresca de las placas de 100 bloques en tres copias. Tras preparar la tercera placa en el robot y sembrar las colonias, tome microfotografías de una región de cada punto de las placas de cribado en el tiempo cero y coloque las placas a 33 grados Celsius para su incubación.

En diferentes momentos después de retirar las placas de tamizaje del incubador a 33 grados Celsius, tome rápidamente microfotografías, asegurándose de que el portaplacas y el controlador de la platina estén calibrados con precisión para obtener imágenes de las mismas células en cada momento. Analice las imágenes microscópicas y seleccione los mutantes según los criterios deseados. Inocule el conjunto final seleccionado en una placa de agar dispuesta en formato 96, asegurándose de que cada placa contenga mutantes del mismo tipo de apareamiento y resistencia al fármaco.

Transfiera grandes cantidades de las colonias dispuestas a medio de inducción de gametos sin nitrógeno en microplacas de 96 pocillos. Incube las placas bajo luz durante aproximadamente cinco horas para permitir la gametogénesis. Suspender cepas con tipos de apareamiento opuestos que porten los cassettes de resistencia alternativos en tubos con medio de inducción de gametos sin nitrógeno para la gametogénesis.

Mezcle las muestras de una placa objetivo en un volumen de mezcla de apareamiento de 20 microlitros. Después de aproximadamente 10 minutos bajo la luz, retire cinco microlitros de cada pocillo dos veces: una vez en una placa TAP para pruebas de ligamiento y otra vez en una placa TAP más cinco micromoles de paro más nueve micromoles de hygro para pruebas de complementación.

Después de incubar las placas para la prueba de complementación, replique las placas en dos copias para la identificación del fenotipo ts. Pruebe las colonias para el fenotipo ts según el protocolo descrito en el texto. Después de la irradiación de células individuales de Chlamydomonas, se permite que las células crezcan durante diez días a una temperatura permisiva y luego se recolectan en un formato ordenado, como se observa aquí.

Las placas resultantes en formato de 384 se combinan en una matriz de 1536. Se probaron tres tiempos de exposición a UV para generar mutantes ts de Chlamydomonas. Empíricamente, el tiempo de exposición de 1,5 minutos produjo el mayor número de mutantes ts.

Sin embargo, de lejos, el tiempo de exposición de un minuto produjo la mayor parte de los candidatos del ciclo celular. En este experimento, se realizaron dos ensayos secuenciales de fenotipo ts y se aislaron aproximadamente 3000 mutantes ts, que luego se caracterizaron fenotípicamente mediante microscopía con intervalos de tiempo. Como se observa aquí, para eliminar los genes altamente recurrentes de la tubería posterior, se realizaron pruebas de complementación y de ligamiento con genes ya caracterizados que tenían más de dos alelos, frente a los nuevos candidatos recopilados.

Estas colonias no muestran complementación con la cepa interrogadora y, por lo tanto, representan nuevos alelos ts para el gen analizado. Estas generalmente se excluyen de caracterizaciones posteriores. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en alta escala.

Miles de mutantes ts pueden aislarse en tan solo dos o tres rondas de mutagénesis. Un paso clave tras el aislamiento de los mutantes ts es seleccionar un subconjunto para su estudio posterior, y resulta muy interesante observar la variedad de fenotipos letales. La fenotipificación proporciona indicios sobre la función molecular y también nos ayuda a priorizar los mutantes para su análisis más detallado.

Tenga en cuenta que los mutantes pueden tener cientos o miles de mutaciones en sus genomas. Por lo general, solo una es causativa, aunque a veces se requieren dos mutaciones para el fenotipo ts, lo cual puede determinarse mediante análisis tetra. Tras este procedimiento, las mutaciones causativas pueden identificarse mediante análisis de secuenciación de próxima generación de muestras agrupadas. Los genes identificados a veces tendrán mutaciones que sugieren función, o pueden ser secuencias nuevas y desconocidas, lo cual es interesante y emocionante.

Chlamydomonas ha sido un excelente sistema modelo para el estudio de la biología celular en el reino vegetal. Los procedimientos que acaba de escuchar deberían facilitar el estudio de este organismo en procesos esenciales que hasta ahora han sido relativamente poco examinados, y esperamos que los resultados también sean relevantes para el reino vegetal en general.