De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en Chlamydomonas reinhardtii

El objetivo general del procedimiento es utilizar la robótica y los ensayos estandarizados para agilizar el aislamiento de las mutaciones letales sensibles a la temperatura en Chlamydomonas con el fin de determinar los genes y las vías esenciales en este organismo. Estamos interesados tanto en la conservación como en la divergencia de las funciones celulares esenciales en los eucariotas. Y la forma en que nos gusta estudiar eso es con mutaciones que interrumpen genes esenciales en estos procesos.

Para que eso funcione bien, necesitas una colección realmente completa de mutantes y los métodos de los que oirás hablar son nuestra forma de generar dicha colección. Estamos trabajando en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii como representante del reino vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que es probable que se puedan encontrar mutaciones letales sensibles a la temperatura en todas las vías esenciales.

El método no requiere conocimientos previos ni mutagénesis dirigida. La función molecular del gen mutado se sugiere inmediatamente a partir del fenotipo letal. Esto nos ayuda a seleccionar mutaciones interesantes que interrumpen diversas vías de siala más allá del control del ciclo celular.

Para llevar a cabo el cultivo de mutagénesis UV en células de Chlamydomonas hasta un OD 750 de 0,2 a 0,5 en 100 mililitros de Tris-Acetato-Fosfato, o TAP, bajo luz a 25 grados Celsius y agitando a 100 RPM. La mutagénesis UV se realiza de forma independiente en dos antecedentes genéticos de acuerdo con el protocolo de texto. Revise una muestra de cada cultivo bajo el microscopio para asegurarse de que las células sean viables y no estén contaminadas.

A continuación, diluya el cultivo hasta un diámetro exterior de 750 de 0,003 y, a continuación, envuelva el frasco con papel de aluminio para garantizar una densidad homogénea, ya que la cepa es modal y nada direccionalmente en respuesta a la luz. Después de ajustar la densidad de la suspensión de acuerdo con el protocolo de texto, conecte un casete de tubo pequeño que se adapte a un dispensador de líquido y realice una serie de lavados para la esterilización, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para evitar la contaminación. Usando un casete dispensador de líquido de ocho jeringas, dispense cuatro por 96 gotas de dos microlitros cada una de cultivo en placas rectangulares secas.

Golpee suavemente el borde de la placa para asegurar la fusión de todas las gotas en una fina lámina de líquido y cubra inmediatamente las placas para evitar la exposición a la luz. Cuando se sequen, coloquen las placas bajo una lámpara UV germicida durante períodos de tiempo determinados empíricamente para proporcionar un rendimiento óptimo de mutantes ts entre los supervivientes. A continuación, transfiera las placas a la oscuridad durante ocho a 24 horas a temperatura ambiente.

Luego coloque las placas en una incubadora de 21 grados centígrados con iluminación. Después de aproximadamente 10 días cuando las colonias crecen pero no se fusionan, cargue las placas en la pila correspondiente como fuentes para la recolección robótica de colonias. A continuación, elija colonias para 384 conjuntos en placas rectangulares y hágalas crecer a 21 grados centígrados con iluminación durante aproximadamente una semana.

Usando un robot de recubrimiento de réplica, condense las 384 matrices en una matriz 1536 y permita que las placas crezcan en la incubadora de 21 grados Celsius durante aproximadamente tres días. Replique las 1536 matrices en dos placas cada una y coloque una en la incubadora de 21 grados Celsius y la otra en una incubadora de 33 grados Celsius. Después de 24 horas a 33 grados centígrados, replique las placas de la incubadora de 33 grados centígrados en un nuevo conjunto de placas precalentadas y colóquelas en la incubadora de 33 grados centígrados.

Después de tres días de crecimiento a 33 grados centígrados y cinco días de crecimiento a 21 grados centígrados, use una cámara digital para fotografiar una placa de cuadrícula marcada con nueve indicadores de alineación. A continuación, fotografíe las placas, alternando placas de 21 grados Celsius seguidas de las correspondientes placas de 33 grados Celsius con todas las placas colocadas en un marco fijo para preservar la orientación exacta. Procese las imágenes emparejadas de 21 o 33 placas con un software de análisis de imágenes de laboratorio mate personalizado para eliminar el fondo y segmentar las imágenes en una matriz 1536.

El programa determinará la biomasa detectada como intensidad total de píxeles en cada posición. Cargue la lista de colonias seleccionadas generada por el software como un archivo de instrucciones para la robótica de selección de colonias individuales. A continuación, prepare las placas de origen y destino de acuerdo con las instrucciones de la robótica y permita que el robot elija las colonias seleccionadas en una matriz.

Coloque las placas objetivo en la incubadora a 21 grados centígrados durante aproximadamente cinco días para cultivar una placa de caldo. Después de realizar un segundo ensayo de acumulación de biomasa y replicar 100 placas de bloques de acuerdo con el protocolo de texto, replique la copia nueva de las 100 placas de bloques a tres copias. Después de la configuración de la tercera placa en el robot, y el avistamiento de las colonias, tome foto-micrografías de una región de cada punto de las placas de cribado en tiempos cero y coloque las placas a 33 grados Celsius para la incubación.

En diferentes puntos de tiempo después de retirar las placas de cribado de la incubadora de 33 grados Celsius, tome rápidamente fotomicrografías, asegurándose de que el soporte de la placa y el controlador de etapa estén calibrados con precisión para obtener imágenes de las mismas células en cada punto de tiempo. Analice imágenes microscópicas y seleccione mutantes en función de los criterios deseados. Localiza el conjunto final seleccionado en una placa de agar de 96 disposiciones, asegurándote de que cada placa contenga mutantes del mismo tipo de apareamiento y resistencia a los medicamentos.

Transfiera grandes cantidades de las colonias matricadas a un medio de inducción de gametos libres de nitrógeno en microplacas de 96 pocillos. Incubar las placas bajo luz durante aproximadamente cinco horas para permitir la gametogénesis. Suspenda las consultas con los tipos de apareamiento opuestos que albergan los casetes de resistencia alternativos en tubos con medio de inducción de gametos libres de nitrógeno para la gametogénesis.

Mezcle las muestras de una placa objetivo en un volumen de mezcla de acoplamiento de 20 microlitros. Después de aproximadamente 10 minutos bajo la luz, detecte cinco microlitros de cada pocillo dos veces. Una vez en una placa TAP para pruebas de ligamiento y una vez en una TAP más cinco micromoles paro más nueve micromoles hygro para pruebas de complementación.

Después de incubar las placas de prueba de complementación, replique las placas en dos copias para la identificación del fenotipo. Pruebe las colonias para determinar el fenotipo ts de acuerdo con el protocolo de texto. Después de la eradiación de células individuales de Chlamydomonas, se deja que las células crezcan durante diez días a una temperatura permisiva, y luego se recogen en un formato de matriz, como se ve aquí.

Las placas resultantes en el formato 384 se fusionan en una matriz 1536. Se probaron tres tiempos de exposición a los rayos UV para generar mutantes ts de Chlamydomonas. Empíricamente, el tiempo de exposición de 1,5 minutos produjo la mayor cantidad de mutantes ts.

Sin embargo, con diferencia, el tiempo de exposición de un minuto produjo la mayoría de los candidatos para el ciclo celular. En este experimento, se realizaron dos ensayos secuenciales de fenotipo ts y se aislaron alrededor de 3000 mutantes ts y se caracterizaron fenotípicamente mediante microscopía de lapso de tiempo. Como se ha visto aquí, para eliminar genes altamente recurrentes de la tubería descendente, se realizaron pruebas de complementación y ligamiento con genes ya caracterizados con más de dos alelos, contra candidatos recién recolectados.

Estas colonias no muestran complementación con la consulta y, por lo tanto, son un nuevo alelo ts para el gen consultado. Por lo general, se excluyen de una caracterización posterior. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar con un alto rendimiento.

Miles de mutantes ts pueden ser aislados en solo dos o tres rondas de mutagénesis. Un paso clave después del aislamiento de los mutantes ts es seleccionar un subconjunto para un estudio más profundo, y es muy interesante ver la gama de fenotipos letales. El fenotipado proporciona pistas sobre la función molecular y también nos ayuda a priorizar los mutantes para su posterior estudio.

Ten en cuenta que los mutantes pueden tener cientos o miles de mutaciones en sus genomas. Por lo general, solo una es causal, aunque a veces se requieren dos mutaciones para el fenotipo ts y esto se puede determinar mediante análisis tetra. Siguiendo este procedimiento, las mutaciones causales se pueden identificar mediante el análisis de secuenciación de próxima generación de Los genes identificados a veces tendrán mutaciones que sugieren función o pueden ser secuencias nuevas y desconocidas, lo cual es interesante y emocionante.

Chlamydomonas ha sido un excelente sistema modelo para estudiar la biología celular en el reino vegetal. Los procedimientos de los que ha oído hablar deberían abrir el estudio de este organismo para procesos esenciales que han sido relativamente poco examinados y esperamos que los resultados también sean relevantes para el reino vegetal en general.