De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

El objetivo general de este protocolo es utilizar un ensayo en tiempo real de combinación única para identificar inhibidores específicos de moléculas pequeñas del crecimiento bacteriano intracelular que no sean tóxicos para las células huésped. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de antimicrobianos. Específicamente, ¿qué tipos de compuestos pueden penetrar en los compartimentos intracelulares y matar patógenos sin dañar la célula huésped?

Las principales ventajas de esta técnica son el crecimiento bacteriano y la toxicidad de las células de mamíferos se detectan simultáneamente mediante ensayos no destructivos en tiempo real. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la escalabilidad que ofrece. Ensayar más de diez mil compuestos en una sesión requiere un conjunto completamente nuevo de técnicas y equipos.

Además de Lucius, demuestran un compromiso comunitario con el descubrimiento académico de antimicrobianos y la microbiología diagnóstica traslacional los becarios postdoctorales KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn y la estudiante Kat Truelson. Para preparar las células huésped, cultive J774A. 1 macrófago está en suspensión en RPMI 1640, con un nueve por ciento de suero de ternera suplementado con hierro.

Inicialmente las células pasan en matraces de cultivo de tejidos. Después de que las células se hayan vuelto confluentes en un matraz de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados en 15 mililitros de medio, divida las células raspándolas y diluyéndolas a 65 mililitros con el mismo tipo de medio. Regrese 15 mililitros al matraz de cultivo de tejidos y transfiera 50 mililitros a un matraz agitador de bacterias de 250 mililitros.

Airee ajustando la velocidad de rotación a aproximadamente 120 revoluciones por minuto. Para un crecimiento constante, incube exactamente al cinco por ciento de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados. Recoja las células cuando alcancen una densidad en el rango de dos coma cinco millones de células por mililitro, a cinco millones de células por mililitro.

Asegúrese de que el porcentaje de células muertas no supere el 25 por ciento, ya que las células muertas aumentarán el ruido de fondo en los ensayos de citotoxicidad. Es fundamental evitar que las células se asienten en los depósitos cuando se dispensan grandes volúmenes de macrófagos y bacterias con manipuladores de líquidos. Agite los depósitos cada pocos minutos mientras dispensa para evitar la falta de uniformidad y ensaye los pocillos de la placa.

Placa las células en cultivo de tejido blanco tratado, microplacas de 384 pocillos a 50.000 células en 30 microlitros de medio de cultivo de tejidos por pocillo. Incubar las microplacas durante la noche para lograr una confluencia del noventa por ciento el día del experimento. Prepare parches de bacterias para experimentos, esparciendo organismos densamente en una nueva placa BCYE e incubando un día para obtener un crecimiento confluente.

Vuelva a suspender los microorganismos en el mismo medio de cultivo de tejidos utilizado para las células J774A. 1. Para realizar la infección por macrófagos, agregue compuestos de prueba de interés, incluidos compuestos de detección, y controles positivos y negativos para la inhibición del crecimiento bacteriano en la lisis de células eucariotas.

Las soluciones madre deben disolverse a una concentración mayor o igual a 500x en DMSO o en una solución acuosa, para permitir una dilución suficiente del vehículo. Diluir las bacterias luminiscentes hasta un objetivo de dos coma cinco millones de UFC por milímetro en un medio de cultivo de tejidos. A continuación, añada un colorante de búsqueda de ácido nucleico impermeant de membrana no tóxico adecuado a dos coma cinco veces la concentración final del ensayo.

Agregue 20 microlitros de esta mezcla a cada pocillo de cultivo. El volumen final del ensayo es de 50 microlitros y la concentración bacteriana final debe ser de un millón de UFC por mililitro para el reportero de lux ecron, o de cuatro millones de UFC por mililitro para el reportero de proteínas fluorescentes. Incubar a 37 grados centígrados, durante uno a tres días con un cinco por ciento de dióxido de carbono y un 100 por ciento de humedad relativa para evitar los efectos de evaporación.

Para evitar los efectos de borde asociados a la temperatura al leer los resultados de los ensayos, equilibre térmicamente las microplacas antes de la lectura de luminiscencia colocándolas en una sola capa en una mesa de laboratorio con las tapas entreabiertas durante aproximadamente 20 minutos. Lea el crecimiento bacteriano y la toxicidad de las células eucariotas en un luminómetro y un fluorómetro de microplaca, según corresponda para los reporteros que se utilizan. Devuelva las microplacas a la incubadora si desea una lectura en tiempo real en puntos de tiempo posteriores.

Analice los datos tal y como se describe en el protocolo de texto. Para los experimentos de prueba de dosis-respuesta y sinergia, prepare los macrófagos en las bacterias como antes. Justo antes de la infección por macrófagos, o de la incubación axénica, utilice un sistema automatizado de manipulación de líquidos para facilitar la respuesta a una sola dosis en las pruebas de sinergia combinatoria establecidas mediante la adición directa y automatizada de diluciones antimicrobianas de acuerdo con el protocolo de los fabricantes.

Agregue antimicrobianos de interés experimental en una serie de diluciones de duplicación en serie. El objetivo es abarcar, en el extremo superior, una concentración que elimine por completo el crecimiento, y en el extremo inferior, una concentración que no muestre actividad evidente. Aquí se muestran resultados representativos a lo largo del tiempo para la luminiscencia bacteriana y la fluorescencia asociada a la citotoxicidad.

Obsérvese los efectos contrastantes del tratamiento antimicrobiano y el detergente citotóxico de células eucariotas. Se utilizó la determinación dual de la dosis-respuesta IC50 y CC50 en los mismos pocillos de cribado para determinar la selectividad del antibiótico doxiciclina. La replicación bacteriana fue inhibida por concentraciones intermedias de antibiótico.

Sin embargo, se observó citotoxicidad a altas concentraciones consistentes con la selectividad de aproximadamente 100. Se utilizó el mismo formato de ensayo para probar la dosis-respuesta bidimensional para las combinaciones de minociclina y azitromicina. Los isocontornos conectan puntos de igual inhibición del crecimiento intracelular.

En este caso, los isocontornos cóncavos sugirieron fuertes efectos sinérgicos para los dos fármacos. Robótica de dosificación digital para la configuración de ensayos, lectura en tiempo real y pruebas combinatorias de triple sinergia habilitadas para formatos de alto rendimiento. Aquí, la observación de una superficie claramente cóncava sugiere un alto grado de efecto sinérgico para las combinaciones de Minociclina, Azitromicina y Rifampicina contra el crecimiento intracelular de Legionella pheumophila.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo combinar la lectura de ensayos fluorescentes o luminiscentes con pruebas de citotoxicidad en tiempo real en formato de ensayo de alto rendimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos como el microscopio confocal para responder preguntas sobre el evento biológico en toda la célula, que también se sitúan con su actividad antimicrobiana o citotoxicidad en toda la célula. Aunque estudiamos los efectos sobre la replicación de la legionela, las mismas técnicas también se pueden aplicar a otros patógenos intracelulares como la brucella y las microbacterias.

Concebimos por primera vez este protocolo cuando intentamos descifrar un ensayo lo suficientemente simple y confiable como para usarlo en un formato de cribado de muy alto rendimiento. No olvide que trabajar con patógenos bacterianos, líneas celulares y equipos robóticos tiene algunos riesgos inherentes y se deben tomar las precauciones adecuadas, como el uso de equipo de protección personal adecuado mientras se realiza este procedimiento.