Name: De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a identificar antimicrobianos intracelulares no tóxicos mediante un ensayo de alta capacidad en tiempo real. Este método permite detectar simultáneamente el crecimiento bacteriano y la citotoxicidad en células hospedadoras.

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Las investigaciones realizadas en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de la Salud con el número premio R01AI099122 a Jek El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. Nos gustaría dar las gracias a Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug inundación, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu, y Rachel Warden de la planta de filtrado OICI-Longwood y / o el Laboratorio Nacional de Detección de los nuevos centros regionales de excelencia en Inglaterra Biodefensa y Enfermedades Infecciosas emergentes (apoyados por U54AI057159) por su ayuda en el desarrollo y ejecución de ensayos de selección de alto rendimiento. También nos gustaría dar las gracias a Kenneth P. Smith útil para los comentarios sobre el manuscrito.

El crecimiento intracelular 1. Tiempo Real y la célula eucariótica Ensayo de citotoxicidad <ol><li> Preparación de células huésped (células J774A.1) <ol><li> Células como los macrófagos-Cultura J774A.1 Mus musculus en suspensión en RPMI 1640 con suero de ternera suplementado con hierro 9%. Inicialmente pasaje en matraces de cultivo tisular. Después las células se han vuelto confluente en un 75 cm matraz de cultivo de 2 tejido en 15 ml de medio, dividido por raspado y la dilución a 65 ml con el mismo tipo de medio, de los cuales 15 ml se devuelve al matraz de cultivo de tejidos y 50 ml se transfiere a un matraz de 250 ml agitador bacteriano. </li><li> Para ampliación, la cultura en suspensión en 250 ml y / o 1.000 frascos llenos de bacterias ml de una quinta parte del volumen con medio de cultivo de tejidos. Airear ajustando la velocidad de rotación en aproximadamente 120 revoluciones por minuto. Para un crecimiento constante, se incuba a exactamente 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Las células se cosechan cuando alcanzan densidad en el intervalo de 2,5 x 10 6 células/ ml a 5 x 10 6 células / ml. Garantizar porcentaje de células muertas (lo más fácilmente posible ensayó por tinción con azul tripán) no exceda del 25%, ya que las células muertas se incrementará el ruido de fondo en los ensayos de citotoxicidad. </li><li> Placa de blanco, cultivo de tejidos tratados, de 384 pocillos microplacas a 5 x 10 4 células J774A.1 en 30 l de medio de cultivo de tejidos por pocillo. Incubar las microplacas durante la noche para conseguir el 90% de confluencia en el día de experimento. </li></ol></li><li> Preparación luminiscente o fluorescente Legionella pneumophila <ol><li> Pasaje L. pneumophila (LP02 :: :: lux flaA 8) bacterias en un medio apropiado, es decir, tamponada extracto de levadura carbón (BYCE) medio. Si se utiliza una cepa auxotrófico timidina, suplemento de medio con 100 g de timidina / ml. Preparar parches de bacterias para los experimentos de propagación de organismos densamente en una nueva placa BCYE e incubando un día (si de una anterior pasaje placa) o de dos a tres días (si desde el almacén congelado) para obtener confluentecrecimiento. <ol><li> Preparar placas BCYE disolviendo 10 g de extracto de levadura, 10 g de N - (2-acetamido) -2-aminoetanosulfónico, 0,35 g K 2 HPO 4, y 1 g de potasio monobásico α-cetoglutarato en 950 ml de agua desionizada. Ajustar a pH 6,9 con hidróxido de potasio (≥2.5 ml de solución molar 11,9). </li><li> Añadir 15 g de agar y 2 g de carbón activado; y llevar a 1 l de volumen final. Añadir una barra de agitación magnética y autoclave. medio Enfriar a 55 ° C y añadir soluciones de filtro esterilizado que contienen 0,4 g de hierro 0,42 g de amonio (III) citrato de L-cisteína y se disolvió en agua desionizada. Utilice placa de agitación imán para mezclar antes de verter las placas de Petri. </li><li> Para el ensayo de crecimiento de L. pneumophila en medio de cultivo axénicos, preparar caldo de extracto de levadura-ACES (AYE) mediante la combinación de todos los reactivos químicos utilizados para BYCE excepto el carbón vegetal y el agar. Filtro de esterilizar y utilizar inmediatamente o congelar para experimentos posteriores. </li></ol></li><li> Volver a suspender los organismos de la same medio de cultivo tisular utilizado para las células J774A.1 con 100 mg / ml de suplementos de timidina, según proceda. </li></ol></li><li> La infección de los macrófagos <ol><li> Añadir los compuestos de ensayo de interés (compuestos de detección, y controles positivos y negativos para la inhibición del crecimiento bacteriano y la lisis de células eucariotas). Preferiblemente, se disuelven soluciones madre en ≥500x en DMSO (dimetil sulfóxido) o una solución acuosa para permitir la dilución suficiente de vehículo. <ol><li> Aunque las soluciones madre se pueden almacenar congeladas, evitar los ciclos de congelación-descongelación para compuestos lábiles y antimicrobianos. </li></ol></li><li> Diluir bacterias luminiscentes para apuntar de 2,5 x 10 6 CFU (unidad formadora de colonias) / m y bacterias marcado con indicador fluorescente para 1,0 x 10 7 UFC / ml en medio de cultivo de tejido y añadir no tóxico, la membrana impermeable a ácido nucleico apropiada colorante de unión a 2.5x concentración de ensayo final. </li><li> Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 6 UFC / ml (reportero lux operón) o 4 x 10 10 6 UFC / ml (proteína fluorescente reportero). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1-3 días en 5% de CO2 a 100% de humedad relativa para evitar efectos de borde de evaporación. </li></ol></li><li> ensayo de lectura <ol><li> Leer el crecimiento bacteriano y la toxicidad de células eucariotas en un luminómetro de microplacas y fluorímetro según sea apropiado para la prensa que se utiliza. <ol><li> Para evitar efectos de borde de la temperatura asociada, equilibre térmicamente microplacas antes de la lectura de luminiscencia por la colocación en una sola capa sobre un banco de laboratorio con tapa entreabierta durante aproximadamente 20 min (o en una cabina de seguridad biológica con tapas de aproximadamente 10 min). </li></ol></li><li> Microplacas volver a la incubadora, si se desea lectura en tiempo real en momentos posteriores. </li></ol></li></ol> Análisis 2. Datos <ol><li> Normalizar los datos a con positivo y negativocontroles para calcular el porcentaje de inhibición o plegable para el crecimiento bacteriano intracelular y el porcentaje de citotoxicidad para las células eucariotas. </li><li> Para evaluar la robustez del ensayo, calcular la separación estadística entre los controles positivos y negativos tanto para la inhibición del crecimiento bacteriano y la citotoxicidad utilizando Z-factor &quot;análisis donde Z (Z) &#39;= 1-3 (σ p + σ n) / | mu p + mu n |. En esta ecuación, σ p y σ n son las desviaciones estándar para los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente; μ p y mu n son los valores medios de los pocillos de control positivos y negativos, respectivamente. <ol><li> Para los ensayos de selección de alto rendimiento, el cálculo de las puntuaciones z estándar (o otra alternativa, las medidas estadísticas cuantitativos) para evaluar los efectos de los compuestos de ensayo de interés. Alternativamente, el cálculo de un simple pliegue de reducción o reducción veces log como potencialmente fisiológicamente más relevante<html> medida de la magnitud del efecto para las bacterias geométricamente replicantes. </li></ol></li></ol> 3. multi-dimensional (es decir, Synergy) dosis-respuesta Interpretación individual y pruebas y Datos <ol><li> Preparar los macrófagos y las bacterias como se describe en el apartado 1 del protocolo. </li><li> Justo antes de la infección o la incubación axénicos, añadir antimicrobianos de interés experimental en una serie, duplicando serie de dilución, con el objetivo de spanning en el extremo superior una concentración que elimina completamente el crecimiento (es decir, la concentración inhibitoria mínima o MIC) y en la baja poner fin a una concentración que no muestra actividad obvia. </li><li> Utilizar un sistema de manipulación de líquidos automatizado para facilitar sola dosis-respuesta y la configuración de las pruebas de sinergia combinatoria a través de la adición directa y automatizada de diluciones antimicrobiana de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Considerar el uso de diluciones sub-duplicar, por ejemplo,841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - doblar serie de dilución, y el ensayo se replica para aumentar la precisión y la reproducibilidad de los datos. </li><li> Para la infección de macrófagos, diluir las bacterias luminiscentes a diana de 2,5 x 10 6 CFU (unidad formadora de colonias) / ml en medio de cultivo tisular. Añadir 20 l de mezcla a cada cultura J774A.1 así, el volumen de ensayo final de 50 l, concentración bacteriana final de 1 x 10 6 UFC / ml; y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 a 100% de humedad relativa. <ol><li> Para el ensayo de crecimiento axénicos, diluir las bacterias luminiscentes a la concentración final de 1 x 10 6 UFC / ml en medio de AYE, añadir 50 l a cada pocillo de una placa de 384 pocillos y se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 a 100% de humedad relativa. </li></ol></li><li> Calcular el índice de concentración de inhibidor fraccional para las combinaciones antimicrobianas que inhiben el crecimiento bacteriano. Para cada fármaco en la combinación (a, b,.. N) que resulta en la inhibición completa o&gt; 99% de g bacterianarecimiento, calcular la concentración inhibitoria fraccional individuo (FIC a, b, n...) como sigue: FIC a = la concentración de compuesto &quot;a&quot; dividido por la concentración de inhibidor mínima de &quot;a&quot; por sí mismo. . Utilizando la misma fórmula, el cálculo de FIC b, etc A continuación, calcular el índice FIC o combinatoria <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC FIC = a + b + FIC. . .FIC N para cada combinación inhibidora. <ol><li> Utilice el índice combinatorio que se desvía más lejos de 1,0 para evaluar la sinergia. Considere un punto de corte de ≤0.5 como indicación conservadora de un efecto sinérgico y ≥4, un efecto antagonista. 12 </li><li> Parcela isobologramas, isocontorno isobologramas, y / o isosuperficie isobologramas 6 representaciones gráficas como alternativas de efectos combinatorios. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos ensayos en tiempo real para la detección simultánea del crecimiento bacteriano intracelular y la citotoxicidad de la célula huésped. Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para robusto rendimiento del ensayo, debe haber suficiente separación espectral entre lecturas bacterianas y de citotoxicidad. Tal separación es intrínseco para las combinaciones de los reporteros operón luciferasa y tintes fluorescentes de unión al ADN. Sin embargo, basándonos en nuestra experiencia (Tabla 1-3...

Los patógenos que crecen o residen temporalmente en compartimentos intracelulares son difíciles de erradicar terapéuticamente. Obligar o relativamente obligar a patógenos intracelulares tales como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, y Mycobacterium spp. a menudo requieren ciclos de terapia antimicrobiana prolongada para la curación que puede variar de meses a incluso años. Además, los patógenos extracelulares pueden ocupar transitoriamente nichos intracelulares y de este modo escapar un despeje de cursos normales de terapia antimicrobiana y más tarde emerger para iniciar nuevas rondas de infección virulenta. Staphylococcus aureus 1 y enterobacterias 2,3 infecciones uropatogénicas son dos ejemplos cada vez más reconocidos. Por lo tanto, un objetivo fundamental el descubrimiento de fármacos es la identificación de nuevos agentes antimicrobianos que penetran en compartimentos intracelulares. El tratamiento óptimo para erradicar rápidamenteorganismos intracelulares y prevenir el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos mediante la exposición sub-inhibidor es especialmente deseable. Con este fin, hemos desarrollado una tecnología de selección de alto rendimiento para identificar agentes antimicrobianos intracelulares-penetrante de orientación el crecimiento intracelular del patógeno modelo, Legionella pneumophila. 4 observaciones clínicas anteriores indican que las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos estándar no predice con precisión in vivo la eficacia terapéutica contra este organismo. 5 En concreto, esto se debía a que las principales clases de antimicrobianos tales como beta-lactámicos y aminoglucósidos, aunque muy eficaz contra la Legionella axenically crecido, no tienen suficientemente penetran en los compartimentos intracelulares donde reside la Legionella. 5,6 tarde, las pruebas sugiere que los ensayos de crecimiento intracelular técnicamente más complejas predijeron con eficacia la eficacia clínica. 7 </sup&gt; Por desgracia, estos ensayos fueron variables ensayos extremadamente laborioso ya que los macrófagos infectados, tratados con antimicrobianos, que se sometieron a lisis en diferentes puntos Tiempos de unidades formadoras de colonias enumeración. Dichos ensayos son poco prácticos para hacerlo a gran escala y no son adecuados para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado la tecnología para la determinación en tiempo real de crecimiento bacteriano intracelular. 6 Esto se logró mediante el uso de una cepa bacteriana modificada a través de la integración de cualquiera de un bacteriana luciferasa operón 8 (ensayo de primera generación, que se describe anteriormente) 4 o fluorescente proteína 9 reporteros (segunda generación, de ensayo ortogonal, que se describe aquí) en el cromosoma bacteriano. De esta manera, luminiscente o señal fluorescente proporciona un sustituto, la lectura en tiempo real del número de bacterias. Sin embargo, estos atributos no se refieren a un factor de confusión importante en INFECTIO intracelularn ensayos, fuera de objetivo efectos en las células huésped. En particular, la muerte de la célula huésped inherentemente limita el crecimiento intracelular y conduce a la identificación de falsos positivos del efecto antimicrobiano. Como muchos de los compuestos en las bibliotecas de cribado son células eucariotas tóxicos, tales falsos positivos abrumarían verdaderos agentes antimicrobianos, lo que exige un gran número de seguimiento, los ensayos de citotoxicidad punto final para la resolución. Por lo tanto, era de gran interés para poder evaluar la viabilidad celular eucariota y el crecimiento intracelular de forma simultánea. En particular, una característica de las células eucariotas no viables es la pérdida de integridad de la membrana celular. Por lo tanto, las sondas que ponen a prueba la permeabilidad de la membrana de la célula se pueden usar para evaluar la viabilidad celular. Hemos caracterizado previamente la capacidad de una serie de células putativamente membrana no permeables, colorantes fluorescentes, unión al ADN para acceder y manchar el ADN nuclear de células muertas. 4 en el ADN nuclear de unión, estos tintes muestran un gran aumento en quantum rendimiento fluorescente resulta en una mayor señal a través de fluorescencia de la solución de fondo. Como tal, estos colorantes proporcionan una lectura cuantitativa de la muerte celular eucariota. 4 En particular, se encontró que varios eran ellos mismos no tóxico durante prolongado co-incubación con macrófagos J774. Cuando se añade durante la infección inicial, proporcionaron un tiempo real, la lectura fluorescente de la muerte celular eucariota que se puede medir por un fluorímetro de microplaca o observó microscópicamente. Por lo tanto, mediante la combinación de uso de un reportero bacteriana y no tóxico, la membrana impermeable, colorantes de unión al ADN, que fueron capaces de desarrollar un método no destructivo, el ensayo simple, en tiempo real para medir tanto la carga bacteriana y la citotoxicidad de células eucariotas simultáneamente. Este ensayo ha permitido a la pantalla en 384 pocillos formato de placa de ~ 10.000 bioactivos conocidos incluyendo ~ 250 antimicrobianos y&gt; 240.000 pequeñas moléculas con actividad funcionalmente no caracterizado por la capacidad de inhibir el crecimiento intracelular deLegionella pneumophila, mientras que al mismo tiempo la generación de datos de citotoxicidad de células eucariotas para cada compuesto. 6 Nuestro análisis de los antimicrobianos conocidos contra el crecimiento intracelular de Legionella fue la exploración más completa de este tipo hasta la fecha. 6 En base a la eficacia de nuestro formato de ensayo, también posteriormente explorado los efectos potencialmente sinérgicas de agentes antimicrobianos conocidos cuando se usan en combinación. Una de las pruebas de sinergia más comunes, el llamado ensayo de tablero de ajedrez, se realiza de manera estándar mediante la evaluación de los efectos combinatorios de diluciones en serie de dos veces de dos o más agentes antimicrobianos. 10 En estos ensayos, la sinergia se define por la observación de mayor efecto cuando dos o más agentes antimicrobianos se aplican conjuntamente que la suma de los efectos de cada aplicados por separado. Es de destacar que, hasta ahora, sólo se centra y pruebas de sinergia selectiva se llevó a cabo en contra intracelular de Legionella pneumophila </em&gt; debido a la gran esfuerzo involucrado en ensayos de punto final tradicional multiplicada por las permutaciones necesarias combinatorias. Para facilitar las pruebas de sinergia, hicimos uso de nuestro ensayo de citotoxicidad en tiempo real de crecimiento intracelular / eucariota en combinación con la tecnología digital de dispensación automatizada 6. Esta automatización nos permitió prescindir de diluciones en serie de compuestos disueltos en DMSO o solución acuosa solo o en combinación en formato de 384 pocillos. 11 Por otra parte, tales robusta tecnología de tratamiento de líquidos nos permitió realizar fácilmente una resolución más alta, la raíz cuadrada de dos niños (en lugar de la norma, de menor resolución, doblando) combinaciones de dilución para alcanzar mayores niveles de especificidad en nuestro bidimensional, la sinergia de tablero de ajedrez análisis. Esta resolución fue especialmente valiosa para abordar las preocupaciones en materia sinergia sobre la reproducibilidad cuando se utiliza una doble serie de dilución 12. Por último, nuestro ensayo fue cuantitativa y también Therntes de gradaciones de inhibición medido. Como resultado, el ensayo capturó la totalidad de la información inhibitorio, expresable en isocontorno isobologramas en el que isocontours conectar concentraciones combinatorias con niveles similares de inhibición del crecimiento. 6 Esta estrategia trazado permitió la visualización de las curvas de dosis-respuesta combinatorias. Para ilustrar nuestra metodología, describimos nuestro protocolo para la realización de estos ensayos y mostrar los resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Células J774A.1 Colección</td> de <td>cultivos tipo americano</td><td>TIB-67</td><td>Célula huésped</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado</td></tr><tr><td>Extracto de levadura, ultrafiltrado</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado; los grados más bajos pueden causar un crecimiento deteriorado y/o alterar la sensibilidad de Legionella a los inhibidores del crecimiento</td></tr><tr><td>Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotásica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, dibásico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Para la fabricación de agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponada</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio</td></tr> <tr><td>de extracto de levadura tamponadoCitrato de hierro y amonio (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado; En su lugar, se puede usar pirofosfato férrico, pero es más difícil de pesar con precisión</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de potasio, concentrada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado</td></tr><tr><td>Agua deonizada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para hacer agar de extracto de levadura de carbón tamponado y medio de extracto de levadura tamponado</td></tr><tr><td>Timidina (grado de cultivo de tejidos)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Para complementar tanto RPMI 1640 como extracto de levadura tamponado agar/medio &mdash; se puede usar timidina de grado inferior para este último, pero puede causar deterioro del crecimiento celular y/o muerte celular en RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, formulación estándar</td><td>Corning a través de Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Para el crecimiento de células J774A.1 antes de la siembra; incluye 2 mM de L-glutamina</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sin rojo fenol</td><td>Corning a través de Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Para la siembra de células J774A.1 en placas de 384 pocillos (no apto para el crecimiento antes de la siembra); también carece de L-glutamina y mdash; suplemento a 2 mM antes de usar</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM en NaCl al 0,85% (grado de cultivo de tejidos)</td><td>HyClone a través de Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Para suplementar RPMI 1640 sin L-glutamina, hasta 2 mM de concentración final</td></tr><tr><td>Suero de ternera suplementado con hierro</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Para suplementar RPMI 1640, hasta una concentración final del 9,1%</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Para la tinción para J774A.1 Determinación de la muerte celular mientras se cuenta la densidad celular</td></tr><tr><td>SYTOX Green, solución de 5 mM en DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Para la tinción para la determinación de la muerte celular J774A.1 mediante lectura de fluorescencia o microscopía de epifluorescencia (junto con bacterias fluorescentes de color rojo anaranjado o rojo lejano). Utilizar a una concentración final de 125 nM.</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Para la incubación de células J774A.1 (tanto antes como después de la infección); también se puede utilizar para la incubación de bacterias, o se puede utilizar una incubadora de atmósfera estándar en su lugar)</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Para agitar la incubación de células J774A.1 antes de la infección; cabe dentro de la incubadora de cultivos celulares; incluye la base del agitador 7744-01000 y la bandeja 7740-01010 (también están disponibles por separado)</td></tr><tr><td>Matraces agitadores (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección</td></tr><tr><td>Pinzas agitadoras para matraces (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección</td></tr><tr><td>Matraces agitadores (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección</td></tr><tr><td>Pinzas agitadoras para matraces (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Para la incubación por agitación de las células J774A.1 antes de la infección</td></tr><tr><td>Tapones de espuma esponjosa para matraces (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Para la incubación por agitación de células J774A.1 antes de la infección; reduce el riesgo de contaminación en relación con las tapas metálicas estándar</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica multicanal programable MultiDrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Para la dispensación de células J774A.1, medio y suspensión bacteriana que contiene fluoróforos a un gran número de placas de 384 pocillos</td></tr><tr><td>Colector de diámetro estándar Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Volumen de predispensación predeterminado de 20 &#956; l es insuficiente para compensar el asentamiento &mdash; aumentar a 80 &#956; l</td></tr><tr><td>Platos blancos de 384 pocillos tratados para el cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Para la lectura de luminiscencia y fluorescencia; Catálogo Greiner # 781080 también probado con éxito</td></tr><tr><td>DMSO (grado de cultivo de tejidos, en ampollas selladas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Para disolver compuestos de control positivo y prueba</td></tr><tr><td>Azitromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antibiótico control positivo</td></tr><tr><td>Saponina (de corteza de Quillaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Citoxicidad control positivo</td></tr><tr><td>Pipeta</td> <td>multicanalThermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipeta</td><td>Para la transferencia de cantidades fijas de compuestos de control positivo; la pipeta debe tener dispensación digital con retenes para permitir la dispensación repetitiva de volumen fijo</td></tr><tr><td>Robot de transferencia de pines Epson</td><td>Epson/ICCB-L</td> <td>(Equipo personalizado)</td><td>Para la transferencia de cantidades fijas de compuestos de prueba desde matrices de bibliotecas</td></tr><tr><td>Sistema de dosificación digital D300</td><td>Hewlett-Packard a través de Tecan</td><td>D300</td><td>Para la transferencia de cantidades variables de compuestos de prueba que van desde 11 picolitros hasta 10 y micro; l</td></tr><tr><td>Cartuchos T8 + para el sistema de dispensación digital D300</td><td>Hewlett-Packard a través de Tecan</td><td>T8 +</td> <td>Para dispensar compuestos de prueba</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia con cámara digital conectada</td><td>a computadora Nikon</td><td>Ti</td><td>Para la obtención de imágenes de células vivas; cualquier microscopio fluorescente estándar puede sustituir, con contraste de fase u óptica DIC, capaz de obtener imágenes de fluorescencia verde (fluoresceína), rojo anaranjado a rojo (rojo Texas) y rojo lejano (Cy5), con aceite 100X objetivo para la más alta resolución</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Para la obtención de imágenes de células vivas. Antenas como la MatTek permiten la visualización microscópica con un aumento de 600X o 1.000X mediante el uso de un microscopio epifluorescente o confocal invertido. Estos platos específicos tienen un diámetro nominal de 3,5 cm, un diámetro interior de 3,3 cm, con cubreobjetos de 20 mm de diámetro #1,5 de espesor insertados en los fondos.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>Photoshop o programas similares se pueden utilizar para pseudocolorear y fusionar imágenes ligeras, microscópicas y fluorescentes.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Para la generación de isobologramas de isocontorno bidimensionales e isobologramas de superficie tridimensionales.</td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento, en tiempo real, prueba de doble lectura de intracelular actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Las medidas tradicionales de actividad antimicrobiana intracelular y la citotoxicidad de las células eucariotas se basan en ensayos de punto final. Dichos ensayos de punto final requieren varios pasos experimentales adicionales antes de lectura de salida, tales como la lisis celular, la determinación de unidades formadoras de colonias, o la adición del reactivo. Al realizar miles de ensayos, por ejemplo, durante el cribado de alto rendimiento, el esfuerzo aguas abajo requerida para este tipo de ensayos es considerable. Por lo tanto, para facilitar el descubrimiento antimicrobiano de alto rendimiento, hemos desarrollado un ensayo en tiempo real para identificar simultáneamente inhibidores de crecimiento bacteriano intracelular y evaluar la citotoxicidad de células eucariotas. En concreto, la detección de crecimiento bacteriano intracelular en tiempo real se ha habilitado mediante el marcado de las cepas bacterianas de cribado, ya sea con un operón lux bacteriana (1 st generación de ensayo) o reporteros de proteínas fluorescentes (2ª generación, ensayo ortogonal). A, célula membrana impermeable, tinte de unión a ácido nucleico no tóxicotambién se añadió durante la infección inicial de los macrófagos. Estos colorantes se excluyen de las células viables. Sin embargo, las células huésped no viables pierden integridad de la membrana que permite la entrada y etiquetado fluorescente de ADN nuclear (ácido desoxirribonucleico). En particular, el ADN de unión se asocia con un gran aumento en el rendimiento cuántico fluorescente que proporciona una lectura basada en la solución de la muerte de la célula huésped. Hemos utilizado este ensayo combinado para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento en formato de microplacas, y para evaluar el crecimiento intracelular y la citotoxicidad por microscopía. En particular, los agentes antimicrobianos pueden demostrar la sinergia en el que el efecto combinado de dos o más agentes antimicrobianos cuando se aplica juntos es mayor que cuando se aplica por separado. Las pruebas de sinergia in vitro frente a patógenos intracelulares es normalmente una tarea prodigiosa como permutaciones combinatorias de antibióticos en diferentes concentraciones deben ser evaluados. Sin embargo, encontramos que nuestro ensayo en tiempo real combinado con automatizado, dispensación tecnología digital permitted pruebas de sinergia fácil. El uso de estos enfoques, hemos sido capaces de examinar sistemáticamente la acción de un gran número de antimicrobianos solos y en combinación contra el patógeno intracelular, Legionella pneumophila.

ensayo de crecimiento intracelular de microplacas Figura 1 Diagrama de las etapas del ensayo. Los pasos automatizados que se muestran se pueden realizar manualmente. Sin embargo, el rendimiento se facilita en gran medida el uso de sistemas de manejo de líquidos. La Figura 2 muestra los resultados representativos de una microplaca de...

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar un único ensayo combinado en tiempo real para identificar inhibidores específicos de moléculas pequeñas del crecimiento bacteriano intracelular que no sean tóxicos para las células huésped. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de agentes antimicrobianos. Concretamente, ¿qué tipos de compuestos pueden penetrar en compartimentos intracelulares y eliminar patógenos sin dañar la célula huésped? Las principales ventajas de esta técnica son que el crecimiento bacteriano y la toxicidad en células mamíferas se detectan simultáneamente mediante ensayos no destructivos y en tiempo real. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la escalabilidad que ofrece. Evaluar más de diez mil compuestos en una sesión requiere un conjunto completamente nuevo de técnicas y equipos.Además de Lucius, los becarios postdoctorales KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn y la estudiante de pregrado Kat Truelson demuestran un compromiso comunitario con el descubrimiento académico de antimicrobianos y la microbiología diagnóstica traslacional. Para preparar las células huésped, cultive el macrófago J774A.1 en suspensión en RPMI 1640, con suero de ternera suplementado con nueve por ciento de hierro.Inicialmente, pase las células en frascos de cultivo tisular. Después de que las células se hayan vuelto confluentes en un frasco de cultivo tisular de 75 centímetros cuadrados con 15 mililitros de medio, divida las células raspándolas y diluyéndolas hasta 65 mililitros con el mismo tipo de medio. Devuelva 15 mililitros al frasco de cultivo tisular y transfiera 50 mililitros a un frasco agitador bacteriano de 250 mililitros.Aerobio mediante el ajuste de la velocidad de rotación a aproximadamente 120 revoluciones por minuto. Para un crecimiento constante, incubar exactamente al cinco por ciento de dióxido de carbono y 37 grados Celsius. Recoger las células cuando alcancen una densidad en el rango de dos millones quinientas mil células por mililitro a cinco millones de células por mililitro.Asegúrese de que el porcentaje de células muertas no supere el 25 por ciento, ya que las células muertas aumentarán el ruido de fondo en los ensayos de citotoxicidad. Es fundamental evitar la sedimentación celular en los depósitos al dispensar grandes volúmenes de macrófagos y bacterias con sistemas de manipulación líquida. Agite suavemente los depósitos cada pocos minutos durante la dispensación para evitar la no uniformidad y los pozos del plato del ensayo.Siembre las células en microplacas de 384 pocillos tratadas para cultivo celular blanco, con 50.000 células en 30 microlitros de medio de cultivo celular por pocillo. Incube las microplacas durante la noche para alcanzar una confluencia del noventa por ciento el día del experimento. Prepare parches de bacterias para los experimentos, extendiendo los organismos abundantemente sobre una nueva placa BCYE e incubiándolos un día para obtener un crecimiento confluyente.Re-suspender los organismos en el mismo medio de cultivo de tejidos utilizado para las células J774A.1. Para realizar la infección de macrófagos, añadir los compuestos de prueba de interés, incluyendo compuestos de cribado, y controles positivos y negativos para la inhibición del crecimiento bacteriano en la lisis de células eucariotas.Las soluciones stock deben disolverse a una concentración mayor o igual que 500x en DMSO o en una solución acuosa, para permitir una dilución suficiente del vehículo. Diluya las bacterias luminiscentes hasta un objetivo de dos millones quinientos mil UFC por mililitro en medio de cultivo de tejidos. Luego, agregue el colorante impermeable a la membrana y no tóxico para la detección de ácidos nucleicos a una concentración final de 2,5x en el ensayo.Añada 20 microlitros de esta mezcla a cada pocillo de cultivo. El volumen final del ensayo es de 50 microlitros y la concentración bacteriana final debe ser de un millón de UFC por mililitro para el reportero lux epron, o de cuatro millones de UFC por mililitro para el reportero de proteína fluorescente. Incube a 37 grados Celsius durante uno a tres días en un 5 por ciento de dióxido de carbono y 100 por ciento de humedad relativa para prevenir efectos de borde por evaporación.Para evitar los efectos de borde asociados con la temperatura al leer los resultados del ensayo, equilibre térmicamente las microplacas antes de la lectura de luminiscencia colocándolas en una sola capa sobre el banco de laboratorio con las tapas entreabiertas durante aproximadamente 20 minutos. Lea el crecimiento bacteriano y la toxicidad en células eucariotas en un luminómetro y fluorómetro de microplacas según corresponda para los reporteros utilizados. Devuelva las microplacas al incubador si se desea una lectura en tiempo real en puntos de tiempo posteriores.Analice los datos según se describe en el protocolo del texto. Para los experimentos de respuesta a la dosis y pruebas de sinergia, prepare los macrófagos en bacterias como antes. Justo antes de la infección de los macrófagos o del incubado axénico, utilice un sistema automatizado de manipulación de líquidos para facilitar la respuesta a una sola dosis en la configuración de pruebas de sinergia combinatoria mediante la adición directa y automatizada de diluciones de agentes antimicrobianos según el protocolo del fabricante.Añada antimicrobianos de interés experimental en una serie de diluciones dobles sucesivas. El objetivo es abarcar, en el extremo superior, una concentración que elimine completamente el crecimiento, y en el extremo inferior, una concentración que no muestre actividad evidente. Aquí se muestran resultados representativos a lo largo del tiempo para la luminiscencia bacteriana y la fluorescencia asociada a citotoxicidad.Observe los efectos contrastantes del tratamiento antimicrobiano y del detergente citotóxico para células eucariotas. Se utilizó la determinación dual de la respuesta a la dosis IC50 y CC50 en los mismos pocillos de cribado para determinar la selectividad de la antibioticadoxiciclina. La replicación bacteriana fue inhibida por concentraciones intermedias del antibiótico.Sin embargo, se observó citotoxicidad a altas concentraciones, lo que es consistente con una selectividad de aproximadamente 100. Se utilizó el mismo formato de ensayo para probar la respuesta bidimensional a la dosis en combinaciones de minociclina y azitromicina. Las isocontornos conectan puntos de igual inhibición del crecimiento intracelular.Aquí, los contornos cóncavos sugirieron fuertes efectos sinérgicos para los dos fármacos. La robótica de dispensación digital para la preparación del ensayo, la lectura en tiempo real y el formato de alto rendimiento permitieron la evaluación combinatoria de la triple sinergia. Aquí, la observación de una superficie notablemente cóncava sugiere un alto grado de efecto sinérgico para las combinaciones de minociclina, azitromicina y rifampina frente al crecimiento intracelular de Legionella pneumophila.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar lecturas de ensayos fluorescentes o luminiscentes con pruebas de citotoxicidad en tiempo real en formato de ensayo de alto rendimiento. Tras seguir este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como el microscopio confocal, para responder preguntas sobre eventos biológicos en la célula completa, que también están relacionados con su actividad antimicrobiana o citotoxicidad en células completas. Aunque estudiamos los efectos sobre la replicación de legionella, las mismas técnicas también se pueden aplicar a otros patógenos intracelulares, como Brucella y microbacterias.Concebimos por primera vez este protocolo al intentar desarrollar un ensayo lo suficientemente sencillo y confiable para utilizarlo en un formato de cribado de muy alto rendimiento. No olvide que trabajar con patógenos bacterianos, líneas celulares y equipos robóticos conlleva ciertos riesgos inherentes y se deben tomar precauciones adecuadas, como el uso de equipo de protección personal apropiado durante la realización de este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Las células de mamífero que expresan el casete del gen bioluminiscencia bacteriana...

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Los ensayos de neurotoxicidad in vitro mejorados ayudarían a la identificación de nuevos compuestos neuroprotectores. Se presenta la utilidad de un analizador celular basado en impedancia en tiempo real para determinar la citotoxicidad y la citoprotección en líneas celulares neuronales y para delinear la participación de las vías de segundo mensajero, obteniendo así información sobre el mecanismo de la neuroprotección.

Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.

Un ensayo automatizado de tinción nuclear diferencial para la determinación precisa de la citotoxicidad mitoca

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Aprende a identificar antimicrobianos intracelulares no tóxicos mediante un ensayo de alta capacidad en tiempo real. Este método permite detectar simultáneamente el crecimiento bacteriano y la citotoxicidad en células hospedadoras.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica (Video) | JoVE Journal

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

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