Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular Mycobacterium tuberculosis

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una evaluación multidimensional de cómo los compuestos afectan la supervivencia de M. tuberculosis dentro de los macrófagos humanos. Este método se centra en un ensayo de eficacia basado en luciferasa. Cuando se combina con la citotoxicidad, un ensayo de CMI puede proporcionar información útil sobre la modificación de los compuestos de HIT en el desarrollo de fármacos contra la tuberculosis.

La principal ventaja de nuestro método es que ahorra tiempo y mano de obra. Está reemplazando un ensayo de unidad formadora de colonias CFU por un ensayo basado en luciferasa. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades para lograr la consistencia con el pipeteo manual en lugar de la automatización.

Una técnica de pipeteo coherente es crucial. Cultive células THP1 en RPMI en medio completo. Mientras se mantiene una densidad celular de 0.2 a un millón de células por mililitro de medio entre pasajes.

Utilice un espectrofotómetro para medir el OD600 de una suspensión bacteriana en crecimiento activo. A continuación, calcule la densidad bacteriana utilizando el factor de conversión de 0,1 OD600 es igual a tres veces 10 a la séptima bacteria por mililitro. Pipetee suficientes bacterias para un MOI de 10 a uno en un nuevo tubo de centrífuga.

A continuación, granule las bacterias a 3.000 veces G durante 10 minutos. Para opsonizar las bacterias, agregue 50 microlitros de suero humano a 450 microlitros de RPMI 1640 y utilícelo para resuspender el pellet bacteriano a una densidad de una vez 10 a la octava bacteria por 500 microlitros de medio. Deje que la mezcla se incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, utilizando un hemocitómetro y un microscopio invertido, determine la densidad de cultivo celular de THP1. Luego, en tubos de centrífuga estériles, granule las células a 100 veces G en 37 grados Celsius durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI en medio completo a una densidad de un millón de células por mililitro.

Agregue PMA hasta una concentración final de 40 nanogramos por mililitro. Esta es la mezcla de diferenciación. M. tuberculosis opsonizada combinada con una mezcla de diferenciación THP1 a un MOI de 10 a uno.

Y alícuota la mezcla final a 100 microlitros por pocillo en una placa de fondo plano blanco de 96 pocillos. A continuación, permita que la diferenciación y la infección se incuben a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, use 100 microlitros de RPMI para lavar los pozos dos veces.

A continuación, añada los compuestos diluidos hasta las concentraciones deseadas y RPMI en medio completo. Incubar las placas durante tres días. Cuando utilice pipetas multicanal, recuerde practicar la acción lenta y constante del émbolo y coloque siempre las puntas de las pipetas en el mismo lugar dentro de cada pocillo para minimizar las perturbaciones en las células THP1.

Después de la incubación, aspire el medio de los pocillos y agregue 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo. A continuación, utilice selladores de placas adhesivas transparentes para sellar las placas. Incube las placas a 22 grados centígrados durante cinco minutos, luego use un luminómetro para obtener una lectura de un segundo por pocillo.

Para diferenciar las células THP1, después de preparar la mezcla de diferenciación como se demostró anteriormente en este video, dispense 100 microlitros de la mezcla de diferenciación en cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de celdas. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio de los pocillos y use RPMI 1640 para lavarlos dos veces.

Agregar 100 microlitros de compuestos diluidos en RPMI incompleto a los pocillos. Luego, incuba las células durante tres días. Disuelva 0,5 gramos de MTT en 100 mililitros de PBS para hacer una solución madre de cinco miligramos por mililitro.

A continuación, filtre y esterilice la solución. Dos horas y media antes del final del período de incubación de tres días, agregue 25 microlitros de solución de MTT a cada pocillo de células y complete el período de incubación. Prepare dimetilformamida o DMF al 50% NN mezclando 250 mililitros de DMF con 250 mililitros de agua desionizada.

Prepare el búfer de extracción MTT de la siguiente manera. Coloque 100 gramos de SDS en una botella de 500 mililitros y agregue 300 mililitros de 50% DMF. Aplique fuego lento para permitir que la SDS se disuelva.

Añade 10 mililitros de ácido acético puro y 12,5 mililitros de ácido clorhídrico molar. Luego, use 50%DMF para llenar la botella hasta la marca de 500 mililitros. Al final del período de tratamiento, agregue 100 microlitros de tampón de extracción a cada pocillo.

Incubar la mezcla a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, lea la absorbancia a 570 nanómetros. Para llevar a cabo un ensayo de resazurina, cultive M. tuberculosis en la fase 7H9 ADST hasta la fase midlock.

Diluir el cultivo con 7H9 ADST hasta un OD600 de 0,01. Utilice 7H9 ADST para diluir los compuestos al doble de las concentraciones de prueba. Y alícuota de 100 microlitros de cada compuesto diluido en cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos.

Transfiera 100 microlitros de la suspensión bacteriana diluida a cada pocillo. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada durante cinco días. Disuelve 10 miligramos de resazurina en 100 mililitros de agua desionizada.

Y el filtro esteriliza la solución. Agregue 30 microlitros de solución de resazurina a los pocillos. A continuación, incubar las células durante 48 horas.

El crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa. Realizar análisis cuantitativos según el protocolo de texto. Este diagrama de dispersión muestra los datos brutos de luminiscencia medidos en unidades de luminiscencia relativa para el tratamiento de diversas concentraciones de rifampicina en células M. tuberculosis y THP1.

En este gráfico, se muestra el porcentaje de reducción y luminiscencia en los pozos tratados en comparación con los pozos no tratados. La rifampicina es capaz de reducir el 99,9% de las unidades de luz relativas, o RLU, de M. tuberculosis intracelular a una concentración de 0,1 microgramos por mililitro. Similar a los resultados publicados anteriormente determinados a partir de UFC.

En esta figura, se ilustra la citotoxicidad causada por el aumento de las concentraciones de G1-1H utilizadas en el ensayo MTT. Las concentraciones de 10 y tres micromolares están claramente por debajo del punto de corte IC 50. Esta figura muestra los efectos de varias concentraciones del antibiótico apramicina en la conversión de resazurina por M. tuberculosis.

El MIC90 en caldo estaba entre 2,5 y cinco microgramos por mililitro. Esto es ligeramente superior al valor publicado anteriormente de 1,5 microgramos por mililitro. Pero todavía está dentro del rango aceptable.

Como se demuestra aquí, la evaporación se vuelve significativa para todos los experimentos con tiempos de incubación prolongados. Por lo tanto, se debe tener cuidado de mantener las incubadoras bien humidificadas para evitar inconsistencias. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar datos intracelulares fiables en tan solo cuatro días.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser cuidadoso con las células THP1 y ser coherente con el pipeteo si lo intenta sin automatización. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el cribado de alto contenido, para determinar si los compuestos afectados son bacteriostáticos o bactericidas. Después de su desarrollo, este protocolo allanó el camino para que los investigadores en el campo del descubrimiento de fármacos para la tuberculosis evaluaran rápidamente la eficacia del compuesto contra el MTB dentro de los macrófagos humanos.

No olvide que trabajar con microbacterium tuberculosis es peligroso. Use precauciones y equipo adecuado al manipular este microorganismo.