Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una evaluación multidimensional de cómo afectan los compuestos a la supervivencia de M.tuberculosis dentro de macrófagos humanos. Este método se centra en un ensayo de eficacia basado en luciferasa. Cuando se combina con un ensayo de citotoxicidad y un ensayo de CMI, puede proporcionar información útil sobre la modificación de compuestos HIT en el desarrollo de fármacos para la tuberculosis.

La principal ventaja de nuestro método es que ahorra tiempo y mano de obra. Consiste en sustituir un ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC) por un ensayo basado en luciferasa. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades para mantener la consistencia al usar pipetas manuales en lugar de automatización.

Una técnica de pipeteo consistente es crucial. Cultive células THP1 en RPMI en medio completo, manteniendo una densidad celular de 0,2 a un millón de células por mililitro de medio entre los pasajes.

Utilice un espectrofotómetro para medir la DO600 de una suspensión bacteriana en crecimiento activo. Luego, calcule la densidad bacteriana utilizando el factor de conversión de 0,1 DO600 equivalente a tres veces 10 a la séptima bacteria por mililitro. Pipetee la cantidad suficiente de bacterias para una MOI de 10 a 1 en un nuevo tubo de centrífuga.

Luego, centrifugue las bacterias a 3.000 × g durante 10 minutos. Para opsonizar las bacterias, agregue 50 microlitros de suero humano a 450 microlitros de RPMI 1640 y utilice esta mezcla para resuspender el sedimento bacteriano a una densidad de 1 × 10⁸ bacterias por 500 microlitros de medio. Incube la mezcla a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

A continuación, utilizando un hemocitómetro y un microscopio invertido, determine la densidad del cultivo celular de THP1. Luego, en tubos de centrífuga estériles, sedimente las células a 100 veces G a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en RPMI en medio completo a una densidad de un millón de células por mililitro.

Añada PMA hasta una concentración final de 40 nanogramos por mililitro. Esta es la mezcla de diferenciación. Combine *M. tuberculosis* opsonizada con la mezcla de diferenciación de THP1 a una MOI de 10 a 1.

Y alícuota la mezcla final en 100 microlitros por pocillo en una placa de 96 pocillos blanca con fondo plano. Luego, deje que la diferenciación y la infección incuben durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador humectado que contiene 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, use 100 microlitros de RPMI para lavar los pocillos dos veces.

Luego, agregue compuestos diluidos a las concentraciones deseadas y RPMI en medio completo. Incube las placas durante tres días. Al utilizar pipetas multicanal, recuerde practicar una acción lenta y constante del émbolo y siempre coloque las puntas de la pipeta en el mismo lugar dentro de cada pocillo para minimizar la perturbación de las células THP1.

Después de la incubación, aspire el medio de los pocillos y agregue 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa a cada pocillo. Luego use selladores adhesivos transparentes para placas para sellar las placas. Incube las placas a 22 grados Celsius durante cinco minutos, y luego use un luminómetro para obtener una lectura de un segundo por pocillo.

Para diferenciar las células THP1, después de preparar la mezcla de diferenciación como se demostró anteriormente en este video, distribuya 100 microlitros de la mezcla de diferenciación en cada pocillo de una placa clara de 96 pocillos con células. Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio de los pocillos y lávelos dos veces con RPMI 1640.

Añada 100 microlitros de compuestos diluidos en RPMI incompleto a los pocillos. Luego, incube las células durante tres días. Disuelva 0.5 gramos de MTT en 100 mililitros de PBS para preparar una solución stock de cinco miligramos por mililitro.

Luego, esterilice la solución por filtración. Dos horas y media antes del final del período de incubación de tres días, agregue 25 microlitros de solución de MTT a cada pocillo de células y complete el período de incubación. Prepare dimetilformamida al 50%NN o DMF mezclando 250 mililitros de DMF con 250 mililitros de agua desionizada.

Preparar el tampón de extracción de MTT como sigue. Colocar 100 gramos de SDS en un frasco de 500 mililitros y añadir 300 mililitros de DMF al 50%. Aplicar calor suave para permitir que el SDS se disuelva.

Añada 10 mililitros de ácido acético puro y 12,5 mililitros de ácido clorhídrico uno molar. Luego, utilice DMF al 50 % para llenar el frasco hasta la marca de 500 mililitros. Al final del período de tratamiento, añada 100 microlitros de tampón de extracción a cada pocillo.

Incube la mezcla a 37 grados Celsius en un incubador humedecido que contenga 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, lea la absorbancia a 570 nanómetros. Para realizar un ensayo de resazurina, cultive M.tuberculosis en 7H9 ADST hasta la fase de crecimiento exponencial.

Diluya el cultivo con 7H9 ADST hasta una DO600 de 0,01. Use 7H9 ADST para diluir los compuestos hasta dos veces las concentraciones de prueba. Y alícuote 100 microlitros de cada compuesto diluido en cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos.

Transfiera 100 microlitros de la suspensión bacteriana diluida a cada pocillo. Incube las placas a 37 grados Celsius en un incubador humedecido durante cinco días. Disuelva 10 miligramos de resazurina en 100 mililitros de agua desionizada.

Y filtre esterilice la solución. Añada 30 microlitros de solución de resazurina a los pocillos. Luego incube las células durante 48 horas.

El crecimiento bacteriano se indica mediante un cambio de color de azul a rosa. Realice el análisis cuantitativo según el protocolo descrito en el texto. Este diagrama de dispersión muestra los datos brutos de luminiscencia medidos en unidades de luminiscencia relativa para el tratamiento con diversas concentraciones de rifampicina sobre células de M. tuberculosis y THP1.

En este gráfico, se muestra el porcentaje de reducción y luminiscencia en pozos tratados en comparación con pozos no tratados. La rifampicina es capaz de reducir el 99,9% de las unidades de luz relativa, o RLU, del M. tuberculosis intracelular a una concentración de 0,1 microgramos por mililitro. Similar a los resultados previamente publicados determinados a partir de UFC.

En esta figura, se ilustra la citotoxicidad provocada por concentraciones crecientes de G1-1H utilizadas en el ensayo MTT. Las concentraciones de 10 y tres micromoles son claramente inferiores al valor umbral de IC50. Esta figura muestra los efectos de diversas concentraciones del antibiótico apramicina sobre la conversión de resazurina por M. tuberculosis.

La CMI90 en caldo osciló entre 2,5 y cinco microgramos por mililitro. Esto es ligeramente más alto que el valor publicado previamente de 1,5 microgramos por mililitro. Pero aún está bien dentro del rango aceptable.

Como se demuestra aquí, la evaporación se vuelve significativa para todos los experimentos con tiempos prolongados de incubación. Por lo tanto, es necesario tener cuidado para mantener los incubadores bien humedecidos y evitar inconsistencias. Una vez dominada, esta técnica puede proporcionar datos intracelulares confiables en tan solo cuatro días.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser cuidadoso con las células THP1 y ser constante en la pipetación si se realiza sin automatización. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el cribado de alto contenido, para determinar si los compuestos activos son bacteriostáticos o bactericidas. Tras su desarrollo, este protocolo allanó el camino para que los investigadores en el campo del descubrimiento de fármacos contra la tuberculosis evaluaran rápidamente la eficacia de compuestos frente a MTB dentro de macrófagos humanos.

No olvide que trabajar con microbacterium tuberculosis es peligroso. Utilice precauciones y equipo adecuado al manipular este microorganismo.