Evaluación de la función bioenergética en las células endoteliales vasculares cerebrales

Los objetivos generales de este procedimiento son evaluar cómo las alteraciones de la función mitocondrial afectan al desarrollo de trastornos neurológicos y diseñar terapias que tengan un efecto directo sobre las aperturas de la barrera hematoencefálica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos neurológicos, como ¿cómo se puede minimizar la muerte de las células neuronales después de un accidente cerebrovascular? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una evaluación en tiempo real de la función mitocondrial en células enteras intactas.

Después de cultivar las células endoteliales vasculares cerebrales en medio completo, en un matraz de cultivo de tejidos T75 centímetros cuadrados, a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono a 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo celular y enjuague las células con tripsina EDTA. A continuación, añada uno o dos mililitros de tripsina EDTA fresca al matraz y separe las células a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Después de confirmar que las células se han levantado bajo un microscopio invertido, detenga la reacción con la adición suave de 10 mililitros de medio celular completo fresco y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación.

Deseche el sobrenadante y lave el pellet en 10 mililitros de medio de crecimiento completo fresco para otra centrifugación. A continuación, vuelva a suspender el pellet en un medio de crecimiento completo a una concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro para el subcultivo. Después del número apropiado de subcultivos, siembre 1,6 veces 10 a la cuarta celda en 80 microlitros de medio completo por pocillo, en una placa de cultivo celular de flujo extracelular de 96 pocillos y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Cuando las células se hayan adherido a la placa, agregue el tratamiento de interés a los pocillos apropiados y devuelva las células a la incubadora. El día antes del ensayo de evaluación funcional mitocondrial, hidratar un cartucho censor de flujo extracelular con 150 microlitros de solución calibrante de flujo extracelular e incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono. A la mañana siguiente, utilice la estación de lavado de placas para cambiar el medio de cultivo celular en un medio de ensayo de flujo extracelular de pH 7.0.

Luego, incube las células a 37 grados centígrados, sin dióxido de carbono, durante 30 a 60 minutos. Cuando las células se hayan equilibrado, cargue el cartucho hidratado en el Bioanalyzer y haga clic en el botón Iniciar para comenzar la calibración. Al final de la calibración, haga clic en el mensaje Desbloquear cartucho para quitar la placa inferior del cartucho y cargar la placa de celda.

A continuación, abra el archivo de datos para obtener los valores de tasa del Bioanalyzer y exportarlos al archivo de hoja de cálculo. Dado que la cinética y la intensidad relativa de las respuestas son variadas entre los diferentes tipos de células endoteliales vasculares cerebrales, en estos experimentos se utilizaron una serie de concentraciones de bEnd. Se utilizaron 3 celdas para identificar el número óptimo de celdas para medir los niveles de tasa de consumo de oxígeno en un ensayo de perfil metabólico.

Como se observó, las respiraciones basal y máxima y la capacidad respiratoria ociosa demuestran una respuesta proporcional a la densidad celular. Sin embargo, la producción de ATP disminuye cuando se utiliza la concentración más alta de células por pocillo, lo que sugiere que un cultivo celular sobreconfluente no es adecuado para el experimento. Con las densidades de celdas óptimas que parecen ocurrir en el rango medio de números de celdas por pocillo.

Por lo tanto, los niveles esperados de la tasa de consumo de oxígeno se evaluaron en este experimento representativo utilizando una concentración celular de rango medio, lo que demuestra que las moléculas de ARNm precursoras no codificantes reducen la función mitocondrial en las células endoteliales vasculares cerebrales. Estos experimentos también demuestran que la respiración máxima y la capacidad ociosa disminuyen significativamente por la sobreexpresión de estas moléculas en las células endoteliales vasculares cerebrales a las 24 horas después de la transfección, a pesar de que la respiración basal, la producción de ATP y la fuga de protones no muestran cambios significativos. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos días.

Desde la siembra de las células hasta el acceso a la función mitocondrial, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que determinar la densidad celular óptima es extremadamente importante antes de comenzar cualquier otro procedimiento. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la viabilidad celular o los ensayos glucolíticos, para responder preguntas adicionales sobre los cambios que ocurren en la función mitocondrial debido a una disminución de la viabilidad celular o cambios en otras vías metabólicas.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la función mitocondrial usaran células intactas dentro de mitocondrias aisladas y una variedad de enfermedades, incluidas enfermedades neurológicas, cáncer o trastornos metabólicos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo acceder a la función mitocondrial en las células endoteliales vasculares cerebrales.