Name: Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende RT-PCR multiplex de célula única tras patch-clamp para analizar perfiles de expresión génica en neuronas piramidales de capa cinco. Este método permite estudiar la diversidad celular en neurociencia.

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Agradecemos al Dr. Alexandre Mourot sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por becas de la Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 y ANR-17-CE37-0010-03), BLG es apoyado por becas de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos la facilidad animal de los IBPS (París, Francia).

Los autores no tienen nada que revelar.

Sola célula multiplex RT-PCR después de patch-clamp puede probar confiablemente y simultáneamente la expresión de más de 30 genes en células electrophysiologically identificados5. Análisis de expresión génica a nivel unicelular requiere iniciadores PCR altamente eficientes. Uno de los pasos más limitantes es la colección de contenido de la celda. Su eficiencia depende del diámetro de la punta de la pipeta de parche, que debe ser tan grande como sea posible mientras que el tamaño de celda. Pipetas ...

La corteza cerebral comprende numerosos tipos de células intervienen en diversos procesos fisiológicos. Su identificación y caracterización, un requisito previo para la comprensión de sus funciones específicas, pueden ser muy difíciles dada la gran diversidad morfológica, fisiológica y molecular que caracteriza los tipos de células corticales1 ,2,3,4.
Sola célula multiplex RT-PCR se basa en la combinación de técnicas de RT-PCR y abrazadera del remiendo. Puede probar al mismo tiempo la expresión de más de 30 genes predefinidos en células electrophysiologically identificados5. La inclusión de un trazador neuronal en la pipeta de grabación adicional permite la caracterización morfológica de las células registradas después de la revelación histoquímicas6,7,8,9, 10. es una técnica muy útil para la clasificación de tipos neuronales basados en análisis multivariado de sus rasgos fenotípicos5,9,10,11,12 ,13,14. Sola celda multiplex RT-PCR también se adapta a la caracterización de células no-neuronales tales como astrocytes15,16,17y puede aplicarse prácticamente a cada cerebro estructura18, 19,20,21,22,23 y célula tipo, asumiendo que pueden grabarse en configuración de celulares.
Esta técnica es muy conveniente para la identificación de fuentes celulares y/o objetivos de transmisión sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, especialmente cuando carecen de anticuerpos específicos. Se basa en grabaciones de patch-clamp de células identificados visualmente29y así también permite la segmentación de células en un entorno específico celular8,15,16. Además desde la Citoarquitectura del tejido de cerebro se conserva en rebanadas de cerebro, este enfoque también permite el estudio de las relaciones anatómicas de las células caracterizadas con elementos neuronales y no neuronales7,8 , 18.
Ya que esta técnica es limitada por la cantidad de citoplasma cosechada y por la eficacia de la RT, la detección de mRNA expresado en número de copias bajo puede ser difícil. Aunque otros enfoques basados en la tecnología RNaseq permiten analizar el transcriptoma conjunto de células3,4,30,31, que no necesariamente necesitan caros secuenciadores de alto rendimiento disponible en cada laboratorio. Puesto que la técnica de RT-PCR multiplex de unicelular utiliza PCR de punto final, sólo requiere termocicladores ampliamente disponibles. Puede desarrollarse fácilmente en laboratorios equipados con configuraciones electrofisiológicos y no requiere de equipo costoso. Puede proporcionar, dentro de un día, un análisis cualitativo de la expresión de un conjunto predefinido de genes. Por lo tanto, este enfoque ofrece un fácil acceso a la caracterización molecular de las células de una manera rápida.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Alineación múltiple para el diseño de imprimación</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Imprimadores aleatorios</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>RNasin Inhibidores de la ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Imprimaciones PCR</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / desalado y diluido a 200 &micro; Tubos M</td></tr><tr><td>, 0,5 mL, tapa plana</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>Serie BT10 - 10 &micro; L Punta de filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &micro; L Punta de filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>Serie BT200 - 200 &micro; L Punta de filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>Serie BT1000 - 1000 y micro; L Punta de filtro</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT y PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Tampón Tris-Borato-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr> <tr><td>y Phi; X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Electroforesis Fuente de alimentación EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Electroforesis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Midi Elecrophoresis horizontal Modelo de unidad SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Electroforesis</td></tr> <tr><td>en gel de agarosaPapel liso con aspecto satinado</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Solución interna de pinza de parche</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Solución interna de pinza de parche</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Solución interna de pinza de parche</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Solución interna de pinza de parche</td></tr><tr><td>D-gluconato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Solución interna</td></tr><tr><td>de pinza de parche Solución de cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Solución interna de abrazadera de parche</td></tr><tr><td>5500 Osmómetro de presión de vapor</td><td>Wescor</td><td></td><td>Solución interna de abrazadera de parche</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Solución interna de pinza de parche</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Preparación</td></tr> <tr>de lonchas<td>Ácido quinurénico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Preparación de lonchas</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Limpieza de la configuración de la abrazadera de parche</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de pared delgada con filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Abrazadera de parche</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Abrazadera de parche</td></tr><tr><td>Microcargador Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td><td>Abrazadera de parche</td></tr><tr><td>BX51WI Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td></td><td>Pinza de parche</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/N Cámara de vídeo</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Pinza de parche</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Pinza de parche</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 paquete de software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Pinza</td></tr> de <tr><td>parche de 10 ml jeringa</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expulsión</td></tr><tr><td>Serie E con Cuerpo Recto (Soporte)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expulsión de</td></tr><tr><td>fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Gelatina de piel</td> <td>de pescado de agua fríaSigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Conjugado con flúor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Revelación histoquímica</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Revelación histoquímica</td></tr></tbody></table>

sola célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

La corteza cerebral está compuesta por numerosos tipos celulares exhibe varias características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Esta diversidad dificulta la identificación y caracterización de estos tipos de celulares, requisitos previos para el estudio de sus funciones específicas. Este artículo describe el protocolo de reacción en cadena (RT-PCR) multiplex unicelular transcripción reversa polimerasa, que permite, después de patch-clamp en rebanadas, para detectar simultáneamente la expresión de decenas de genes en una sola celda. Este sencillo método puede aplicarse con caracterización morfológica y es ampliamente aplicable para determinar los rasgos fenotípicos del diversos tipos celulares y su entorno celular particular, como en las proximidades de los vasos sanguíneos. El principio de este protocolo es para registrar un celular con la técnica de patch-clamp, cosecha e invertir transcribir su contenido citoplásmico, y para detectar cualitativamente la expresión de un conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requiere un diseño cuidadoso de la abrazadera del remiendo intracelular solución compatible con RT-PCR y primers PCR. Para asegurar una transcripción selectiva y confiable detección, esta técnica también requiere controles apropiados de citoplasma cosechar a pasos de amplificación. Aunque aquí debe ser estrictamente precauciones, prácticamente cualquier laboratorio electrofisiológico puede usar el múltiplex célula técnica de RT-PCR.

Un representante de validación multiplex RT-PCR se muestra en la figura 3. El protocolo fue diseñado para probar simultáneamente la expresión de genes diferentes 12. El vGluT1 del transportador de glutamato vesicular fue tomada como control positivo para glutamatérgica neuronas42. El GABA síntesis de enzimas (GAD65 y GAD 67), el neuropéptido Y (NPY) y la somatostatina (SOM) fueron utilizados como marcadores de GABAérgico interneuronas<...

Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación en neurociencia, como la caracterización de la población neurológica o la identificación de fuentes y objetivos de los sistemas de transmisión. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar el perfil de expresión de un conjunto preseleccionado de genes de una sola célula de forma rápida y sencilla. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el ratón de diversidad aleatoria.También se puede aplicar a otros tipos de células, como los astrocitos y en muchos modelos animales. Esta demostración de este método es crítica, ya que los pasos de detención y aspiración pueden ser difíciles de aprender porque los datos necesitan una cantidad de citoplasma para ser analizados. Antes de seccionar, prepare un kit de disección que contenga tijeras quirúrgicas, tijeras finas para iris, dos espátulas, pinzas, un disco de filtro de papel y pegamento para cianoacrilato.A continuación, sature la solución de corte helada con carbogina y enfríe la cámara de corte a 20 grados centígrados negativos. A continuación, retira el cuero cabelludo del animal y abre el cráneo. Extraiga el cerebro con cuida

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Investigación

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Neurociencia

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Las neuronas se caracterizan primera electrofisiológica. A continuación, el citoplasma de las neuronas registradas se aspira y se somete a la transcripción reversa-PCR y análisis para detectar la expresión de ARNm para enzimas síntesis de neurotransmisores, canales iónicos y receptores.

Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

Perfiles de expresión de células individuales permite el análisis detallado de la expresión génica de células individuales. Se describen los métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos, y la preparación de los lisados ​​resultantes, ya sea para toda microarrays transcriptoma o qPCR de objetivos específicos.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

Este artículo describe cómo se determina la selectividad iónica de la canalrodopsina con registros electrofisiológicos de patch-clamp de células completas utilizando células HEK293. Aquí, se demuestra el procedimiento experimental para investigar la selectividad del cloruro de una canalrodopsina selectiva de aniones. Sin embargo, el procedimiento es transferible a otras rodopsinas de clara selectividad.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Aprende RT-PCR multiplex de célula única tras patch-clamp para analizar perfiles de expresión génica en neuronas piramidales de capa cinco. Este método permite estudiar la diversidad celular en neurociencia.

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

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