Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación en neurociencia, como la caracterización de la población neurológica o la identificación de fuentes y objetivos de los sistemas de transmisión. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar el perfil de expresión de un conjunto preseleccionado de genes de una sola célula de forma rápida y sencilla. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el ratón de diversidad aleatoria.

También se puede aplicar a otros tipos de células, como los astrocitos y en muchos modelos animales. Esta demostración de este método es crítica, ya que los pasos de detención y aspiración pueden ser difíciles de aprender porque los datos necesitan una cantidad de citoplasma para ser analizados. Antes de seccionar, prepare un kit de disección que contenga tijeras quirúrgicas, tijeras finas para iris, dos espátulas, pinzas, un disco de filtro de papel y pegamento para cianoacrilato.

A continuación, sature la solución de corte helada con carbogina y enfríe la cámara de corte a 20 grados centígrados negativos. A continuación, retira el cuero cabelludo del animal y abre el cráneo. Extraiga el cerebro con cuidado y colóquelo en un pequeño vaso de precipitados lleno de solución de corte helada carbugenada.

Luego, retire la cámara de corte de menos 20 grados centígrados y elimine la humedad con una toalla de papel. Disecciona cuidadosamente el cerebro para aislar la región de interés. Péguelo a la cámara de corte y agregue la solución de corte carbuginada y helada.

Con un vibratono, corte rodajas de 300 micrómetros de grosor. Transfiera las rodajas a una cámara de reposo llena de solución de corte oxigenada a temperatura ambiente y deje que se recuperen durante al menos 30 minutos. Para la RT-PCR de una sola célula y la caracterización de células dirigidas, limite el registro de células completas a no más de 20 minutos para preservar la ARNm.

Al final de la grabación, prepare un tubo de PCR de 500 microlitros lleno de dos microlitros de mezcla 5xRT y 0,5 microlitros de 20xDTT. Gíralo y guárdalo en hielo. A continuación, recoja el citoplasma de la célula aplicando una suave presión negativa.

Supervise y controle el contenido de la célula para que no entre en la pipeta mientras mantiene un sello hermético y evite recoger el núcleo si se consideran algunos genes. En el caso de los genes, es fundamental evitar la recolección del núcleo e incluir un conjunto de cebadores destinados a amplificar el ADNg para prepararse para la contaminación general. Si el núcleo se está acercando a la punta de la pipeta, libere la presión negativa y aleje la pipeta.

Asegúrese de que se conserva el cierre hermético y reinicie la recolección del citoplasma en la nueva ubicación de la pipeta. A continuación, retire la pipeta suavemente para formar un parche de exterior hacia afuera para limitar la contaminación por los residuos extracelulares y favorecer el cierre de la membrana celular para su posterior análisis histoquímico. Tenga en cuenta que las protuberancias, los micromanipuladores, el teclado de la computadora o el mouse de la computadora son fuentes cargadas de protones de contaminación por rnasa.

Si se han tocado durante la grabación, cámbiese los guantes. A continuación, conecte la pipeta al expulsor y expulse su contenido en el tubo de PCR aplicando presión positiva. Rompa la punta de la pipeta en el tubo de PCR para ayudar a la recolección de su contenido.

A continuación, centrifugar brevemente el tubo, añadir 0,5 microlitros de inhibidor de ARNasa y 0,5 microlitros de RTAsa. Mezclar suavemente, centrifugar de nuevo e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, gire el tubo y guárdelo a menos 80 grados centígrados durante varios meses.

Hasta el análisis por PCR y la realización del primer paso de amplicación. Para validar la PCR, mezcle y diluya un par de cebadores, agregue un micromolar con la pipeta dedicada al RTPCR de una sola célula. Configure el termociclador durante tres minutos a 95 grados centígrados, ejecute 40 ciclos seguidos de un paso final de elongación a 72 grados centígrados durante cinco minutos.

Para minimizar la formación de dímeros de cebador, realice un arranque en caliente colocando los tubos de PCR en el termociclador precalentado a 95 grados centígrados. Después de 30 segundos, expulse rápidamente 20 microlitros de la mezcla de cebador sobre el aceite. Una vez que se haya validado el par de cebadores, pruébelo con el protocolo multiplex.

Mezcle y diluya la imprimación externa en un micromolar. Guarde la mezcla de cebador multiplex a 20 grados centígrados bajo cero durante varias semanas. A continuación, prepara una premezcla y colócala sobre hielo.

Agite el tubo de PCR y gírelo y agregue dos gotas de aceite mineral. Después de tres minutos a 95 grados centígrados, ejecute 20 ciclos de PCR. Realice un arranque en caliente como se describe con 20 microlitros de mezcla de cebador multiplex.

A continuación, prepare un número de tubos de PCR idéntico al número de genes que se van a analizar. Prepare una premezcla utilizando un microlitro del primer producto de PCR por gen como plantilla. Ajuste todos los volúmenes de acuerdo con el número de genes a analizar y considere usar un 10% de volumen adicional para compensar los errores de pipeteo.

Agite suavemente, gire el tubo y envíe 80 microlitros de premezcla a cada tubo de PCR. Agregue dos gotas de aceite mineral por tubo sin tocar la pared o la tapa de los tubos. Ejecute 35 ciclos de PCR y luego realice un arranque en caliente expulsando 20 microlitros de mezcla de cebador interno.

Analizar los segundos proyectos de PCR por electroforesis en gel de aragosis. Una neurona piramidal de capa cinco fue identificada visualmente por su gran soma y una dendrita apical prominente. El registro de células de atracción reveló las propiedades electrofisiológicas típicas de las neuronas de pico regulares de la capa cinco con una baja resistencia de entrada, potenciales de acción duraderos y una adaptación pronunciada a la frecuencia de pico.

El análisis molecular de esta neurona reveló la expresión de vGluT1, confirmando su fenotipo glutamitérgico. Esta neurona también expresaba somatostatina y el ATP1-alfa-1 y tres subunidades de los ATPA de sodio-potasio. El marcaje con biocitina de las neuronas registradas confirmó una morfología piramidal.

Como se esperaba de las neuronas glutamitérgicas, el análisis molecular de 26 células piramidales de capa cinco, reveló la expresión de vGluT1 pero ninguno de los dos GADs. Una técnica se puede hacer en dos días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener mucho cuidado para evitar contaminaciones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sondear la expresión de 10s de genes simultáneamente a partir de células individuales caracterizadas por grupos de parches de acuerdo con cortes de cerebro, después de la recolección de citoplasma, la transcripción inversa y las PCR de inicio en caliente. No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y batas de laboratorio al realizar este procedimiento.