Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones

El objetivo general de este protocolo es presentar el procedimiento de recubrimiento pulpar directo en ratones. Este método puede ayudarlo a responder preguntas clave en la biología de la pulpa, como cómo se cura la pulpa o cómo se forma la dentina reparadora cuando coloca materiales de recubrimiento de pulpa atrapados en la pulpa expuesta. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de recubrimiento directo de la pulpa realizado en humanos también se puede realizar en ratones, exactamente de la misma manera.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de las propiedades del material para salvar dientes que, de otro modo, estarían condenados a ser tratamientos más invasivos, como la endodoncia. Después de anestesiar adecuadamente al ratón para el procedimiento, coloque el soporte de la boca en su boca y asegure el otro extremo a la mesa de modo que la cabeza quede hacia arriba. Con buena iluminación y un estereoscopio, observe el primer molar maxilar.

A continuación, utilizando la fresa de cuarto de círculo en una pieza de mano de alta velocidad a 200.000 rpm, retire la región central del esmalte del diente hasta que la pulpa sea visible a través de la dentina transparente. Tenga cuidado de no penetrar en la pulpa. A continuación, usando un no.

15 limas endodónticas, perforan a través de la dentina y exponen la pulpa. No empuje ningún residuo en la pulpa; Esto se puede evitar rotando el archivo k trimestralmente y luego sacando el archivo k. Ahora, prepare el MTA y, con el explorador, entregue el MTA y, a continuación, empaquételo en la región expuesta utilizando el reverso del punto de papel y dando golpecitos suaves.

A continuación, utilizando una jeringa cargada con un 35% de ácido fosfórico, cubra el diente con el grabador, evitando los tejidos gingivales, y deje que el grabador actúe durante 15 segundos. Después de 15 segundos, chupe el grabador del diente y use un aplicador de algodón humedecido con agua para limpiar cualquier resto de grabador. Chupe y limpie hasta que se elimine todo el grabador.

A continuación, aplique los adhesivos dentales utilizando el reverso de la punta de papel. Adelgaza la capa adhesiva soplándola con aire comprimido durante unos segundos. A continuación, cure el adhesivo durante 30 segundos con la luz adecuada.

Ahora, coloque pequeñas cantidades de composite en el diente usando la punta del explorador para hacer fluir el composite hacia las ranuras de los dientes. Una vez aplicado, cura el composite durante 30 segundos. Después de sacrificar al ratón y extirpar todo el maxilar, coloque la mandíbula en paraformaldehído al 4% en PBS a pH 7.4.

Mantenga el tejido a 4 grados centígrados durante la noche y, a la mañana siguiente, transfiéralo a etanol al 70% para almacenarlo hasta que pueda procesarse. Para tomar una micro tomografía computarizada del maxilar, primero asegúrelo en una gasa empapada con etanol al 70%, luego empaquételo en un tubo de cultivo celular de 15 mililitros. A continuación, monte el tubo en la platina de exploración micro CT.

A continuación, configure la fuente de rayos X para que suministre una corriente de 145 microamperios con 55 kilovoltios máximos durante 200 milisegundos. Utilizando un filtro de aluminio de 0,5 milímetros, adquiera imágenes con una resolución de 20 micras. Una vez completadas las exploraciones, comience a descalcificar el maxilar con 5% de EDTA y 4% de sacarosa en PBS, a un pH de 7,4.

Deja que esta reacción dure dos semanas a 4 grados centígrados. Después de incrustar el maxilar, haga rodajas de cinco micras de grosor. Las áreas de recubrimiento de la pulpa suelen coincidir con la raíz palatina distal, que puede utilizarse como punto de referencia.

Determine el área precisa de interés examinando la histología bajo el microscopio óptico y comparando los resultados con las microtomografías computarizadas. Para la tinción de H&E, retire la parafina y rehidrate los portaobjetos con dos baños de xileno durante unos minutos cada uno. Luego pásalos a través de una serie de etanol diluido en serie.

Cada baño debe aplicarse durante solo un minuto. Siga la rehidratación con un enjuague. Y luego aplique la solución de hemotoxilina durante dos minutos y medio.

Retire el tinte con un enjuague y luego coloque los portaobjetos en etanol al 95% durante un minuto. A continuación, tiñe los portaobjetos con una solución de eosina durante un minuto y luego enjuágalos. Invierta los pasos de hidratación para deshidratar los tejidos manchados, comenzando con etanol.

Luego, trátalos con xileno. A continuación, se pueden montar y obtener imágenes de las diapositivas. Utilizando los procedimientos descritos, se realizó el taponado pulpar en ratones de 8 semanas de edad.

Seis semanas después, se extrajeron y examinaron sus maxilares. Curiosamente, la tinción con H&E reveló la formación de dentina en toda la cámara pulpar y los conductos radiculares. Comparativamente, el molar destapado no mostró la misma formación de dentina.

En el molar tapado, había características de formación tanto de dentina como de hueso, ya que se encontraron túbulos dentinarios y osteocitos en la dentina reparadora, lo que sugiere que la pulpa lesionada puede ser mineralizada tanto por los odontoblastos residentes como por los osteoblastos inmigrados. El uso de la tinción inmunohistoquímica con DMP1 confirmó aún más el aumento de las actividades de las células que forman dentina reparadora. Al igual que las prácticas clínicas dentales reales, tener un asistente es extremadamente útil.

Por ejemplo, con un asistente, esta técnica se puede hacer en solo diez minutos, una vez dominada. Es importante destacar que cuando exponga la pulpa, recuerde usar endofile, no la fresa. Y cuando entregue el MTA, tenga cuidado.

No olvide que trabajar con fijadores como el paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal.