Name: Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprenda el procedimiento de recubrimiento pulpar directo en ratones para evaluar la curación de la pulpa y la formación de dentina reparadora. Este método permite estudiar la biología pulpar in vivo con aplicaciones en odontología regenerativa.

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Este estudio fue apoyado por R01DE023348 (RHK) del NIDCR / NIH y la Beca de Investigación de la Facultad (RHK) del Consejo de Investigación del Senado Académico de la División de la Universidad de California en Los Ángeles.

Los ratones fueron adquiridos de Jackson Laboratory y se mantienen en un vivero libre de patógenos en la División de UCLA de Medicina de Laboratorio Animal (DLAM). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales aprobados desde el Comité de Investigación Animal del Canciller (ARC # 2016-037). 1. Ratón anestesia <ol><li> Utilizar ratones hembra C57 / BL6 de ocho semanas de edad (n = 3). </li><li> Anestesiar los ratones utilizando ketamina (80 a 120 mg / kg de peso de ratón) / xilazina soluciones (5 mg / kg de peso de ratón) y administrar por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg. </li><li> Preparar ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluciones y administrarlos por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg. </li><li> Confirman que los ratones están completamente anestesiados mediante la realización de una pizca dedo del pie. </li></ol> 2. Procedimiento de recubrimiento pulpar <ol><li> Coloque el soporte de boca en la boca del ratón. </li><li> Fije el soporte boca sobre la mesa de manera que la quead quede hacia arriba. </li><li> Coloque el microscopio (10X) en la parte superior de la boca de manera que el primer molar superior es totalmente visible. </li><li> El uso de la fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad a 200.000 rpm, quitar la parte de esmalte del diente en el medio hasta que la pulpa es visible a través de la dentina transparente. No exponer la pulpa con la fresa. </li><li> El uso de un K-lima de endodoncia # 15 (diámetro de 150 micras), perforar a través de la dentina y exponer la pulpa. NOTA: Se debe tener especial cuidado para que los restos de dentina no consigue empujado en la pulpa. Esto se puede evitar mediante la rotación del archivo-K trimestral y luego tirando de la K-archivo fuera. </li><li> Mezclar MTA con H2O estéril de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entregar y colocar el MTA en la pulpa expuesta con la punta del explorador. Utilice el lado posterior de la punta de papel (fino) para empacar el MTA en la pulpa expuesta con unos golpecitos suaves. La parte gruesa de la punta de papel es plano y por lo tanto permitepara la condensación adecuado de la MTA en la pulpa expuesta. </li><li> Grabar el diente durante 15 s, colocando el grabador de ácido fosfórico al 35% cuando sólo cubre el diente. Tenga especial cuidado para limitar la colocación del reactivo de ataque, ya que puede irritar los tejidos gingivales. NOTA: El reactivo de ataque viene en una jeringa y se utiliza para hacer rugosa la superficie de los dientes de modo que los adhesivos dentales pueden fluir en mediar la unión micromecánica sobre el diente. Debido a que son viscoso, puede ser en sí misma mediante la aplicación de pequeñas cantidades directamente en el diente. </li><li> Utilice negativa de succión-presión para eliminar el reactivo de ataque. Utilice una bolita de algodón que se empapa ligeramente con H 2 O para eliminar los residuos de la solución de ataque. Repita este paso hasta que el grabador se elimina por completo del diente. </li><li> El uso de un limpiador de aire comprimido, secar suavemente el diente. </li><li> Aplicar los adhesivos dentales utilizando el lado posterior de la punta de papel. </li><li> Hacer que la capa adhesiva delgada con aire comprimido durante 3 s. </li><li> doUre los adhesivos dentales durante 20 s usando la unidad de curado por luz. </li><li> Coloque el composite fluido en pequeñas cantidades sobre el diente que fue internacional con MTA. Use la punta del explorador a fluir el material compuesto en las ranuras de los dientes. </li><li> Curar el material compuesto durante 30 s usando una unidad de fotocurado para polimerizar la misma. Confirmar que el compuesto está completamente curado y duro usando el explorador. </li></ol> 3. Post-op Cuidado <ol><li> Administrar carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea (sc) inmediatamente después del procedimiento de recubrimiento pulpar. </li><li> Coloque los ratones en una almohadilla térmica a baja potencia para mantener a los animales tibia antes de que despierten. </li><li> Devolver los ratones para el vivero de la vivienda. </li></ol> Contratación 4. Tejido <ol><li> Después de 5 - 6 semanas, la eutanasia a los ratones por dislocación cervical bajo una condición de anestesia completa con isoflurano. </li><li> Retirar con cuidado el maxilar superior fuera de la base del cráneo y lo puso en un tubo de 50 ml. Fijar la entire maxilar que contiene tanto el diente pulpa-tapado y destapado el diente contralateral en 4% de paraformaldehído en PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante la noche, y luego la almacena en una solución de etanol al 70%. NOTA: El paraformaldehído es tóxico y cancerígeno. El uso adecuado de paraformaldehído debe controlarse como se indica en los procedimientos operativos estándar (SOP). </li><li> Analiza los maxilares ratón usando el escaneo μCT. Para asegurar el maxilar durante la exploración, envolver las muestras con una gasa empapada con 70% de etanol y colocarlos en el tubo de cultivo de células de 15 ml. </li></ol> 5. Escaneo μCT <ol><li> Preparar las muestras para μCT de exploración. Brevemente, las muestras envolver con una gasa empapada con 70% de etanol y fijarlos en un tubo cónico de cultivo de células de 15 ml genérico. Montar el tubo en la etapa de exploración μCT, como se indica en las instrucciones del fabricante. </li><li> Ajuste la fuente de rayos X a una corriente de 145 mu, una tensión de 55 kVp, y un tiempo de exposición de 200 ms. </li><li> Realizar la adquisición de imágenes con el escáner μCT a una resolución de 20 micras y con un filtro de 0,5 mm de Al. </li><li> Reconstruir la imagen y visualizarlo 11. </li><li> Una vez que la exploración μCT, inicie descalcificación con EDTA al 5% y 4% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 2 semanas. </li></ol> 6. procesamiento de tejido y tinción <ol><li> Incrustar los tejidos descalcificadas en parafina. Antes de ser colocado, recortar el maxilar haciendo un corte sagital de inmediato anterior al del primer molar. Si bien la incrustación, la posición de esta superficie hacia abajo, de manera que la sección longitudinal de la primera molar es la superficie de corte. </li><li> Usando el microtomo, preparar las diapositivas 5 micras de grosor. Las áreas de recubrimiento pulpar generalmente coinciden con la raíz distopalatina (DP), que puede ser utilizado como un punto de referencia. Determinar el área exacta de interés mediante el examen de la histología en el microscopio óptico y la comparación de las imágenes μCT. </li><li> Para tinción H &amp; E, deparaffinize y rehidratar los portaobjetos con xileno (2 x) y etanol diluido en serie (100% EtOH 2x, 95% de EtOH 2x, y 70% de EtOH 1x). </li><li> Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo. </li><li> Teñir con una solución de hematoxilina durante 2,5 minutos y enjuagar con agua del grifo. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 95% de etanol durante 1 min. </li><li> Teñir con una solución de eosina durante 1 min y enjuague con agua del grifo. </li><li> Deshidratar con etanol diluido en serie (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, y 100% EtOH 3x) y xileno (3x). </li><li> Montar los portaobjetos con solución de montaje. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Actualmente, hay varios modelos experimentales disponibles para validar los efectos in vivo de los materiales dentales, andamios, o factores de crecimiento sobre la diferenciación odontogénico de células madre de la pulpa dental (DPSCs) 13. Estos modelos incluyen el trasplante autólogo de ectópico DPSCs en un órgano, tales como la cápsula renal, o trasplante subcutáneo de DPSCs en ratones inmunocomprometidos con andamios 14,15. Sin embargo, estos métodos están limitados en que su efecto od...

Las caries dentales son una de las enfermedades bucales más prevalentes y la principal causa de intervenciones quirúrgicas en dentición en casi todos los individuos1,2. El pronóstico de las intervenciones quirúrgicas y las restauraciones de un diente depende en gran medida de la respuesta pulpar adecuada y de la cicatrización exitosa de la herida. De hecho, las caries dentales que penetran profundamente a través del esmalte y la dentina con frecuencia conducen a la exposición del tejido pulpar subyacente que a menudo está "cubierto" con materiales dentales, como hidróxido de calcio (Ca(OH)2) o cementos hidráulicos de silicato de calcio (HCSC), incluidos los agregados de trióxido mineral (MTA). El objetivo final de este procedimiento de taponamiento pulpar es acelerar la cicatrización de las heridas pulpares mediante la regeneración de la dentina reparadora, una barrera física que funciona como un "sello biológico" para proteger el tejido pulpar subyacente y aumentar la esperanza de vida del diente y la salud bucal en general. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la cicatrización de las heridas pulpares y la formación de dentina reparadora no se comprende completamente.
Para comprender mejor los mecanismos de cicatrización de heridas pulpares y la formación de dentina reparadora in vivo, se utilizaron previamente varios animales, incluidos monos, perros y cerdos3-5. Entre ellos, las ratas se utilizan con frecuencia porque son relativamente más pequeñas en tamaño en comparación con los otros animales, pero sus dientes son lo suficientemente grandes como para realizar el taponado pulpar directo sin ninguna dificultad técnica6-10. Estos modelos animales son alternativas ideales a los estudios en humanos para examinar las respuestas pulpares y la formación reparativa de dentina. Sin embargo, su utilización se limita a estudios observacionales a nivel celular, y apenas proporcionan información mecanicista durante la formación de dentina reparadora a nivel molecular.
Los recientes avances técnicos en ingeniería genética proporcionaron herramientas de investigación invaluables e indispensables -ratones que albergan un gen que se sobreexpresa o se elimina- que son fundamentales para estudiar los mecanismos moleculares de las enfermedades humanas in vivo. El número de diferentes cepas de ratones transgénicos o knockout que son estratégicamente inducibles de una manera específica para cada célula está creciendo continuamente en la comunidad científica. Por lo tanto, examinar la cicatrización de heridas pulpares y la regeneración reparadora de la dentina en estos ratones ayudaría en gran medida a acelerar nuestra comprensión de estos procesos a nivel molecular. Sin embargo, el uso de ratones se amortigua significativamente, ya que realizar un procedimiento de recubrimiento de pulpa en un diente de ratón es técnicamente desafiante debido a su tamaño en miniatura. Aquí, presentamos nuestro método reproducible de realizar el recubrimiento pulpar directo en ratones para la evaluación de la cicatrización de heridas pulpares y la formación de dentina reparadora in vivo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio estereoscópico BM-LED</td><td>MEIJI Techno</td><td></td><td>Microscope&nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>Motor eléctrico</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Henry Schein salud animal</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 fresa redonda</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>Endodoncia K-file</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>Punto de papel</td><td>Henry schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent producto Inc.</td><td></td><td>Grabador de ácido fosfórico</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>Adhesivos</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/whaledent Inc.</td><td>C7970100115</td><td>Unidad de luz de polimerización</td></tr><tr><td>Tinte de caracterización</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>Compuesto fluido</td></tr><tr><td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>uCT</td></tr> escáner <tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>Microtomo</td></tr><tr><td>Hematoxilina-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16 Solución de</td><td>montaje</td></tr></tbody></table>

desarrollo de un modelo de recubrimiento pulpar directo para la evaluación de la pulpa curación de heridas y formación de dentina reparadora en ratones

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

La pulpa dental es un órgano vital de un diente totalmente protegido por el esmalte y la dentina. Cuando la pulpa está expuesta debido a lesiones cariogénicas o iatrogénicas, a menudo se cubre con materiales biocompatibles para acelerar la cicatrización de la herida pulpar. El objetivo final es regenerar la dentina reparadora, una barrera física que funciona como un "sello biológico" y protege el tejido pulpar subyacente. Aunque este procedimiento de recubrimiento pulpar directo se ha utilizado durante mucho tiempo en odontología, el mecanismo molecular subyacente de la cicatrización de heridas pulpares y la formación reparadora de dentina aún no se conoce bien. Para inducir la dentina reparadora, el recubrimiento pulpar se ha realizado experimentalmente en animales grandes, pero menos en ratones, presumiblemente debido a sus pequeños tamaños y a las dificultades técnicas resultantes. Aquí, presentamos un método detallado, paso a paso, para realizar un procedimiento de recubrimiento de pulpa en ratones, incluida la preparación de una cavidad similar a la Clase I, la colocación de materiales de recubrimiento de pulpa y el procedimiento de restauración con compuesto dental. Nuestro modelo de ratón con recubrimiento pulpar será fundamental para investigar los mecanismos moleculares fundamentales de la cicatrización de heridas pulpares en el contexto de la dentina reparadora in vivo, al permitir el uso de ratones transgénicos o knockout que están ampliamente disponibles en la comunidad investigadora.

A continuación, mostramos los procedimientos paso a paso para llevar a cabo el recubrimiento pulpar de los dientes ratones. Uno de los aspectos clave de recubrimiento pulpar en ratones es tener el aparato apropiado. En este sentido, teniendo el microscopio con un aumento de potencia de 10X es esencial (Figura 1A). Para crear una preparación de Clase-I-al igual que en el diente, se utilizó una fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad eléctrica a 200.000...

Se describe un método paso a paso de realizar el recubrimiento pulpar directo en ratones dientes para la evaluación de la cicatrización de la herida pulpar y la formación de dentina de reparación in vivo.

Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

El objetivo general de este protocolo es presentar el procedimiento de recubrimiento pulpar directo en ratones. Este método puede ayudarlo a responder preguntas clave en la biología de la pulpa, como cómo se cura la pulpa o cómo se forma la dentina reparadora cuando coloca materiales de recubrimiento de pulpa atrapados en la pulpa expuesta. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de recubrimiento directo de la pulpa realizado en humanos también se puede realizar en ratones, exactamente de la misma manera.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de las propiedades del material para salvar dientes que, de otro modo, estarían condenados a ser tratamientos más invasivos, como la endodoncia. Después de anestesiar adecuadamente al ratón para el procedimiento, coloque el soporte de la boca en su boca y asegure el otro extremo a la mesa de modo que la cabeza quede hacia arriba. Con buena iluminación y un estereoscopio, observe el primer molar maxilar.A continuación, utilizando la fresa de cuarto de círculo en una pieza de mano de alta velocidad a 200.000 rpm, retire la región central del esmalte del diente hasta que la pulpa sea visible a través d

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Un modelo murino de cicatrización de heridas cutáneas que se puede utilizar para evaluar los compuestos terapéuticos en los entornos fisiológicos y fisiopatológicos.

Modelo murino de Curación de Heridas

Aquí, presentamos un protocolo para inducir localmente la periodontitis apical en ratones. Mostramos cómo perforar un agujero en el diente del ratón y exponer su pulpa, con el fin de causar inflamación local. También se demuestran métodos de análisis para investigar la naturaleza de esta inflamación, como la microtomografía y la histología.

Inducir la Periodontitis Apical en Ratones

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Este protocolo muestra detalles paso a paso de cómo extraer el primer molar mandibular en el ratón. Proporciona un método alternativo para los investigadores que se centran en la curación y regeneración de la mandíbula.

El establecimiento de un modelo de curación del alvéolo de extracción molar mandibular murina

En este artículo se presenta un protocolo simplificado para establecer un modelo de pulpitis en ratones utilizando una mordaza bucal innovadora, seguido de un análisis histológico posterior.

Establecimiento de un modelo de exposición a la pulpa murina con una mordaza bucal novedosa para la investigación de la pulpitis

Este estudio presenta dos técnicas experimentales cruciales: la construcción de un modelo de herida murina para evaluar el cierre de la herida y la preparación de suspensiones unicelulares de piel murina para preservar la viabilidad celular.

Modelos de heridas en ratones y preparación de suspensiones de células únicas

La microdureza es una propiedad mecánica y un parámetro informativo para evaluar la fisiopatología de los tejidos duros. Aquí, demostramos un protocolo estandarizado (preparación de muestras, pulido, superficie plana y sitios de indentación) para el análisis de microdureza en dientes y huesos alveolares en modelos de enfermedades orales en roedores, a saber, fluorosis dental y resorción ósea periodontal inducida por ligaduras.

Mediciones de microdureza en hueso dental y alveolar en modelos de enfermedades orales en roedores

Las heridas representan un desafío para la salud mundial. Este estudio desarrolló un fotomatón estandarizado que utiliza planimetría digital para minimizar la variabilidad de la medición de heridas. El seguimiento de las heridas en ratones durante 14 días reveló un aumento inicial en el área y el perímetro de la herida, seguido de un cierre gradual. Esta metodología puede ayudar a evaluar la cinética de cierre de heridas en modelos preclínicos.

Planimetría digital para evaluar la cinética de cierre de heridas en un modelo de ratón

Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Aprenda el procedimiento de recubrimiento pulpar directo en ratones para evaluar la curación de la pulpa y la formación de dentina reparadora. Este método permite estudiar la biología pulpar in vivo con aplicaciones en odontología regenerativa.

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