Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

El objetivo general de este enfoque proteómico es la caracterización de la reorganización molecular en las sinapsis tras la formación del aprendizaje y la memoria, con el fin de comprender los mecanismos básicos y las vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica es su enfoque libre de hipótesis, que permite la cuantificación y caracterización a gran escala de modificaciones postraduccionales dentro de los proteomas sinápticos. Nuestro protocolo establecido permite establecer una correlación entre un cambio molecular específico y un comportamiento particular.

El aprendizaje y la formación de la memoria se basan en cambios de la eficacia sináptica, por lo que los estudios proteómicos deberían centrarse más en el análisis de estructuras sinápticas como los sinaptosomas que en homogenatos de tejido cerebral. Los resultados proteómicos representan conjuntos de datos altamente complejos que por tanto requieren procesamiento bioinformático. Comience el entrenamiento colocando el ratón de prueba en una caja de tránsito con luz tenue dentro de una cámara insonorizada.

Utilice un programa de aprendizaje completamente controlado por computadora para el aprendizaje de la discriminación auditiva. Comience con un período de habituación de tres minutos de silencio antes de iniciar la sesión de entrenamiento. Durante los ensayos de tipo "go", el animal debe cruzar el obstáculo dentro de los seis segundos posteriores a la presentación del tono para obtener un acierto.

Durante los ensayos de no-ir, el animal debe permanecer en el compartimento actual de la caja de traslado durante los seis segundos de presentación del tono. Realice 30 ensayos de ir y 30 ensayos de no-ir en un orden pseudoaleatorio, con un intervalo entre ensayos de 20 segundos, de modo que una sesión conste de 60 ensayos y dure aproximadamente 25 minutos. Una vez realizados todos los ensayos, devuelva el ratón entrenado a su jaula de alojamiento hasta el sacrificio.

Tras sacrificar el ratón y extraer el cerebro, localice la corteza auditiva utilizando referencias visuales como los vasos sanguíneos y la forma de la superficie. Luego, utilice un escalpelo y una aguja para diseccionar bilateralmente la corteza auditiva como un bloque de tejido rectangular. Utilizando el quiasma ópticum como referencia, seccione la corteza frontal como una laminilla cerebral entre Bregma 3,56 y 1,54.

Disecar el estriado como una rebanada cerebral entre el bregma 1,54 y 0,5. Y eliminar cuidadosamente el tejido cortical. Disecar el hipocampo estabilizando el cerebro con la aguja a través del cerebelo y desenrollando la corteza comenzando por el lóbulo occipital.

Congele rápidamente las muestras de cerebro disecadas en nitrógeno líquido. Comience la purificación de sinaptosomas transfiriendo el tejido cerebral disecado a recipientes de homogenización que contienen un mililitro de tampón A frío con hielo. Luego homogenice el tejido a 900 RPM utilizando aproximadamente 12 pasadas. Centrifugue las muestras a 1.000 × g durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, conserve los sobrenadantes. Rehomogenice el sedimento como antes y combine los sobrenadantes. Gire los sobrenadantes combinados durante 20 minutos a 12.000 × g. Resuspenda los sedimentos en un mililitro de tampón de homogenización y homogenice con seis embestidas a 900 rpm, seguido de centrifugación a 1.200 × g durante 20 minutos.

Durante la centrifugación para obtener los pellet P2, prepare gradientes escalonados de sacarosa en tubos para ultracentrífuga. Comience con 2.5 mililitros de tampón de sacarosa 1.0 M y luego use una pipeta Pasteur de vidrio para subyacer 1.5 mililitros de tampón de sacarosa 1.2 M. Después de la centrifugación, agregue 0.5 mililitros de tampón de sacarosa 0.32 M a los pellet P2.

Luego, vuelva a homogeneizar utilizando seis movimientos. Cargue las fracciones homogeneizadas sobre la parte superior de los gradientes. Coloque los gradientes cargados en un rotor de cubeta oscilante y luego centrifugue a 85.000 ×g durante dos horas en una ultracentrífuga.

Una vez finalizada la centrifugación, deseche la capa superior de sacarosa 0,32 molar, incluyendo el material en la interfase con el tampón de sacarosa 1,0 molar. Recopile los sinaptosomas en la interfase entre el tampón de sacarosa 1,0 y 1,2 molar. Añada tampón de sacarosa 0,32 molar a la fracción sinaptosómica en una proporción de 1,1.

Mezcle cuidadosamente y centrifugue a 150.000 ×g durante una hora. Los sinaptosomas se encuentran en el sedimento y pueden resuspenderse en un tampón para su posterior procesamiento. Disuelva los sinaptosomas de cada área cerebral de un animal en 20 a 50 microlitros de urea 8 M incubando en hielo durante una hora en un baño ultrasónico.

Diluya con un uno por ciento de un detergente removible para asegurar una concentración final de dos molar de urea. Después de determinar las cantidades relativas de proteína mediante SDS-PAGE, pipetee un tercio del resto de cada muestra en un tubo nuevo. Realice la digestión en solución añadiendo DTT a dos milimolar y bicarbonato de amonio a 25 milimolar, y vortexee suavemente la muestra.

Reducir las muestras durante 45 minutos a 20 grados Celsius. Añadir iodoacetamida 10 milimolar para carbamidometilar los residuos de cisteína y mezclar. Incubar durante 30 minutos a oscuras a 20 grados Celsius.

Finalmente, agregue un microlitro de una solución stock de tripsina e incube a 20 grados Celsius durante 12 horas. Para eliminar el detergente escindible por ácido, agregue ácido trifluoroacético hasta una concentración final del uno por ciento e incube durante una hora adicional a 20 grados Celsius. Después de centrifugar las muestras a 16.000 × g durante 10 minutos, recoja cuidadosamente los sobrenadantes.

Coloque la columna de extracción en fase sólida en un soporte y equilibre la matriz con dos mililitros de metanol. Después del lavado, añada dos mililitros adicionales de tampón B y cargue la muestra. Tras lavar tres veces con tampón B, eluya los péptidos añadiendo 200 microlitros de acetonitrilo al 70 por ciento y ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento.

Luego, seque las muestras purificadas en un centrífugo de vacío. En este ejemplo, los animales entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM muestran una tasa creciente de aciertos y una tasa decreciente de falsas alarmas a lo largo de las sesiones de entrenamiento. La discriminación significativa ocurre a partir de la cuarta sesión.

Se comparan las abundancias sinápticas relativas de proteínas seleccionadas entre ratones entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM y ratones controles ingenuos 24 horas después de la primera sesión de entrenamiento. Después del entrenamiento, los niveles de la proteína CYFP2 se alteran en todas las regiones estudiadas. No olvide que los animales a menudo presentan variabilidades intra-individuales.

Por lo tanto, se recomienda encarecidamente incluir al menos cinco o más réplicas biológicas de grupos animales bien emparejados en el estudio. Una vez establecida, esta técnica puede adaptarse fácilmente a otras especies. Por ejemplo, se ha utilizado para monitorear cambios en la expresión de proteínas dependientes del aprendizaje en cerebros individuales de moscas de la fruta.