Name: Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas sinápticas mediante análisis proteómico de alta resolución en ratones entrenados en discriminación auditiva. Este método permite correlacionar cambios moleculares con comportamientos específicos de memoria.

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Deseamos agradecer a Yvonne Ducho y Kathrin Pohlmann por su excelente asistencia técnica. Este trabajo ha contado con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) y del Fondo Estatal de Sajonia-Anhalt / Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a través del Centro de Ciencias del Cerebro del Comportamiento (CBBS).

<ol><li>Lamprecht, R., LeDoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (1), 45-54 (2004).</li>
<li>Bingol, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+by+the+ubiquitin+proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).</li>
<li>Richter, J. D., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+synaptic+plasticity+and+memory+last%3A+mechanisms+of+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation.</a> Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Rosenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+protein+expression+in+synaptic+plasticity+and+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation.</a> Front Mol Neurosci. 7, 86(2014).</li>
<li>Scheich, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+semantics+of+learning+and+crossmodal+processing+in+auditory+cortex%3A+the+semantic+processor+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept.</a> Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteome+changes+in+mouse+brain+regions+upon+auditory+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).</li>
<li>Reichenbach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+dopamine+signalling+on+long-term+memory+formation+and+consolidation+in+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain.</a> Proteome Sci. 13, 13(2015).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+rearrangements+after+auditory+learning%3A+high-resolution+profiling+of+synapse-enriched+protein+fractions+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics+of+rat+synaptic+proteins%3A+correlation-profiling+by+isotope-coded+affinity+tagging+in+conjunction+with+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+to+reveal+post-synaptic+density+specific+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins.</a> J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).</li>
<li>Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+KH+%22The+Cytoskeleton+-+Imaging%2C+Isolation%2C+and+Interaction%22">The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction</a>. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).</li>
<li>Smalla, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+glycoprotein+neuroplastin+is+involved+in+long-term+potentiation+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO%282%29-based+phosphoproteomic+analysis+of+the+plasma+membrane+and+the+effects+of+phosphatase+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment.</a> J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).</li>
<li>Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENECODIS%3A+a+web-based+tool+for+finding+significant+concurrent+annotations+in+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists.</a> Genome Biol. 8 (1), 3(2007).</li>
<li>Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+alpha-+and+gamma-protocadherins+alters+their+presenilin-dependent+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estudio presenta un flujo de trabajo optimizado metodológica para un perfilado cuantitativa precisa de los cambios de expresión de proteínas sinápticas durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en diferentes zonas del cerebro de los ratones. La configuración proporciona la oportunidad de estudiar la expresión de la proteína en el nivel de un solo animal a pesar de la aplicación requerida de al menos tres repeticiones técnica por muestra para el análisis de espectrometría de masas. La metodología tiene en cuenta la composición de la proteína particular de la pre- y postsynapse que consiste en proteínas de peso molecular elevado de andamio, sino también de las proteínas mediador importante teniendo pesos moleculares medio o inferior. Los digeridos en solución de sinaptosomas preparados dan como resultado una generación eficiente y, por lo tanto, un exceso de representación de los péptidos derivados de andamios. Esto, a su vez, puede suprimir el análisis de proteínas abundantes más pequeños o más bajas. La preparación de las fracciones sugerido SDS-PAGE de unaalícuota de cada muestra se combina con un procedimiento de digestión en gel en paralelo facilita el análisis de las proteínas de abundancia media y baja y representa un método complementario muy recomendable. Después de la aplicación de espectrometría de masas independiente de todas las fracciones derivadas de una muestra (por ejemplo, en solución de digerir, en gel de digerir, fracciones fosfo-enriquecido combinados) los conjuntos de datos de MS / MS correspondientes se pueden combinar y calculados para la identificación de proteínas y cuantificación de picos más software o paquetes de software populares alternativos. Alternativamente, la aplicación individual de las fracciones en-gel-digestión derivados de una muestra (de gel zonas procesadas por separado de un carril de la muestra) y fracciones generado de la muestra digerida en solución (por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico) a espectrometría de masas puede aumentar la profundidad analítica. Sin embargo, este flujo de trabajo prolongado aumenta dramáticamente el tiempo requerido para LS-MS de adquisición de datos / MS. para generatioSe requiere n de una secuencia molecular detallada de los reordenamientos de proteínas sinápticas durante el aprendizaje y la formación de la memoria de un curso de tiempo especificado de la perfiles proteómicos. Este curso de tiempo puede empezar inmediatamente después o incluso durante la primera sesión de entrenamiento y cubre un periodo de tiempo de malla fina hasta que el rendimiento de los animales alcanzó el nivel asintótico de la curva de aprendizaje después de aprox. 8 - 10 días de entrenamiento (véase la Figura 2 para más detalles). El análisis de los cambios de fosforilación de las proteínas sinápticas requiere un enfoque particular en los marcos de tiempo seleccionados durante el aprendizaje FMTD. En las cascadas de señalización por un lado, que inician reordenamientos de proteínas sinápticas conocidos por estar desencadenada por fosforilaciones de proteínas y desfosforilaciones se espera en etapas muy tempranas de la formación animal. Por otro lado, hay largos modificaciones duraderas de múltiples proteínas sinápticas fosforilados conocidas que regulan la conectividad y el montaje dentro de los sarquitectura ynaptic 19, 20. Se espera que estas modificaciones posteriores a la traducción, incluso en momentos posteriores de consolidación de la memoria. Los conjuntos de datos complejos generados por este flujo de trabajo proteómico requieren un procesamiento bioinformático para identificar las vías moleculares y moléculas clave que participan. El meta-análisis muestra vías excesivamente importantes, que desempeñan un papel en los procesos de aprendizaje y memoria.

El aprendizaje se basa en la formación de huellas de la memoria y su mantenimiento. Es ampliamente aceptado que un mecanismo subyacente puede representar una formación dependiente de la actividad de nuevos y / o reordenamiento de los contactos sinápticos existentes entre las neuronas. A nivel molecular, diversas modificaciones de las proteínas, relocalizaciones subcelulares y los cambios en el volumen de negocios de proteínas sinápticas se han descrito 1-4 (Lamprecht, 2004 Nº 8). Sin embargo, la mayoría de los estudios hasta ahora se centraron en proteínas seleccionadas en lugar de en la composición proteoma sináptica global, pero compleja. El presente enfoque permite un examen imparcial de cambios proteoma sinápticas en las regiones del cerebro del ratón después de un experimento de aprendizaje. Es adecuado para hacer instantáneas moleculares dependientes punto de tiempo de la reorganización inducida por aprendizaje de la arquitectura sináptica. El flujo de trabajo descrito requiere un trabajo en equipo particular de diferentes especialistas en el comportamiento animal, la bioquímica de proteínas, espectrometría de masas y bioinformatics. El paradigma de aprendizaje elegido, es decir, la discriminación tono de frecuencia modulada (FMTD), es una tarea de discriminación auditiva bien caracterizado en roedores 5. El aprendizaje y la formación de la memoria a largo plazo en esta caja de transporte Go / No-Go-tarea implica mecanismos en función de una mayor señalización de la dopamina cortical y la síntesis de proteínas. En consecuencia, los últimos estudios proteómicos en jerbos y ratones revelaron dopamina y reordenamientos de plástico inducida de aprendizaje de los componentes sinápticas en cortical, sino también en regiones del cerebro más basales que supuestamente interactúan durante el aprendizaje y la memoria FMTD 6-8. Esto ilustra que la formación de memoria implica una compleja interacción de diversas regiones del cerebro y por lo tanto, podría ser regulada diferencialmente dentro de estas regiones en el nivel proteoma. Por lo tanto, la disección de las regiones del cerebro del ratón corticales y subcorticales seleccionados se incluye en el flujo de trabajo. Además, la characterizati fiableincluso en los cambios débiles en la composición de la proteína sináptica requiere un enriquecimiento de los compartimentos pre y post-sinápticas más que el análisis de los homogeneizados o fracciones de membrana cruda 9. Protocolos Por lo tanto, la preparación de sinaptosomas Utilizando establecido antes del análisis proteómico se describe con el fin de aumentar el nivel de detección y el rango dinámico de las proteínas-sinapsis específica 10,11. Un requisito fundamental para el uso libre de etiquetas espectrometría de masas de alta resolución para fines cuantitativos es un alto grado de similitud de las muestras de proteínas. Como se espera que los cambios en lugar de menor importancia en la composición de la proteína sináptica que se produzca después de saber, un enfoque libre de etiquetas será apropiado comparar muestras de proteínas obtenidas de ratones no tratados previamente formados y que corresponde. Por otra parte, las estrategias de etiquetas condición específica de proteínas / péptidos usando isótopos estables (por ejemplo, TMT, iTRAQ, ICPL y SILAC), así como etiquetas basado en MS2 qua librentification (SWATH) son útiles, pero son más caros que el enfoque libre de etiquetas elegido o necesita hardware especial de espectrometría de masas. Desde proyecciones proteómicos rinden a menudo complejos conjuntos de datos, se recomienda el procesamiento bioinformáticas para la interpretación de datos adecuado. Además, los meta-análisis pueden apoyar una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a los posibles cambios relacionados con paradigmas y la identificación de los principales procesos celulares involucrados y vías de señalización. Las metodologías adecuadas también se describen a continuación.

<table><tbody><tr><td>3 M Empore Extracción en fase sólida- Filtro</td><td>3M Bioanalytical Technologies</td><td>4245SD</td><td>7 mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &micro; m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim, PepMap 100</td>, <td>Dionex/Thermo Scientific,</td><td>164569</td><td>75 y micro; m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida (30%)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de amonio&nbsp; &nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio&nbsp;</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio&nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biofuge pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Blue R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>ratones C57BL/6J</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga para MLS-50</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga para rotor TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5417R</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Eppendorf A-8-11</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT Fosfatasa Cóctel de inhibidores&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución tampón&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de homogeneización 2 ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de la vía Ingenuity</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de perforación de laboratorio &nbsp; K-ControlTLC 4957&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kaltenbach & Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix rotor de tubo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Escalera de proteínas preteñida</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Soluciones bioinformáticas&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de fosfatasa Cocktail 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Émbolo de PTFE</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador PotterS</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa mini</td><td>Roche</td> completo <td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>cantidad Uno 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>Caja de lanzadera</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecililsulfato de sodio (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodio tartrato dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 Baño ultrasónico</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Cámara insonorizada</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametil etileno -1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="¡RANGO! A60">Titansphere TiO 5&micro; m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japón</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>Rotor TLA 100.1</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético&nbsp; (AFC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano (TRIS)</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina Oro</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC&nbsp;</td><td>Tubo ultracentrífugo Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Unijet II Aspirador refrigerado Uniequip</td><td>Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H Centrífuga concentradora&nbsp;</td><td>Obrero de Uniequip&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Agua (purificada de alta calidad)</td><td></td><td></td><td>Resistividad: > 18.2 M&Omega;*cm a 25 &deg; C&nbsp; Pirógenos: < 0.02 UE/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TOC: < 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 Puntas de pipeta</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

alta resolución cuantitativa synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón regiones después de discriminación auditiva de aprendizaje

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Los mecanismos sinápticos moleculares que subyacen al aprendizaje auditivo y la memoria siguen siendo en gran medida desconocidos. Aquí, se describe el flujo de trabajo de un estudio proteómico sobre el aprendizaje de la discriminación auditiva en ratones. En este paradigma de aprendizaje, los ratones son entrenados en una caja de lanzadera para discriminar entre tonos de frecuencia modulada ascendentes y descendentes con el fin de evitar una leve descarga eléctrica en el pie. El protocolo implica el enriquecimiento de sinaptosomas de cuatro áreas cerebrales, a saber, la corteza auditiva, la corteza frontal, el hipocampo y el cuerpo estriado, en diferentes etapas del entrenamiento. Los patrones sinápticos de expresión de proteínas obtenidos de ratones entrenados se comparan con los controles naïve utilizando un enfoque proteómico. Para lograr una profundidad analítica suficiente, las muestras se fraccionan de tres maneras diferentes antes de la espectrometría de masas, a saber, digestión 1D SDS-PAGE/en gel, digestión en solución y enriquecimiento de fosfopéptidos. 
El análisis proteómico de alta resolución en un espectrómetro de masas y la cuantificación sin marcadores se utilizan para examinar los perfiles de proteínas sinápticas en fracciones empobrecidas y enriquecidas con fosfopéptidos de muestras de proteínas sinaptosómicas. Se utiliza un paquete de software comercial para revelar proteínas y fosfopéptidos con niveles de abundancia sináptica relativa significativamente regulados (controles entrenados/ingenuos). Se observaron modos de regulación comunes y diferenciales para el proteoma sináptico en las regiones cerebrales investigadas de ratones después del entrenamiento. Posteriormente, se emplean metaanálisis que utilizan varias bases de datos para identificar las funciones celulares subyacentes y las vías biológicas.

La Figura 1 resume el flujo de trabajo completo de perfiles proteoma cuantitativa sináptica de las regiones del cerebro del ratón después de conocer la discriminación auditiva. Se inicia con la formación de los animales en una caja de transporte. En el ejemplo mostrado en la Figura 2, los ratones comenzaron a mostrar significativa discriminación tono de FM en la sesión de entrenamiento 4 TH, lo que indica aprendizaje eficiente. Los animales se sacrifican en puntos de tiempo seleccionados para la disección área del cerebro. El enriquecimiento requerido de sinapsis o bien se puede logra mediante la preparación de sinaptosomas o, alternativamente, por la preparación de una fracción enriquecida PSD, ambos descritos en detalle en la figura 3. El método de enriquecimiento de PSD se ha desarrollado para cantidades de tejido bajas, por ejemplo 1 - 2 rebanadas de hipocampo de cerebro de rata 12, 18. Requiere pequeños tubos, manos de mortero de PTFE montaje de estos tubos, y una unidad de perforación de laboratorio para la alimentación de la mano del mortero. Debido a la composición de la proteína particular de sinaptosomas, se recomienda encarecidamente para realizar la preparación de la muestra de dos maneras diferentes pero complementarios. Los andamios de los PSD son a menudo proteínas de muy alto peso molecular que se producen en alta estequiometría. Dentro de la solución de digestión es la mejor manera de extraer de manera eficiente, pero puede conducir a un sobremuestreo de la mezcla de péptidos generados. El gel-en digerir realiza de la misma muestra en paralelo puede excluir aquellas proteínas de alto peso molecular y favorecer el análisis de proteínas con medio y bajo peso molecular. Para un análisis exhaustivo se recomiendan dos tipos de digestiones proteolíticas. Las diferentes cantidades de tejidos de las áreas del cerebro investigados requieren un ajuste del material aplicado para una mejor comparación. Dentro de las cuatro áreas del cerebro investigado la corteza auditiva es generalmente el hecho de limitaro. El material de todas las demás áreas del cerebro cuidadosamente debe ajustarse a la cantidad de la corteza auditiva después de la preparación de sinaptosomas o fracciones enriquecidas-PSD (véase 3.1.1.). Los pesos típicos de las áreas del cerebro de ratones recién preparados son los siguientes: corteza auditiva (CA): ~ 50 mg; hipocampo (HIP): ~ 90 mg; estriado (STR): ~ 120 mg y la corteza frontal (FC): ~ 100 mg. El método de enriquecimiento de PSD se describe en la sección 2.3 permitió la identificación de aproximadamente 1500 diferentes proteínas y aproximadamente 250 diferentes fosfo-péptidos por región del cerebro en el nivel de un solo animal (Tabla 1). El análisis proteómico 24 h después de la primera sesión de entrenamiento reveló que el 7,3% de las proteínas identificadas y el 5,8% de los fosfo-péptidos mostraron significativa (p &lt;0,05) los cambios cuantitativos en su expresión sináptica en comparación con los controles no tratados previamente (Tabla 1). Una tendencia notable por abajo Regulación de andamios sinápticas puede apuntar a un reordenamiento pronunciada de la arquitectura sináptica durante las primeras etapas del aprendizaje FMTD. La gran mayoría de las proteínas reguladas se alteró de manera específica para la región del cerebro, mientras que se encontraron sólo el 22% ser regulada en dos o más áreas del cerebro. Seis ejemplos seleccionados se muestran en la Figura 4. El metanálisis de los complejos resultados por IPA proporciona evidencia de lo particular la participación / manipulación de las siguientes vías canónicas: &quot;La endocitosis de señalización mediada por clatrina&quot;, &quot;la señalización de calcio&quot; &quot;axonal orientación Señalización&quot;, &quot;RhoA señalización&quot;, &quot;la señalización de Notch &quot;,&quot; Remodelación de las uniones adherentes epitelial &quot;,&quot; El glutamato receptor de señalización &quot;,&quot; GABA receptor de señalización &quot;,&quot; La dopamina receptor de señalización &quot;y&quot; Synaptic potenciación a largo plazo &quot;. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Análisis individual de enriquecimiento reveló procesos biológicos excesivamente significativas en la corteza frontal en relación con el transporte de proteínas, la adhesión celular, la fosforilación, la endocitosis, el transporte de vesículas mediada, el desarrollo del cerebro anterior y axonogenesis (Figura 5). En los procesos biológicos corteza auditiva, incluyendo el transporte de iones, la traducción, el transporte del ARNm, el transporte de proteínas y el aprendizaje fueron notables. El análisis de la fracción de proteína del hipocampo detecta significativamente los procesos enriquecidos relacionados con el transporte de iones, el ciclo celular, la traducción, la fosforilación y desarrollo del sistema nervioso. En el cuerpo estriado, sobrerrepresentados se encontraron procesos biológicos, incluyendo el transporte del ARNm, el transporte de vesículas mediada, axonogenesis, proteolisis, el transporte de proteínas y la endocitosis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> Figura 1: Sistemática Workflow del enfoque metodológico. Esta figura resume esquemáticamente el flujo de trabajo de alta resolución de perfiles cuantitativa de la composición de la proteína sináptica específica área del cerebro. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplo del comportamiento de la rata en el tono de FM Discriminación de tareas. Animales muestran una tasa creciente de accesos (curva azul) y una tasa de disminución de falsas alarmas (curva negro) en el curso de las sesiones de entrenamiento. la discriminación significativa se produce a partir de la cuarta sesión. Las barras de error se proporcionan como SEM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una lar</a>ger versión de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> Figura 3: Preparación de la sinaptosomas y la fracción enriquecida en PSD. A: preparación de sinaptosomas. B: Preparación de la fracción enriquecida PSD. Ambas figuras explican el flujo de trabajo detallado de preparación de sinaptosomas o fracciones enriquecidas alternativamente-PSD de los tejidos del cerebro. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> Figura 4: Selección cuantitativa proteómicos resultados. Las abundancias relativas de sinápticas proteínas seleccionadas se comparan entre ratones trained en la tarea FMTD (AV, n = 6) y los ratones de control no tratados previamente (NV, n = 6) 24 horas después de la primera sesión de entrenamiento. Los valores de abundancia se calcularon como la mediana de las áreas de los picos de los tres péptidos más intensos de una proteína. Las proteínas con cambios significativos de abundancia (AV / NV; t-test) se marcan dentro de las parcelas: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,005. Las barras de error se proporcionan como SD. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> Figura 5: La visualización de las vías biológicas para la corteza frontal por GENECODIS / Gephi. Solamente los términos significativos de la base de datos de ontología de genes (GO) (http://geneontology.org) relacionados con &quot;proceso biológico&quot; con un número mínimo de proteínas de tres<html> se muestran aquí. Los nodos representan los términos de GO, el tamaño del nodo, el ancho de línea y el número de conexiones de un cierto nodo representan el número de proteínas, que comparten este término GO con otros nodos. Debido al método de &quot;Fuerza Atlas&quot; de Gephi, los nodos relacionados está aglomerando estrechamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> región del cerebro </td><td> C.A. </td><td> FC </td><td> CADERA </td><td><html> 000 &quot;face =&quot; &quot;size =&quot; Calibri 3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> proteínas identificadas </td><td> 1435 </td><td> 1758 </td><td> 1572 </td><td> 1507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> proteínas reguladas (p &lt;0,05) </td><td> 59 </td><td> 130 </td><td> 162 </td><td> 108 </td><td>face = &quot;Calibri&quot; size = &quot;3&quot;&gt; 459 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 76 </td><td> 35 </td><td> 123 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 51 </td><td> 126 </td><td> 86 </td><td> 73 </td><td> 336 </td></tr><tr><td> phosphomoti identificado<html> fs </td><td> 197 </td><td> 361 </td><td> 273 </td><td> 278 </td><td> 1109 </td></tr><tr><td> phosphomotifs regulados (p &lt;0,05) </td><td> 8 </td><td> 22 </td><td> 21 </td><td> 14 </td><td> sesenta y cinco </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;face =&quot; &quot;size =&quot; Calibri 3 &quot;&gt; 17 </td><td> 5 </td><td> 9 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> dieciséis </td><td> 5 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Resumen del resultado de Proteómica. Esta tabla resume un experimento proteómico representante de ratones entrenados (AV, n = 6) 24 horas después de la primera sesión de entrenamiento en comparación con sus controles no tratados previamente (NV, n = 6). lossuma de 459 proteínas reguladas incluye regulaciones superpuestas. 283 regulaciones diferentes se determinaron como específicas del cerebro. En detalle, las 57 proteínas están reguladas en dos regiones del cerebro, se detectaron 18 reglamentos de proteínas en tres regiones del cerebro y sólo 2 proteínas están reguladas en las cuatro áreas del cerebro investigadas. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tolerancias de error </td></tr><tr><td> masa precursora (Fourier masa espectrometría de transformación) </td><td> 10 ppm </td></tr><tr><td> de masas de iones fragmento (trampa de iones lineal) </td><td> 0.6 Da </td></tr><tr><td> Divisiones máximas perdidas por péptido </td><td> 3 </td></tr><tr><td> modificaciones fijos </td></tr><tr><td> en-gel digerido muestras </td><td> Carbamidomethylation de cisteína </td></tr><tr><td> para las muestras en solución digerido </td><td> Methylthiolation de la cisteína </td></tr><tr><td> variable modificaciones </td><td> La oxidación de la metionina </td></tr><tr><td></td><td> Desamidaciones de asparagina y / o glutamina </td></tr><tr><td> Base de datos </td><td> Uniprot / Sprot </td></tr><tr><td> taxonomía </td><td> ratón </td></tr><tr><td> Ajustes estadísticos de identificación de aceptación </td></tr><tr><td> de novo promedio de la confianza local (ALC) </td><td> &gt; 50% </td></tr><tr><td> Péptido-falsa tasa de descubrimiento (FDR, basado en est. Decoy-fusión) </td><td> &lt;1% </td></tr><tr><td> Proteína significación (-10logP, basado en T-test modificado) </td><td> &gt; 20 </td></tr><tr><td> péptidos únicos / proteínas </td><td> ≥ 1 </td></tr><tr><td> Ajustes de cuantificación: </td></tr><tr><td> Los péptidos utilizados para la cuantificación si: </td></tr><tr><td> Péptido significación (-10logP) </td><td> &gt; 30 </td></tr><tr><td> la identificación de péptidos en </td><td> ≥ 50% de las muestras </td></tr><tr><td> calidad de la señal de péptidos </td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td> superficie media de péptidos </td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td> Péptido tolerancia tiempo de retención </td><td> &lt;5 min </td></tr><tr><td> Normalización </td><td> por la corriente de iones total (TIC) </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Ajustes para la identificación de proteínas (paso 4.2.2).

La identificación de moléculas y vías que controlan la plasticidad sináptica y la memoria sigue siendo un desafío importante en la neurociencia. Aquí, se describe un flujo de trabajo que aborda la cuantificación relativa de las proteínas sinápticas supuestamente involucradas en la reorganización molecular de las sinapsis durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en un paradigma de aprendizaje auditivo.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

El objetivo general de este enfoque proteómico es la caracterización de la reorganización molecular en las sinapsis tras la formación del aprendizaje y la memoria, con el fin de comprender los mecanismos básicos y las vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica es su enfoque libre de hipótesis, que permite la cuantificación y caracterización a gran escala de modificaciones postraduccionales dentro de los proteomas sinápticos. Nuestro protocolo establecido permite establecer una correlación entre un cambio molecular específico y un comportamiento particular.El aprendizaje y la formación de la memoria se basan en cambios de la eficacia sináptica, por lo que los estudios proteómicos deberían centrarse más en el análisis de estructuras sinápticas como los sinaptosomas que en homogenatos de tejido cerebral. Los resultados proteómicos representan conjuntos de datos altamente complejos que por tanto requieren procesamiento bioinformático. Comience el entrenamiento colocando el ratón de prueba en una caja de tránsito con luz tenue dentro de una cámara insonorizada.Utilice un programa de aprendizaje completamente controlado por computadora para el aprendizaje de la discriminación auditiva. Comience con un período de habituación de tres minutos de silencio antes de iniciar la sesión de entrenamiento. Durante los ensayos de tipo "go", el animal debe cruzar el obstáculo dentro de los seis segundos posteriores a la presentación del tono para obtener un acierto.Durante los ensayos de no-ir, el animal debe permanecer en el compartimento actual de la caja de traslado durante los seis segundos de presentación del tono. Realice 30 ensayos de ir y 30 ensayos de no-ir en un orden pseudoaleatorio, con un intervalo entre ensayos de 20 segundos, de modo que una sesión conste de 60 ensayos y dure aproximadamente 25 minutos. Una vez realizados todos los ensayos, devuelva el ratón entrenado a su jaula de alojamiento hasta el sacrificio.Tras sacrificar el ratón y extraer el cerebro, localice la corteza auditiva utilizando referencias visuales como los vasos sanguíneos y la forma de la superficie. Luego, utilice un escalpelo y una aguja para diseccionar bilateralmente la corteza auditiva como un bloque de tejido rectangular. Utilizando el quiasma ópticum como referencia, seccione la corteza frontal como una laminilla cerebral entre Bregma 3,56 y 1,54.Disecar el estriado como una rebanada cerebral entre el bregma 1,54 y 0,5. Y eliminar cuidadosamente el tejido cortical. Disecar el hipocampo estabilizando el cerebro con la aguja a través del cerebelo y desenrollando la corteza comenzando por el lóbulo occipital.Congele rápidamente las muestras de cerebro disecadas en nitrógeno líquido. Comience la purificación de sinaptosomas transfiriendo el tejido cerebral disecado a recipientes de homogenización que contienen un mililitro de tampón A frío con hielo. Luego homogenice el tejido a 900 RPM utilizando aproximadamente 12 pasadas. Centrifugue las muestras a 1.000 × g durante 10 minutos.Después de la centrifugación, conserve los sobrenadantes. Rehomogenice el sedimento como antes y combine los sobrenadantes. Gire los sobrenadantes combinados durante 20 minutos a 12.000 × g. Resuspenda los sedimentos en un mililitro de tampón de homogenización y homogenice con seis embestidas a 900 rpm, seguido de centrifugación a 1.200 × g durante 20 minutos.Durante la centrifugación para obtener los pellet P2, prepare gradientes escalonados de sacarosa en tubos para ultracentrífuga. Comience con 2.5 mililitros de tampón de sacarosa 1.0 M y luego use una pipeta Pasteur de vidrio para subyacer 1.5 mililitros de tampón de sacarosa 1.2 M. Después de la centrifugación, agregue 0.5 mililitros de tampón de sacarosa 0.32 M a los pellet P2.Luego, vuelva a homogeneizar utilizando seis movimientos. Cargue las fracciones homogeneizadas sobre la parte superior de los gradientes. Coloque los gradientes cargados en un rotor de cubeta oscilante y luego centrifugue a 85.000 ×g durante dos horas en una ultracentrífuga.Una vez finalizada la centrifugación, deseche la capa superior de sacarosa 0,32 molar, incluyendo el material en la interfase con el tampón de sacarosa 1,0 molar. Recopile los sinaptosomas en la interfase entre el tampón de sacarosa 1,0 y 1,2 molar. Añada tampón de sacarosa 0,32 molar a la fracción sinaptosómica en una proporción de 1,1.Mezcle cuidadosamente y centrifugue a 150.000 ×g durante una hora. Los sinaptosomas se encuentran en el sedimento y pueden resuspenderse en un tampón para su posterior procesamiento. Disuelva los sinaptosomas de cada área cerebral de un animal en 20 a 50 microlitros de urea 8 M incubando en hielo durante una hora en un baño ultrasónico.Diluya con un uno por ciento de un detergente removible para asegurar una concentración final de dos molar de urea. Después de determinar las cantidades relativas de proteína mediante SDS-PAGE, pipetee un tercio del resto de cada muestra en un tubo nuevo. Realice la digestión en solución añadiendo DTT a dos milimolar y bicarbonato de amonio a 25 milimolar, y vortexee suavemente la muestra.Reducir las muestras durante 45 minutos a 20 grados Celsius. Añadir iodoacetamida 10 milimolar para carbamidometilar los residuos de cisteína y mezclar. Incubar durante 30 minutos a oscuras a 20 grados Celsius.Finalmente, agregue un microlitro de una solución stock de tripsina e incube a 20 grados Celsius durante 12 horas. Para eliminar el detergente escindible por ácido, agregue ácido trifluoroacético hasta una concentración final del uno por ciento e incube durante una hora adicional a 20 grados Celsius. Después de centrifugar las muestras a 16.000 × g durante 10 minutos, recoja cuidadosamente los sobrenadantes.Coloque la columna de extracción en fase sólida en un soporte y equilibre la matriz con dos mililitros de metanol. Después del lavado, añada dos mililitros adicionales de tampón B y cargue la muestra. Tras lavar tres veces con tampón B, eluya los péptidos añadiendo 200 microlitros de acetonitrilo al 70 por ciento y ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento.Luego, seque las muestras purificadas en un centrífugo de vacío. En este ejemplo, los animales entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM muestran una tasa creciente de aciertos y una tasa decreciente de falsas alarmas a lo largo de las sesiones de entrenamiento. La discriminación significativa ocurre a partir de la cuarta sesión.Se comparan las abundancias sinápticas relativas de proteínas seleccionadas entre ratones entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM y ratones controles ingenuos 24 horas después de la primera sesión de entrenamiento. Después del entrenamiento, los niveles de la proteína CYFP2 se alteran en todas las regiones estudiadas. No olvide que los animales a menudo presentan variabilidades intra-individuales.Por lo tanto, se recomienda encarecidamente incluir al menos cinco o más réplicas biológicas de grupos animales bien emparejados en el estudio. Una vez establecida, esta técnica puede adaptarse fácilmente a otras especies. Por ejemplo, se ha utilizado para monitorear cambios en la expresión de proteínas dependientes del aprendizaje en cerebros individuales de moscas de la fruta.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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