Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

El objetivo general de este enfoque proteómico es la caracterización de la reorganización molecular en las sinapsis después del aprendizaje y la formación de la memoria para comprender los mecanismos básicos y las vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica es un enfoque libre de hipótesis, que permite la cuantificación y caracterización a gran escala de la postraducción y las modificaciones dentro de los proteomas sinápticos. Nuestro flujo de trabajo establecido permite una correlación entre un cierto cambio molecular y un comportamiento particular.

El aprendizaje y la formación de la memoria se basan en cambios en la eficacia sináptica y, por lo tanto, los estudios proteómicos deben centrarse más en el análisis de estructuras sinápticas como los sinaptosomas que en los homogeneizados del tejido cerebral. Los resultados proteómicos representan conjuntos de datos altamente complejos, por lo que requieren un procesamiento bioinformativo. Comience el entrenamiento colocando el mouse de prueba en una caja de lanzadera con poca luz dentro de una cámara insonorizada.

Utilice un horario de aprendizaje totalmente controlado por computadora para el aprendizaje de la discriminación auditiva. Comience con un período de habituación de tres minutos de silencio antes de comenzar la sesión de entrenamiento. Durante las pruebas de go, el animal tiene que cruzar el obstáculo dentro de los seis segundos posteriores a la presentación del tono para anotar un golpe.

Durante las pruebas sin salida, el animal debe permanecer en el compartimento actual de la caja de lanzadera durante los seis segundos de presentación del tono. Realice 30 ensayos directos y 30 ensayos no directos en un orden pseudoaleatorio, con un intervalo entre ensayos de 20 segundos para que una sesión conste de 60 ensayos y dure unos 25 minutos. Una vez que se hayan realizado todas las pruebas, regrese el ratón entrenado a la jaula doméstica hasta el sacrificio.

Después de sacrificar el ratón y extirpar el cerebro, localice la corteza auditiva utilizando puntos de referencia visuales, incluidos los vasos sanguíneos y la forma de la superficie. A continuación, utilice un bisturí y una aguja para diseccionar bilateralmente la corteza auditiva como un bloque de tejido rectangular. Usando el quiasma óptico como punto de referencia, diseccione la corteza frontal como un corte de cerebro entre Bregma 3.56 y 1.54.

Disecciona el cuerpo estriado como un corte de cerebro entre Bregma 1.54 y 0.5. Y retire con cuidado el tejido cortical. Disecciona el hipocampo estabilizando el cerebro con la aguja a través del cerebelo y desenrollando la corteza comenzando en el lóbulo occipital.

Muestras de cerebro diseccionadas por congelación en nitrógeno líquido. Comience la purificación de sinaptosomas transfiriendo el tejido cerebral diseccionado a recipientes de homogeneización que contengan un mililitro de tampón A helado. Luego homogeneice el tejido a 900 RPM usando alrededor de 12 golpes. Centrifugar las muestras a 1.000 veces G durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, retenga los sobrenadantes. Vuelva a homogeneizar el pellet como antes y combine los sobrenadantes. Centrifugar los sobrenadantes combinados durante 20 minutos a 12.000 veces G.Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón de homogeneización y homogeneice con seis golpes a 900 RPM seguidos de una centrifugación a 1.200 veces G durante 20 minutos.

Durante la centrifugación para producir los gránulos P2, prepare gradientes escalonados de sacarosa en tubos de ultracentrífuga. Comience con 2,5 mililitros de tampón de sacarosa 1,0 molar y luego use una pipeta Pasteur de vidrio para subcubrir 1,5 mililitros de tampón de sacarosa 1,2 molar. Después de la centrifugación, agregue 0,5 mililitros de tampón de sacarosa 0,32 molar a los gránulos P2.

A continuación, vuelva a homogeneizar con seis trazos. Cargue las fracciones homogeneizadas encima de los gradientes. Coloque los gradientes cargados en un rotor de cangilón oscilante y luego gire a 85.000 veces G durante dos horas en una ultracentrífuga.

Una vez completada la centrifugación, deseche la capa superior de sacarosa de 0,32 molares, incluido el material en la interfaz con el tampón de sacarosa de 1,0 molar. Recoja los sinaptosomas en la interfaz del tampón de sacarosa de uno a 1,2 molar. Añadir 0,32 molares de tampón de sacarosa a la fracción sinaptosómica en una proporción de 1,1.

Mezclar con cuidado y girar a 150.000 veces G durante una hora. Los sinaptosomas se encuentran en el gránulo y se pueden volver a suspender en un tampón para su posterior procesamiento. Disuelva los sinaptosomas de cada área del cerebro de un animal en 20 a 50 microlitros de urea de 8 molares incubando en hielo durante una hora en un baño ultrasónico.

Diluir con un uno por ciento de un detergente removible para asegurar una concentración final de urea de dos molares. Después de determinar las cantidades relativas de proteína con la pipetea SDS-PAGE, un tercio del resto de cada muestra en un tubo nuevo. Realice la digestión en solución agregando dos milimolares de DTT y 25 milimolares de bicarbonato de amonio y vórtice suavemente la muestra.

Reducir las muestras durante 45 minutos a 20 grados centígrados. Agregue 10 milimolares iota acedomida a los residuos de cisteína de carbamidometilato y mezcle. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a 20 grados centígrados.

Por último, añadir un microlitro de una solución madre de tripsina e incubar a 20 grados centígrados durante 12 horas. Para eliminar el detergente que se puede escindir ácido, agregue ácido trifluoroacético hasta una concentración final del uno por ciento e incube durante una hora más a 20 grados centígrados. Después de centrifugar las muestras a 16.000 veces G durante 10 minutos, recoja cuidadosamente los sobrenadantes.

Coloque la columna de extracción en fase sólida en un bastidor y equilibre la matriz con dos mililitros de metanol. Después del lavado, agregue dos mililitros adicionales de tampón B y cargue la muestra. Después de lavar tres veces con tampón B, eluir los péptidos añadiendo 200 microlitros de acetonitrilo al 70 por ciento y ácido trifluoroacético al 0,1 por ciento.

A continuación, seque las muestras purificadas en una centrífuga de vacío. En este ejemplo, los animales entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM muestran una tasa creciente de aciertos y una tasa decreciente de falsas alarmas en el transcurso de las sesiones de entrenamiento. A partir de la cuarta sesión se produce una discriminación significativa.

Se comparan las abundancias sinápticas relativas de las proteínas seleccionadas entre ratones entrenados en la tarea de discriminación de tonos FM y ratones de control ingenuos 24 horas después de la primera sesión de entrenamiento. Después del entrenamiento, los niveles de la proteína CYFP2 se alteran en todas las regiones estudiadas. No olvide que los animales a menudo exhiben variabilidades intraindividuales.

Por lo tanto, se recomienda encarecidamente incluir en el estudio al menos cinco o más réplicas biológicas de grupos de animales bien emparejados. Una vez establecida, esta técnica puede adaptarse fácilmente a otras especies. Por ejemplo, se ha utilizado para monitorear los cambios en la expresión de proteínas dependientes del aprendizaje en cerebros de moscas de la fruta.