Name: Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende inmunohistoquímica para visualizar la activación neuronal en el hipocampo de ratones tras el aprendizaje espacial. Este método permite identificar neuronas activadas en modelos de trastornos del neurodesarrollo.

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Queremos dar las gracias al personal administrativo del CIBIO (Universidad de Trento) y CNR Instituto de Neurociencias para obtener ayuda. Giovanni Provenzano es apoyado por una beca postdoctoral de la Fundación Veronesi (Milán, Italia). Este trabajo fue financiado por el Ministerio Italiano de Universidad e Investigación (PRIN 2008 subvención # 200894SYW2_002 y PRIN 2010-2011 subvención # 2010N8PBAA_002 a YB), Universidad de Trento (CIBIO subvención inicial a YB) y la Fundación Teletón (subvención # GGP13034 a YB).

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE y fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia. 1. Cuidado de Animales, Vivienda y Tratamiento <ol><li> Realizar todos los protocolos experimentales con ratones de acuerdo con las directrices de la respectiva cuidado de los animales institucional. </li><li> Mantener los animales en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con los alimentos y el agua ad libitum. </li><li> Casa de los ratones en grupos de 2-4, en jaulas de policarbonato ratón de tamaño estándar con aserrín y material de cama con cambio semanal. </li><li> Use la edad y el sexo, con ajuste ratones, porque la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el género en diferentes modelos de ratón de los trastornos del neurodesarrollo. </li><li> Elija un número adecuado de animales para alcanzar significación estadística (un mínimo de 10 ratones por genotipo para el estudio del comportamiento y 4 ratones por genotipo para el experimento inmunohistoquímica). </li></ol> 2. laberinto acuático de Morris (MWM) <ol><li> Use un tanque circular (diámetro 100 cm, altura 50 cm). <ol><li> Coloca algunas señales visuales en los separadores de ambiente de todo el tanque. </li><li> Coloque una plataforma de 10 cm de diámetro en el tanque en una ubicación fija en el centro de uno de los cuatro cuadrantes imaginarios. Mantenga la plataforma escondida en el mismo cuadrante para todos los ensayos en todas las sesiones de entrenamiento. </li><li> Llenar la piscina con agua del grifo hasta que la plataforma se encuentra a 1 cm por encima de la superficie del agua. Equilibrar la temperatura del agua debe estar cerca de 22 ° C; este paso puede tardar varias horas. Añadir agua caliente para acortar el tiempo necesario para equilibrar la temperatura del agua. </li><li> Añadir aproximadamente 1,5-2 L de blanco, la pintura no tóxica para hacer el agua opaca. </li></ol></li><li> Procedimiento Track Adquisición <ol><li> Configurar el sistema de seguimiento de MWM con cámaras CCD estándar y tarjetas de vídeo. Elegir un sistema de vídeo-seguimiento para monitorear y analizar diversas variables tales como longitud del camino, escalatencia pe, y el tiempo dedicado en cada cuadrante. </li><li> Divida la arena en cuatro cuadrantes y ajustar la configuración de detección para garantizar un contraste óptimo entre los animales y el fondo para el seguimiento en directo. </li><li> Especifique la región de la plataforma. </li><li> Ajuste el tiempo de prueba máxima, 60 seg. </li></ol></li><li> Prueba MWM <ol><li> Antes de la prueba de comportamiento, permitirá a los ratones un período de adaptación de 20 a 25 min en una zona donde no pueden ver la piscina o claves espaciales. </li><li> Capacitar a cada ratón durante 9 días (dos ensayos consecutivos al día, con intervalo de 20 a 30 minutos entre ellos). </li><li> Encienda el ordenador y la cámara e iniciar el software del sistema de vídeo-seguimiento. </li><li> Tome el ratón por la cola y colocarlo en el agua, con su cabeza apuntando hacia el lado de la piscina, a partir de una de las cuatro posiciones de inicio (norte, sur, este, oeste). Para cada ratón, la posición de inicio debe ser diferente y pseudorandomized entre los ensayos. </li><li> Deje la natación del ratón y la búsqueda de la platform por un máximo de 60 segundos. Una vez que el animal llega a la plataforma, permitirá que se quede en la plataforma durante 20 segundos. </li><li> Si el ratón no pudo localizar la plataforma dentro de ese tiempo, guiar suavemente el ratón a la plataforma, sujetándolo por la cola y dejar que se quede allí por 20 seg. Una vez que el animal ha completado todos los dos ensayos, secarlo con una toalla y lo puso de nuevo en la jaula. </li><li> Cada día del período de entrenamiento, repita el mismo procedimiento (pasos 2.3.4-2.3.6). </li><li> Realice la prueba de la sonda en el día 9 después de la última pista de entrenamiento. </li><li> Retire la plataforma de la piscina. </li><li> Deje la natación del ratón y la búsqueda de la plataforma para un máximo de 60 segundos. </li><li> Periódicamente, verifique la temperatura del agua por lo que debe ser la misma (22 ° C) y limpiar la piscina. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de Secciones de perfundidos Animales <ol><li> Sacrificar a los ratones al final de MWM. Cuatro ratones por genotipo deben ser anestesiados antes de euthanización de acuerdo a las normativas locales e internacionales. </li><li> Perfundir el animal transcardially (cortar la derecha auriclewith una tijera para permitir el sangrado e introducir una cánula de mariposa en el ventrículo izquierdo para perfundir) con tampón fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-15 min 22. </li><li> Diseccionar y post-fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante al menos 12 h. </li><li> Coloca los cerebros de 50 ml tubos cónicos de poliestireno que contienen 15 ml de 0,02% azida sódica en PBS 0,1 M y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario para cortar. </li><li> Corte y retire el cerebelo antes vibratome corte. </li><li> Pegue el cerebro en posición vertical con el sitio de corte, utilizando pegamento, sobre la placa de soporte de la vibratome. </li><li> Cortar el cerebro en 20-40 micras secciones coronales de espesor, con el fin de serie en todo el hipocampo dorsal, en vibratome apropiado. </li><li> Recoger vibratome rebanadas con un pincel y transferir a un 24 placa de múltiples pocillos que contenía 1 ml de 0,1 M PBS para cada pocillo. </li><li> Secciones para almacenaje de corto plazo en PBS o largo plazo en 0,02% azida sódica en PBS a 4 ºC (tejido pueden ser utilizados para un máximo de un año). </li></ol> 4. La inmunohistoquímica <ol><li> Transferencia 3-5 secciones del hipocampo dorsal de cada ratón, en 24 placa de múltiples pocillos que contenía 500 l de 0,1 M PBS para cada pocillo. </li><li> Lávese las secciones contenidas en cada pocillo con 500 l de 0,1 M PBS (5 min, 3 veces con agitación suave). </li><li> Apagar la actividad de la peroxidasa endógena, incubando secciones en 1% H 2 O 2 en PBS durante 20 min con agitación suave. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Permeabilización de tejido: incubar las secciones durante 5 min en 0,2% de Triton X-100 en PBS. </li><li> Durante los pasos anteriores (4,4; 4,5), haga tampón de bloqueo suficiente (10% de suero de cabra y el 0,1% de Triton-X100 en PBS) durante todo el experimento (number de las secciones x 100 l x 3 pasos). </li><li> Nota: El uso de suero de la misma especie en la que el Ab secundario (conjugado con biotina) se hizo. </li><li> Evitar la unión no específica del anticuerpo, mediante la incubación de las secciones en tampón de bloqueo (100 l / sección) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación suave. </li><li> Incubar las secciones de Ab primario (pERK) diluido en tampón de bloqueo, durante la noche a 4 ° C, con agitación suave. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Incubar con el Ab secundario conjugado con biotina (1: 250) diluido en tampón de bloqueo (el mismo que se utiliza en el paso 4.6) durante 1 hora a RT con agitación suave. </li><li> Preparar reactivo ABC, al mismo tiempo, debido a la avidina y biotina requieren por lo menos 30 min a temperatura ambiente a lo complejo. </li><li> Preparar el volumen necesario de ABC reactivo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> IncubatSecciones E para 45 min a TA con ABC de reactivo. </li><li> Lavar las secciones en PBS 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min). </li><li> Preparar solución de trabajo de DAB, cada etapa que implica DAB debe hacerse en la campana de humos como DAB es carcinógeno y teratógeno. </li><li> Transferir la solución de DAB a una nueva placa con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Coloque las secciones en la placa que contiene DAB solución y placa lentamente remolino de trabajo a mano, para permitir la máxima exposición a las secciones. </li><li> Monitorear reacción DAB en el microscopio hasta que se desarrolla la señal adecuada (2-5 min). </li><li> Detener la reacción con la intensidad de color deseada mediante el lavado del tejido en 0,1 M PBS (3 x 5 min). </li><li> Utilice lejía para desactivar cualquier solución de sustrato DAB restante en la campana de humos durante la noche y disponer de él de acuerdo con las directivas de laboratorio. </li><li> Mount secciones sobre gelatina recubiertas diapositivas flotando en PBS. Luego secar a temperatura ambiente al menos 3-4 horas. </li><li> Deshidratar la secuencialmente secciones en 50%, 70%, 95%y etanol al 100% durante 2 min cada uno, y claro en 100% de xileno durante 5 min. </li><li> Cubreobjetos utilizando medio de montaje y dejar en la campana de humos que se seque durante la noche. </li></ol> Conde 5. celular <ol><li> Recuento de células Perk-positivos, de tres a cinco secciones a nivel del hipocampo dorsal deben ser analizados por animal. </li><li> Adquirir varias imágenes de campo brillante de cada sección con una ampliación de 200X utilizando un microscopio adecuado, y luego ensamblarlos usando un software de procesamiento de imágenes. </li><li> Realizar el recuento de células en las imágenes de mosaico tiff convertida utilizando el software libre ImageJ. </li><li> Recuento de células Perk-manchado en la capa de células hilio y gránulos durante dos o tres cajas de conteo de 100 × 100 m cada uno. </li><li> Las densidades celulares se expresaron como el número de células marcadas por ventana de recuento (100 × 100 micras). </li><li> Realizar análisis estadístico para evaluar diferencias significativas entre genotipos. Esto se puede lograr con la t de Studentprueba o ANOVA seguido por el test post hoc apropiado utilizando softwares comerciales. Ajuste el nivel de significación estadística de p &lt;0,05. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Aquí, ofrecemos un protocolo de inmunohistoquímica Perk por revelar la activación neuronal después de MWM en En2 - / - ratones, un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico. Se detectaron niveles disminuidos de Perk en el subcampo CA3 del En2 - / - mutantes en comparación con WT. A diferencia de lo observado en el subcampo CA3, un aumento general de las neuronas Perk-positivo fue lugar detectarse tanto en hilio y GCL de En2 - / - ratones en comparación con WT. Una posi...

Trastornos del desarrollo neurológico incluyen un grupo amplio y heterogéneo de trastornos como el síndrome de Down, síndrome de cromosoma X frágil (FXS), el síndrome de Rett, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa y ASD, en la que el desarrollo y maduración del sistema nervioso central (SNC) se altera temprana durante el período prenatal 1. Estas disfunciones del desarrollo cerebral pueden causar profundos efectos, toda la vida en la función motora, lenguaje, aprendizaje y proceso de la memoria. Una plétora de factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo durante los últimos años 2,3. Incluso si los mecanismos moleculares que subyacen al fenotipo clínico siguen siendo desconocidos, los hallazgos mencionados anteriormente han permitido el desarrollo de varios modelos de ratón de estos trastornos. Déficits de aprendizaje y memoria se han identificado en un número de estos modelos de ratón, tales como Tsc1 +/-, Tsc2 +/-,Nf1 +/- y En2 - / - ratones 2,4-7. Un reto importante en el campo de los trastornos del desarrollo neurológico es la identificación de los procesos celulares y moleculares que subyacen a la memoria y el aprendizaje de la disfunción. Vías de señalización activadas seleccionados durante el aprendizaje o la memoria pueden inducir la transcripción de genes específicos y en última instancia conducir a la síntesis de novo de proteínas. Genes tempranos inmediatos de activación y de proteínas dependientes (IEGs) modificaciones sinápticas son inducidos rápidamente en las neuronas del cerebro en respuesta a la actividad neuronal y la formación del comportamiento 8,9. Las deficiencias en las vías de señalización que implican neurofibromina se han asociado con problemas de aprendizaje en los trastornos del desarrollo neurológico. Neurofibromin es el producto del gen NF1, cuya mutación causa neurofibromatosis tipo 1, un síndrome genético complejo caracteriza por tumores del sistema nervioso, de los retardos y de comportamiento de motor y cognitivo DISAbilidades 10. Ratones heterocigotos para eliminación Cf1 restringidas a las neuronas inhibitorias muestran déficits en la fase temprana de la potenciación a largo plazo (LTP), así como el aprendizaje espacial comprometido en MWM 5,11,12. Curiosamente, la deficiencia de NF1 este modelo de ratón conduce a una activación de Ras sobre-señalización en interneuronas inhibidoras durante el aprendizaje, lo que resulta en un aumento de la fosforilación de ERK y finalmente en una mejora anormal de la liberación de GABA a partir de estas neuronas 5. Basándose en estos hallazgos, la visualización de la actividad neuronal después de tareas de comportamiento representa una manera de reconstruir circuitos específicos implicados en enfermedades del desarrollo neurológico. El protocolo de inmunohistoquímica descrito aquí tiene como objetivo evaluar y cuantificar los niveles de fosforilación de ERK hipocampo siguientes MWM en un modelo de ratón ASD con déficits cognitivos. MWM es ampliamente utilizado para investigar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y la memoria en roedores 13,14 </sarriba&gt;. Decidimos utilizar la fosforilación de ERK como lectura molecular del aprendizaje hipocampo tarea dependiente, ya que ERK ha demostrado tener un papel esencial en el aprendizaje y la memoria formación 15. Por otra parte, la vía ERK es necesario para dependiente de la experiencia plasticidad en la corteza visual en desarrollo 16. Finalmente, los ratones que carecen de una de las dos isoformas de ERK (ERK2) en el espectáculo CNS marcados anomalías en los comportamientos cognitivos, emocionales y sociales 17, lo que indica que la señalización de ERK podría desempeñar un papel crítico en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, tales como ASD. Utilizamos Engrailed 2 nocaut (En2 - / -) ratones como modelo de trastornos del neurodesarrollo. En2 - / - ratones muestran características anatómicas y de comportamiento &quot;ASD-like&quot;, incluyendo la pérdida de interneuronas del cerebro anterior 18, la reducción de la expresión de genes relacionados con el ASD 19, disminución de la sociabilidad, y deterioro de la flexibilidad cognitiva 6,7,20. Learni espacialng y defectos de memoria, como los detectados en MWM, son especialmente robusto en En2 - / - ratones 6,7 y podrían ser relevantes para los deterioros cognitivos observados en pacientes ASD 21. Por otra parte, hemos demostrado que el aprendizaje espacial deteriorada en MWM se asocia con la reducción de expresión neurofibromina y aumentó los niveles pERK en el hilio del En2 - / - ratones adultos 7. Aquí presentamos el protocolo detallado para la caracterización inmunohistoquímica de Perk siguiente MWM en este modelo de ratón TEA.

<table><tbody><tr><td>EthoVision XT 8</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>Esta plataforma de software no es un requisito &ndash; hay muchos otros softwares de comportamiento en el mercado.</td></tr><tr><td>Pintura al temple</td><td>Giotto - Empresa</td><td></td> del Grupo Fila <td>Blanco y líquido, no tóxico. Se utiliza para preparar agua opaca en el laberinto acuático de Morris.</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Se pueden utilizar modelos equivalentes de otras compañías.</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Sigma</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Se utiliza para hacer un gradiente de etanol para la deshidratación antes del montaje de la corredera.</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>66004-950</td><td>Tóxico - para usar bajo el capó. Cambie el xileno cada mes según el uso.</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>kit ABC Vectastain&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Añadir en un volumen de 5 ml de PBS 2 gotas de reactivo A, mezclar y luego añadir 2 gotas de reactivo B y mezclar.</td></tr><tr><td>Sustrato de peroxidasa DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Añadir en un volumen de 5 ml ddH2O: 2 gotas de solución de material tampón y mezclar; 4 gotas de DAB y mezclar; 2 gotas de H2O2 y mezclar.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr>Tecnologías de Señalización Celular <td>de anticuerpos pERK</td><td>&nbsp;</td><td>4370</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Cabra Biotinilada Anticuerpo IgG Anti-Conejo</td><td>Laboratorios Vectores</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Dilución 1:250</td></tr><tr><td>Toboganes SuperFrost&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma 317616</td><td></td><td>Medio de montaje para correderas. Se puede utilizar un medio de montaje equivalente.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>&nbsp; Zeiss&nbsp;</td>Se <td>puede utilizar un microscopio equivalente</td> <td>a Axio Imager.M2</td>.</tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems, San José, CA</td><td></td><td>Para ensamblar imágenes.</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>El software gratuito se puede descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat Software Inc. (EE. UU.)</td><td></td> <td>Se pueden utilizar softwares equivalentes para el análisis estadístico.</td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, EE. UU.)</td><td></td> <td>Se pueden utilizar softwares equivalentes para el análisis estadístico.</td></tr></tbody></table>

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

La inducción de la quinasa extracelular regulada fosforilada (pERK) es una lectura fiable molecular de la activación neuronal de aprendizaje-dependiente. Aquí se describe un protocolo de inmunohistoquímica Perk para estudiar el perfil de la activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. En concreto, se utilizó inmunotinción Perk para estudiar la activación neuronal tras laberinto acuático de Morris (MWM, una tarea de aprendizaje hipocampo-dependiente clásica) en Engrailed-2 knockout (En2 - / -) ratones, un modelo de trastornos del espectro autista (TEA). En comparación con el de tipo salvaje (WT) controles, En2 - / - ratones mostraron déficits de aprendizaje espacial significativas en el MWM. Después de MWM, se detectaron diferencias significativas en el número de neuronas Perk-positivas en los subcampos del hipocampo específicas de En2 - / - ratones, en comparación con los animales WT. Por lo tanto, nuestro protocolo puede detectar diferencias en robustamenteneuronas Perk-positivos asociados con el deterioro de aprendizaje hipocampo-dependiente en un modelo de ratón de los TEA. Más en general, nuestro protocolo se puede aplicar a investigar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo en ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

El protocolo descrito aquí fue diseñado para visualizar, por inmunohistoquímica, la expresión de un marcador específico de la actividad de las neuronas del hipocampo después de MWM en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. Todos los datos experimentales que se muestran en este documento se tomaron de nuestro reciente trabajo 7. Se utilizaron obtenidos de apareamientos heterocigotos; camada de la misma edad de adultos (peso = 25-35 g 3-5 meses de edad) - Hombres y mujeres WT y En2 <su...

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar cambios en la fosforilación de irk en el hipocampo tras el aprendizaje espacial en ratones deficientes en Grailed dos, como modelo de trastornos del neurodesarrollo. Esto se logra primero evaluando tanto ratones de tipo silvestre como ratones deficientes en grail dos en el laberinto acuático de Morris. Como segundo paso, se extraen los cerebros de los ratones y se preparan cortes de tejido cerebral de ratones de tipo silvestre y deficientes mediante corte con viome.A continuación, se procesan cortes cerebrales de ratones de tipo salvaje y ratones knockout para inmunohistoquímica y se utilizan para detectar cambios en la fosforilación en el hipocampo. Los resultados muestran diferencias en la fosforilación de RC en el hipocampo entre ratones de tipo salvaje y ratones knockout del gen grail dos, según la visualización mediante microscopía óptica de la tinción inmunohistoquímica. Este método permite identificar subpoblaciones específicas de neuronas del hipocampo que se activan tras una tarea de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo, como el laberinto acuático de Morris.Añadimos por primera vez la idea de este método cuando decidimos investigar la cascada molecular que subyace al déficit molecular en ratones knockout de grado dos, un modelo de ratón para los trastornos del espectro autista. Para comenzar, entrene ratones de diversos orígenes de interés en una tarea de aprendizaje espacial, como el laberinto acuático de Morris. Siga el régimen de entrenamiento descrito en el protocolo de texto adjunto; al final del período de entrenamiento, sacrifique los ratones, fije sus cerebros y luego extráigalos.Cuando esté listo para continuar con el procedimiento, use un escalpelo para extraer el cerebelo. Luego, pegue con pegamento instantáneo el resto del cerebro en posición vertical sobre la placa portadora del vibrátomo. Corte el cerebro en secciones seriadas de 20 a 40 micrones de grosor a lo largo del hipocampo dorsal.Transfiera cada sección a un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de PBS 0,1 molar; transfiera de tres a cinco secciones del hipocampo dorsal de cada ratón a los pocillos de una placa multi-pocillo de 24 que contenga 500 microlitros de PBS 0,1 molar cada uno. Lave las secciones contenidas en cada pocillo con 500 microlitros de PBS 0,1 molar; realice todos los lavados e incubaciones a temperatura ambiente con agitación suave, salvo que se indique lo contrario. Bajo una campana extractora, incube las secciones en una solución de 40% metanol, 1% peróxido de hidrógeno en PBS 0,1 molar durante 20 minutos para inhibir la actividad de peroxidasa endógena.Después de otros tres lavados en PBS 0,1 molar, permeabilice las secciones incubándolas en 500 microlitros de Triton X-100 al 0,2 % durante cinco minutos. Mientras las secciones están incubando, prepare suficiente tampón de bloqueo para todo el experimento. Luego, retire la solución permeabilizante y añada 100 microlitros del tampón de bloqueo a cada pozo. Incube las secciones durante una hora.A continuación, retire el tampón de bloqueo y cubra las secciones con la proteína quinasa regulada por señal extracelular fosforilada. Diluya el anticuerpo primario uno a 500 en tampón de bloqueo. Incube las secciones durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación suave; al día siguiente, lave las secciones tres veces en PBS 0,1 molar durante cinco minutos cada vez.Incubar cada sección con un anticuerpo secundario conjugado con biotina diluido uno a 250 en tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente durante la incubación. Preparar el reactivo A BC al menos 30 minutos antes de su uso para permitir suficiente tiempo para que se forme el complejo de adenina y biotina. Después de lavar las secciones tres veces más con PBS 0,1 molar, añadir el reactivo A b, C y dejar que incube con la muestra durante 45 minutos. Durante el siguiente conjunto de tres lavados en PBS, prepare la solución de trabajo de DAB en la campana extractora según las especificaciones del fabricante, alícuota la solución de trabajo de DAB en la placa. A continuación, transfiera las secciones a los pocillos que contienen la solución de trabajo de DAB y agite lentamente la placa para permitir la máxima exposición de las secciones a la solución. Supervise la reacción de DAB en el microscopio hasta que se desarrolle una señal adecuada. En aproximadamente dos a cinco minutos, detenga la reacción en la intensidad de color deseada lavando el tejido en PBS 0,1 molar. Después de otros tres lavados en PBS, monte las secciones sobre portaobjetos recubiertos con gelatina y séquelas a temperatura ambiente durante al menos tres a cuatro horas. Una vez secas al aire, transfiera los portaobjetos a la campana extractora y deshidrate las secciones colocándolas secuencialmente en soluciones de etanol al 100 %, 95 %, 70 % y 50 % durante dos minutos cada una, luego aclare los portaobjetos en xileno al 100 % durante cinco minutos.Cubra, monte las laminillas utilizando medio de montaje y déjelas en la campana extractora durante la noche para que sequen; luego transfiera las laminillas a un microscopio de campo claro equipado con una cámara y un objetivo de 20x. Adquiera múltiples imágenes de campo claro de cada sección a 200x de magnificación, cubriendo la imagen del hipocampo dorsal. Tres a cinco secciones de cada animal.Se muestran aquí secciones de las regiones dorsales del hipocampo de un ratón de tipo salvaje y de un ratón con doble eliminación de Grailed, teñidas para la proteína extracelular regulada fosforilada, un indicador molecular confiable de la activación neuronal dependiente del aprendizaje. Ambos ratones habían realizado previamente un protocolo de tarea de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo, el laberinto acuático de Morris, antes de ser sacrificados.En el último día de pruebas, los dos ratones deficientes en Grailed mostraron un déficit significativo en el aprendizaje espacial en comparación con los ratones de tipo silvestre. Para analizar los cortes cerebrales de los ratones, se contó el número total de células positivas en las distintas regiones del hipocampo. En la capa del parámetro CA3, los ratones de tipo silvestre presentaron significativamente más células positivas para RK fosforilada por área que los ratones deficientes.Se encontraron resultados opuestos en la hili y la capa de células granulares o GCL. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la formulación de fosfatos en cortes cerebrales del hipocampo de modelos murinos tanto genéticos como farmacológicos de trastornos del neurodesarrollo caracterizados por déficits cognitivos. Esta técnica también puede utilizarse para estudiar cambios en la formulación de fuerzas de irk en otras áreas cerebrales, así como tras tareas conductuales cognitivas distintas al laberinto acuático de Maurice.No olvide que trabajar con bencina DIA puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar protecciones adecuadas, mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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Neurociencia

Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

El video ilustra un método de tinción de inmunofluorescencia utilizado para examinar la neurogénesis en el hipocampo adulto. Inicialmente, una sección del cerebro de un ratón se somete a un tratamiento con anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas marcadoras asociadas con la neurogénesis en las células progenitoras neuronales. A continuación, se marca con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos. A continuación, se observa la sección del cerebro bajo un microscopio confocal para...

Una técnica de tinción de inmunofluorescencia para detectar la neurogénesis del hipocampo adulto

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de neuronas de hipocampo de rata cultivadas dentro de un chip microfluídico para analizar la maduración neuronal y la conectividad.

Inmunotinción de fluorescencia de neuronas del hipocampo de rata dentro de un chip microfluídico

Este video muestra el procedimiento para teñir células madre neurales recién proliferadas en secciones de tejido cerebral utilizando la incorporación de EdU, seguido de inmunofluorescencia para visualizar proteínas específicas, mejorando la comprensión de la dinámica celular y la proliferación.

Tinción de inmunofluorescencia para la visualización de células madre neurales proliferadas en secciones de cerebro de ratón

Fuente: McLeod, F., et al. Evaluación de la densidad de sinapsis en cortes de cerebro de roedores hipocampales. J. Vis. Exp. (2017). Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores...

Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia

Fuente: Provenzano, G., et al. Visualización inmunohistoquímica de la actividad de las neuronas del hipocampo después del aprendizaje espacial en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra imágenes inmunohistoquímicas para visualizar la activación neuronal del hipocampo. Las secciones cerebrales teñidas revelan regiones más oscuras bajo un microscopio de campo claro, lo que indica neuronas activadas.

Imágenes de la activación neuronal del hipocampo en secciones del cerebro de ratón

Fuente: Ulivi, A. F., et. al. Imagen longitudinal de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019) Este video muestra imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas piramidales marcadas fluorescentemente en un ratón vivo,  mostrando la preparación, la alineación de las cánulas y la obtención de imágenes de dendritas y espinas dendríticas para estudiar la estructura neuronal en la región CA1 del hipocampo.

Imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas marcadas con fluorescencia en un hipocampo de ratón vivo 

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

El trasplante de neuronas GABAérgicas derivadas de células madre pluripotentes humanas generadas por la programación neuronal podría ser un posible enfoque de tratamiento para los trastornos del desarrollo neurológico. Este protocolo describe la generación y el trasplante de precursores neuronales GABAérgicos derivados de células madre humanas en los cerebros de ratones neonatos, lo que permite la investigación a largo plazo de las neuronas injertadas y la evaluación de su potencial terapéutico.

Trasplante de neuronas GABAérgicas derivadas de células madre humanas en el hipocampo de ratón postnatal temprano para mitigar los trastornos del desarrollo neurológico

Aprende inmunohistoquímica para visualizar la activación neuronal en el hipocampo de ratones tras el aprendizaje espacial. Este método permite identificar neuronas activadas en modelos de trastornos del neurodesarrollo.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico (Video) | JoVE Journal

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

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