Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

El objetivo general del siguiente experimento es detectar cambios en la fosforilación de la ira del hipocampo después del aprendizaje espacial en dos ratones knockout de Grial como modelo de trastornos del neurodesarrollo. Esto se logra probando primero tanto el tipo salvaje como el grial dos ratones knockout en el laberinto acuático de Morris. Como segundo paso, se extraen los cerebros de los ratones y se preparan rodajas de ratones de tipo salvaje y knockout mediante corte de viome.

A continuación, se procesan cortes de cerebro de ratones de tipo salvaje y knockout para la inmunohistoquímica y se utilizan para detectar cambios en la fosforilación en el hipocampo. Los resultados muestran diferencias en la fosforilación de RC en el hipocampo entre el tipo salvaje y en los ratones knockout del grial dos basados en la visualización de microscopía óptica de la tinción inmunohistoquímica. Este método permite identificar subconjuntos específicos de neuronas del hipocampo que se activan después de una tarea de aprendizaje especial dependiente del hipocampo, como el laberinto acuático de Maurice.

Añadimos por primera vez la idea de este método cuando decidimos investigar la cascada molecular que subraya el déficit molecular en ratones knockout de grado dos, un modelo de ratón para los trastornos del espectro autista. Para empezar, entrene a ratones de diversos orígenes de interés en una tarea de aprendizaje espacial, como el Morris Water Mae. Siga el régimen de entrenamiento como se describe en el protocolo de texto adjunto al final del período de entrenamiento, eutanasiar a los ratones y luego arreglar y extraer sus cerebros.

Cuando esté listo para continuar con el procedimiento, use un bisturí para extirpar el cerebelo. A continuación, pega el resto del cerebro en posición vertical en la placa de soporte del vibrato. Corta el cerebro en secciones seriadas de 20 a 40 micras de grosor a lo largo del hipocampo dorsal.

Transfiera cada rebanada a un pocillo de una placa de 24 pocillos llena con un mililitro de PBS de 0,1 molar, transfiera de tres a cinco secciones del hipocampo dorsal para cada ratón a los pocillos de una placa de 24 pocillos múltiples que contiene 500 microlitros de PBS de 0,1 molares para cada uno. Lave bien las secciones contenidas en cada pocillo con 500 microlitros de PBS 0.1 molar, realice todos los lavados e incubaciones a temperatura ambiente con agitación suave, a menos que se indique lo contrario. Bajo una campana extractora, incubar las secciones en metanol al 40 % y peróxido de hidrógeno al 1 % en PBS molar durante 20 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena.

Después de tres lavados más en PBS de 0,1 molares para perme las secciones incubándolas en 500 microlitros de Triton X 100 al 0,2% durante cinco minutos mientras se incuban las secciones, prepare suficiente tampón de bloqueo para todo el experimento. A continuación, retire la solución permeable y añada 100 microlitros del tampón de bloqueo a cada uno. Incubar bien las secciones durante una hora.

A continuación, retire el tampón de bloqueo y cubra las secciones con quinasa regulada extracelular fosforilada. Anticuerpo primario diluido de uno a 500 en tampón de bloqueo. Incubar las secciones durante la noche a cuatro grados centígrados con una agitación suave al día siguiente después de lavar las secciones tres veces en PBS de 0,1 molares durante cinco minutos.

Cada uno incuba las secciones con un anticuerpo secundario conjugado con biotina diluido de uno a 250 en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente durante la incubación. Prepare el reactivo A BC al menos 30 minutos antes de su uso para dar tiempo suficiente a la formación del complejo de Adén y biotina. Después de lavar las secciones tres veces más con PBS 0,1 molar, añadir el reactivo A, b, C y dejar incubar con la muestra durante 45 minutos.

Durante el siguiente conjunto de tres lavados en PBS, prepare la solución de trabajo DAB en la campana extractora de gases de acuerdo con las especificaciones del fabricante, alícuota la solución de trabajo DAB en la placa. A continuación, transfiera las secciones a los pocillos que contienen la solución de trabajo DAB y agite lentamente la placa para permitir la máxima exposición de las secciones a la solución. Monitoree la reacción DAB en un microscopio hasta que se desarrolle la señal adecuada.

En aproximadamente dos a cinco minutos, detenga la reacción a la intensidad de color deseada lavando el tejido en PBS 0.1 molar. Después de tres lavados más en PBS, monte las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina y séquelos a temperatura ambiente durante al menos tres o cuatro horas. Una vez secados al aire, transfiera los portaobjetos en la campana extractora y deshidrate las secciones colocándolas secuencialmente soluciones de etanol integradas durante dos minutos cada una, luego limpie los portaobjetos en xileno al 100% durante cinco minutos.

Cubra, deslice los portaobjetos con un medio de montaje y déjelos en la campana extractora durante la noche para transferir en seco los portaobjetos a un microscopio de campo brillante, equipado con una cámara y una lente de objetivo de 20 aumentos. Adquiera múltiples imágenes de campo claro de cada sección con un aumento de 200x que cubra la imagen del hipocampo dorsal. De tres a cinco secciones de cada animal.

Aquí se muestran secciones de las regiones dorsales de los campamentos de hipopótamos de un ratón de tipo salvaje y un ratón knockout de dos Griales teñidos para fosforilados. Extracelular reguló una lectura molecular confiable de la activación neuronal dependiente del aprendizaje. Ambos ratones se habían sometido a un régimen clásico de tareas de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo, el laberinto acuático de Morris antes del sacrificio.

En el último día de pruebas, los dos ratones knockout del Grial mostraron un déficit significativo de aprendizaje espacial en comparación con los ratones de tipo salvaje. Para analizar los cortes de cerebro de los ratones, se contó el número total de células positivas en las diversas regiones del hipocampo. En la capa de tres parámetros CA, los ratones de tipo salvaje tenían significativamente más células RK positivas fosforiladas por área que en los ratones knockout.

Se encontraron resultados opuestos en la capa de hili y células granulosas o GCL. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la formulación de phos en cortes de cerebro del hipocampo de modelos de ratón genéticos y farmacológicos de trastornos del neurodesarrollo caracterizados por déficits cognitivos. Esta técnica también se puede utilizar para estudiar los cambios en la formulación de la fuerza de irritación en otras áreas del cerebro, así como para seguir tareas cognitivo-conductuales diferentes a las del laberinto de agua de Maurice.

No olvide que trabajar con bencina DIA puede ser extremadamente desertor y por favor, siempre se deben tomar precauciones como el uso de protecciones adecuadas mientras se realiza este procedimiento.