Cuantificación de la distribución de una proteína presináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Tome un corte de cerebro de ratón fijado químicamente incrustado en un medio de inclusión de tejido.

Lave la rebanada con tampón para eliminar el medio.

Agregue una solución que permeabilice las membranas y bloquee los sitios de unión no específicos.

Retire la solución.

Para visualizar las proteínas sinápticas neuronales, incube el corte con anticuerpos primarios.

Estos anticuerpos se dirigen a una proteína presináptica expresada en las sinapsis de regiones específicas del cerebro y a una proteína sináptica expresada de forma ubicua como marcador de referencia.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.

Introducir anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo que se dirijan a los anticuerpos primarios.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Contratiñe los núcleos con un tinte de unión al ADN.

Lave con tampón y monte la rebanada con un medio de montaje adecuado.

Visualice el corte bajo un microscopio confocal.

Calcule las relaciones medias de intensidad de fluorescencia de la proteína diana y el marcador de referencia para analizar la distribución de la proteína diana en diferentes regiones del cerebro.

Para preparar las rodajas para la inmunotinción, use una pipeta de plástico para extraer la solución de PB de un pocillo sin extraer las rodajas de cerebro. Luego, use una pipeta de 1,000 microlitros para agregar 250 microlitros de PB fresco para lavarlos del exceso de OCT. Repita este lavado para cada pocillo a la vez para evitar que se sequen las rodajas.

A continuación, utilice una pipeta de plástico para extraer la solución de PB del primer pocillo. Utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir 250 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo, trabajando bien a pocillo de nuevo. Incube el plato a temperatura ambiente en una coctelera durante tres horas. Durante la incubación a 250 microlitros de tampón de anticuerpos por pocillo a un tubo de reacción.

A continuación, utilice una pipeta de 2 microlitros para añadir la cantidad adecuada de anticuerpo, pipeteándolo directamente en la solución, y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar. Luego, agite este anticuerpo diluido para asegurar una mezcla adecuada.

Trabajando bien a pozo, retire el tampón de bloqueo con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios por pocillo. Incube el plato en una coctelera a 4 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico. Lave las rodajas con 300 microlitros de tampón de lavado 1 por pozo, tres veces 10 minutos cada lavado en una coctelera a temperatura ambiente. Durante el lavado, trabajando en la oscuridad, diluya el anticuerpo secundario acoplado a fluoróforos en un tubo de reacción de la misma manera que se hizo anteriormente con el anticuerpo primario.

Una vez completado el lavado, retire el tampón de lavado con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios por pocillo. Incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 90 minutos. Una vez completada la incubación, retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico. Lave las secciones tres veces con el tampón de lavado 2 de la misma manera que con el tampón de lavado 1.

Durante este lavado, diluya la tinción DAPI en PB molar 0.1 para lograr una concentración de 1 a 2000. Después de retirar el tampón de lavado de la placa, agregue 250 microlitros de solución DAPI e incube a temperatura ambiente en el agitador durante 5 minutos.

Después de retirar la solución DAPI con una pipeta de plástico, utilice una pipeta de 1.000 microlitros para añadir 500 microlitros de PB molar 0,1 por pocillo. Coloque un portaobjetos de microscopio debajo de un estereoscopio. Use un pincel fino para agregar tres gotas separadas de PB molar 0.1 en el portaobjetos. Con el pincel, coloque una rebanada por gota en el portaobjetos y luego, aplaste y oriente las rebanadas.

Después de que todas las rodajas estén colocadas correctamente, use un pañuelo de papel para eliminar el exceso de PB y séquelas con cuidado sin secarlas por completo. Luego, agregue 80 microlitros de medio de inclusión en el portaobjetos y cúbralo cuidadosamente con un cubreobjetos para incrustar las rodajas de cerebro.

Cubra los portaobjetos para evitar la exposición a la luz y déjelos secar en la campana extractora durante una o dos horas, y luego guárdelos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 grados centígrados hasta que estén listos para la microscopía confocal.

Después de adquirir tejidos virtuales de todo el corte del cerebro para diferentes canales como se describe en el manuscrito, cargue todos los canales individuales para una imagen en Fiji haciendo clic en Archivo y luego en Abrir. A continuación, utilice la herramienta de selección a mano alzada para delinear un hemisferio en el canal DAPI. Haga clic en Editar, luego en Selección y luego en crear máscara para crear una máscara de la región seleccionada.

Luego haga clic en Analizar y luego en Medir partículas para determinar la intensidad media de fluorescencia para canales individuales, asegurándose de seleccionar diferentes canales para determinar los valores medios de intensidad de fluorescencia para cada canal.

Después de eso, copie la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en una hoja de cálculo. Para determinar la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en un área de interés, delinee el área con la herramienta de selección a mano alzada.