Diseño experimental para microdisección láser RNA-Seq: Lecciones de un análisis del desarrollo de la hoja de maíz

El objetivo general de este método es cuantificar la acumulación de transcripciones en células específicas o dominios celulares para que se puedan hacer comparaciones entre diferentes dominios o entre dominios equivalentes en muestras mutantes y de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cómo se especifican los dominios de los órganos o cómo las mutaciones específicas afectan la expresión génica. La principal ventaja de esta técnica es que la acumulación de transcripciones se puede cuantificar en dominios diminutos y definidos con precisión que son demasiado pequeños para ser diseccionados a mano.

Antes de comenzar este procedimiento, cultive pisos de plántulas de maíz en condiciones estándar hasta las dos semanas de edad. Para diseccionar los ápices de los brotes en las secciones laterales, primero extirpe una plántula justo debajo de la línea del suelo. Luego use una hoja de afeitar para quitar rodajas finas de la base del tallo hasta que se vea un óvalo de calma rodeado por una o dos hojas maduras.

Haz otro corte aproximadamente 10 milímetros por encima de la base. Este segmento de 10 milímetros contiene el meristemo apical del brote en los primordios de las hojas jóvenes. Gira el segmento de 10 milímetros para que la base quede hacia arriba.

Realizar dos cortes paralelos al eje lateral para obtener un portaobjetos de tejido de dos a tres milímetros de grosor. Deseche las dos partes exteriores y conserve la rebanada central para su fijación e incrustación. Sumerja la rodaja de tejido en aproximadamente 10 mililitros de fijación de agricultores en un frasco de vidrio con hielo.

Después de que se hayan diseccionado todas las muestras, aplique vacío para eliminar las burbujas de aire y ayudar a la penetración del fijador. Sostenga la aspiradora durante 10 minutos y luego suéltela lentamente. Reemplace el fijador e incube a cuatro grados centígrados durante la noche con una agitación suave.

Al día siguiente, continúe procesando los tejidos para su inclusión como se describe en el protocolo de texto. Para fundir bloques de parafina, coloque los moldes de inclusión en una placa caliente de la estación de inclusión de tejidos y use pinzas para transferir las muestras de tejido a los moldes de inclusión con la superficie de corte hacia abajo. Coloque el anillo de inclusión en la parte superior del molde.

Rellena cada molde con parafina derretida. Transfiera los moldes a una placa fría hasta que la parafina se haya solidificado. Guarde los bloques de parafina en un recipiente hermético con gel de sílice a cuatro grados centígrados.

Las secciones se cortan de bloques de parafina en un micrótomo siguiendo procedimientos estándar, y las secciones medianas que incluyen el meristemo apical del brote se seleccionan para el montaje. Para montar las secciones en portaobjetos, coloque portaobjetos que no contengan ARNasa o que estén horneados en un calentador de portaobjetos a 42 grados centígrados. Aplique varias gotas de solución de etanol al 50% para cubrir cada portaobjetos.

Coloque suavemente las secciones en el portaobjetos y haga flotar las secciones en la solución de etanol hasta que se hayan expandido. A continuación, incline el portaobjetos y elimine el exceso de solución de etanol por aspiración con una pipeta de transferencia desechable. Use toallitas sin pelusa para absorber cualquier solución de etanol adicional.

Seque los portaobjetos a 42 grados centígrados durante varias horas o toda la noche. Cuando los portaobjetos estén secos, guárdelos en un recipiente hermético con gel de sílice a cuatro grados centígrados. Desparafinar los portaobjetos el día de la microdisección.

Prepare tres frascos de vidrio Coplin, dos frascos que contienen aproximadamente 50 mililitros de xilenos 100% y un frasco que contiene aproximadamente 50 mililitros de etanol 100%. Sumerja los portaobjetos en xilenos uno durante dos minutos, xilenos dos durante dos minutos y etanol al 100% durante un minuto. Drene los portaobjetos sobre toallitas sin pelusa y séquelos al aire a temperatura ambiente.

Para comenzar este procedimiento, asegure los portaobjetos en la platina del microscopio de microdisección láser. Un factor crítico en el éxito de la microdisección láser en experimentos de RNasic es el uso de marcadores morfológicos y moleculares para seleccionar dominios precisos para la microdisección. Examine los portaobjetos utilizando un objetivo 5X e identifique las cinco secciones más medianas de cada portaobjetos utilizando el ápice del meristemo apical del brote como punto de referencia central.

A continuación, utilice un objetivo de 10X o 20X para identificar la posición de la lígula en el primordio de siete hojas del plastocronio de cada sección. La lígula será visible como una protuberancia que sobresale de la superficie adaxial del primordio de la hoja. Utilice la herramienta de dibujo del software de microdisección láser para marcar esta posición.

Seleccione el icono de dibujo a mano alzada, mueva el cursor a la posición adecuada y haga clic y arrastre el ratón para dibujar. El siguiente paso es usar la regla y la herramienta de dibujo rectangular para medir rectángulos de 100 micrómetros de altura centrados en una lígula de cada sección como muestras de lígula. Para usar la herramienta de regla, seleccione el icono de regla, mueva el cursor a un extremo de la región que se va a medir y, a continuación, haga clic y arrastre para medir la región.

La longitud de la regla se mostrará en la pantalla. Utilice la herramienta de regla para medir un segmento de 100 micrómetros centrado en una lígula. Para dibujar un rectángulo, seleccione la herramienta de dibujo de línea recta y dibuje cuatro líneas rectas.

De la misma manera, mida rectángulos de 100 micrómetros colocados a 50 micrómetros por encima y por debajo del rectángulo de la lígula. Estas serán las muestras de la hoja y la funda. Microdiseccione los rectángulos medidos utilizando la función de corte láser para cortar la sección de tejido a lo largo del contorno del dominio seleccionado, y la función de catapulta para impulsar el rectángulo del tejido desde el portaobjetos hasta la tapa del tubo.

Recoja muestras de lígula, cuchilla y vaina en tubos separados. Utilice el mismo procedimiento para microdiseccionar muestras epidérmicas adaxiales de cuchillas, lígulas y vainas de primordios de siete hojas de plastocron. Por último, aplique un tampón de extracción de ARN al tejido microdisecado y proceda con la extracción de ARN, la amplificación de ARN, la construcción de bibliotecas, la secuenciación y el análisis bioinformático como se describe en el manuscrito.

Cuando se analizó la acumulación de transcripciones y todas las capas celulares de las regiones de la hoja, la lígula y la vaina, se encontraron 2.359 genes expresados diferencialmente. En las regiones de la lámina epidérmica adaxial, la lígula y la vaina, se encontraron 3.128 genes expresados diferencialmente. La microdisección láser, el RLM, la secuenciación de ARN y los análisis de hibridación in situ proporcionaron resultados consistentes, como lo ilustran estos genes representativos.

Las caricaturas de la izquierda ilustran la LM de todas las capas celulares, y las caricaturas de la derecha ilustran solo la LM de la epidermis adaxial. Las puntas de flecha en las imágenes indican lígulas emergentes. La acumulación de la transcripción de una lígula fue significativamente mayor en la lígula tanto en todas las capas celulares como en la LM epidérmica. La vaina estrecha una fue significativamente regulada al alza en la región de la lígula tanto en todas las capas celulares LM como en la epidermis adaxial LM, y se acumula específicamente en la punta de la lígula emergente.

Un gen de función desconocida tuvo un recuento medio más alto en la LM epidérmica de la lígula que en la LM de todas las capas. Esta transcripción se acumula con mayor fuerza en las células epidérmicas. El cuarto gen, Zm PIN1a, no se expresó significativamente de manera diferencial en el análisis de todas las capas celulares, pero se reguló significativamente en la lígula en el análisis de solo epidermis. Su alta expresión en el tejido vascular puede haber confundido las diferencias en la acumulación de transcritos en la epidermis cuando se recolectaron todas las capas celulares.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la elección de los dominios celulares para microdiseccionar y comparar, y la precisión de las microdisecciones son cruciales para el éxito de los experimentos.