Name: Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Descubre dos métodos para crear modelos de hipoparatiroidismo en ratones mediante paratiroidectomía guiada por GFP y ablación con toxina diftérica. Estos modelos preservan la función tiroidea y permiten evaluar análogos de PTH.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01-DK100584 y Laboratorio Estatal de China de las Enfermedades Orales SKLOD2015OF01 Financiación abierta (RB). Agradecemos a Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, y Kelly Lauter en busca de ayuda.

Este estudio ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Obtener la aprobación institucional adecuado para este estudio en animales antes de comenzar. Algunas técnicas podrían tener que ser ajustados de acuerdo con los requisitos locales IACUC. 1. Los ratones GFP-PTX <ol><li> Obtener ratones PTHcre + y ratones Rosa-mTmG a las 8 - 10 semanas de edad para su posterior acoplamiento. </li><li> Retrocruzamiento los ratones PTHcre + (129 mixtos; FVB fondo) con ratones C57BL / 6 de 6 generaciones para obtener ratones con C57BL / 6 antecedentes. </li><li> Ratones inbreed PTHcre + para obtener PTHcre + / + ratones 17. NOTA: Para realizar el genotipado, extraer el ADN de la punta de la cola y utilizarla para PCR. Los cebadores de PCR para detectar la heterocigosidad y homocigosidad del transgén PTHcre son los siguientes: cebador directo A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, cebador inverso A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, forward imprimación B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, cebador inverso B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Cruz PTHcre + / + ratones con 16 ratones Rosa-mTmG 18. Destetar PTHcre; crías cuando mTmG 4 semanas de edad. </li><li> Anestesie 8 - 10 semanas de edad PTHcre; ratones mTmG por inyección ip de tribromoetanol (Avertin) a 0,6 mg / g de peso corporal, o de otros agentes, como la ketamina / xilazina. Utilice buprenorfina 0,1 mg / kg sc cada 12 h como analgésico para 48 h después de la cirugía de acuerdo con un protocolo aprobado. Asegúrese de profundidad adecuada de la anestesia por el reflejo del dedo del pie pizca retirada u otros medios. Colocar el animal en posición supina. </li><li> Ampliar y preparar a la región ventral del cuello por el afeitado de la piel con cuchillas de simple canto. Desinfectar la piel afeitada con una almohadilla antiséptica de povidona yodada. </li><li> Cubrir el animal con paños quirúrgicos estériles para reducir la contaminación de la zona quirúrgica y el uso de micrófono autoclaverosurgical instrumentos para el procedimiento quirúrgico. </li><li> Cortar una incisión longitudinal 2 cm en la piel con un bisturí quirúrgico. Diseccionar la fascia y empujar las glándulas salivales a la banda mediante disección roma con pinzas dentadas curvadas. </li><li> Bajo el microscopio de disección usando luz de halógeno y un 4 - aumento de 5X, cortar y separar los músculos paratraqueales Con unas pinzas afiladas puntas y exponer la tráquea. </li><li> Identificar la glándula tiroides con la derecha y la izquierda del lóbulo situado al lado de la tráquea. </li><li> Cambie la fuente de luz para la luz fluorescente y visualizar las dos glándulas paratiroides verde-fluorescente. NOTA: Por lo general, las dos glándulas paratiroides están localizadas en la superficie o cerca de la glándula tiroides, pero en ocasiones, se encuentran más lejos. </li><li> Retirar con cuidado las glándulas paratiroides verdes utilizando pinzas quirúrgicas y tijeras. Utilice una gasa estéril para la hemostasia y comprobar cuidadosamente a lo largo de la tráquea para asegurar que todo el tejido verde ha sido retirado. </li&gt; <li> Cierre los músculos paratraqueales sutura interrumpida por el uso de 6-0 poliglactina 910 puntos de sutura. Cerrar la incisión de la piel mediante sutura Halsted utilizando 6-0 poliglactina 910 puntos de sutura. </li><li> Opcional: Inyectar 10 l / g de peso corporal solución normal estéril de cloruro de sodio 0,9% a los ratones para la reposición de líquidos. </li><li> Coloque animales posquirúrgicas a una jaula separada en una incubadora caliente (37 ° C) para la recuperación de la temperatura corporal. Una vez que los ratones son despierto y en la posición reclinada, poner Chow pellet y agua con algo de comida de gelatina en el suelo de la jaula. </li><li> Después de un periodo de observación post-quirúrgica de 2 h, ratón regresar a las instalaciones de los animales y los requisitos locales para el cuidado postoperatorio. </li><li> 3 días después de la paratiroidectomía, obtener sangre de la cola 10 l y medir ionizado Ca ++ usando un analizador de sangre, tales como el sistema de gases en sangre Ca ++ / analizador de pH. Paratiroidectomía resultados exitosos en la sangre ionizadas Ca ++ igual o inferior a -2 DE de con operación simuladalos ratones de control (1,20 mmol / L en nuestros experimentos de n = 30). </li></ol> 2. PTH-CRE-IDTR ratones <ol><li> Obtener PTHcre + y DTR fl / fl ratones a las 8 - 10 semanas de edad para el apareamiento. </li><li> Retrocruzamiento los ratones PTHcre (129 mixtos; FVB fondo) con ratones C57BL / 6 de 6 generaciones para obtener ratones con C57BL / 6 antecedentes. </li><li> Inbreed la PTHcre + (C57BL / 6 antecedentes) ratones para obtener PTHcre + / + ratones 17. NOTA: Para realizar el genotipado, se extrajo y se utiliza para la PCR de ADN de ratones puntas de la cola. Los cebadores de genotipado: cebador directo, un cebador inverso, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, el cebador B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, cebador inverso B&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Aparearse PTHcre + / + ratones con 16 DTR fl / fl ratones 19 para obtener ratones PTHcre-IDTR. </li><li> Preparar la solución DT diluyendo diphtheriun polvo de toxina con solución salina estéril hasta una concentración de 0,5 mg / ml. Filtro estéril, y almacenar alícuotas a -80 ° C. </li><li> Elija 8 - 10 semanas de edad ratones PTHcre-IDTR para experimento de inyección. Descongelar DT alícuota a temperatura ambiente, administrar DT intraperitonealmente a 5 mg / kg (10 l / g) de peso corporal del animal. Para una eficiencia máxima y menos toxicidad, administración DT se repite para un total de 2 inyecciones en un intervalo de 3 días 17. </li><li> 3 días después de la segunda inyección, tomar 10 l de sangre de la cola de cada PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-mTmG ratón y medir el Ca ++ sangre utilizando un Sistema de Ca ++ analizador de gases en sangre / pH. NOTA: Definimos ratones con sangre ionizados Ca ++ menor que 1,18 mmol / L como ratones hipoparatiroidismo, que es igual a 2SD por debajo de la media de los ratones de control con vehículo inyectado (n = 22). </li></ol>

<ol><li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandi%2C+ML+%22Hypoparathyroidism%22">Hypoparathyroidism</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>van Abel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+renal+Ca%282%2B%29+transport+proteins+by+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of renal Ca(2+) transport proteins by parathyroid hormone.</a> Kidney Int. 68, 1708-1721 (2005).</li>
<li>Sebastian, E. M., Suva, L. J., Friedman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+intermittent+PTH%281-34%29+and+PTH%287-34%29+on+bone+microarchitecture+and+aortic+calcification+in+experimental+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Differential effects of intermittent PTH(1-34) and PTH(7-34) on bone microarchitecture and aortic calcification in experimental renal failure.</a> Bone. 43, 1022-1030 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Ortiz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+deficiency+reduces+circulating+levels+of+FGF23%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Calcium deficiency reduces circulating levels of FGF23.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Liao, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+Fibroblast+Growth+Factor+23+and+Biochemical+and+Bone+Histomorphometric+Alterations+in+a+Chronic+Kidney+Disease+Rat+Model+Undergoing+Parathyroidectomy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Relationship between Fibroblast Growth Factor 23 and Biochemical and Bone Histomorphometric Alterations in a Chronic Kidney Disease Rat Model Undergoing Parathyroidectomy.</a> PloS one. 10, e0133278(2015).</li>
<li>Fox, J., Care, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+low+calcium+and+low+phosphorus+diets+on+the+intestinal+absorption+of+water+in+intact+and+parathyroidectomized+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Effect of low calcium and low phosphorus diets on the intestinal absorption of water in intact and parathyroidectomized pigs.</a> Calcif Tissue Int. 31, 253-255 (1980).</li>
<li>Finco, D. R., Brown, S. A., Ferguson, D. C., Crowell, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+parathyroidectomy+of+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Selective parathyroidectomy of the dog.</a> Can J Vet Res. 57, 288-292 (1993).</li>
<li>Can, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+allotransplantation+in+rabbits+without+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Parathyroid allotransplantation in rabbits without cultivation.</a> Int J Clin Exp Med. 7, 280-284 (2014).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22j+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> j Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
<li>CRIVER. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures">http://www.criver.com/products-services/basic-research/rodent-surgery/soft-tissue-procedures</a> (2010).</li>
<li>Sakai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+development+in+immobilized+bone+is+suppressed+by+parathyroidectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Metab%22%5BJournal%5D)">Osteoclast development in immobilized bone is suppressed by parathyroidectomy in mice.</a> J Bone Miner Metab. 23, 8-14 (2005).</li>
<li>Miao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+abnormalities+in+Pth-null+mice+are+influenced+by+dietary+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Skeletal abnormalities in Pth-null mice are influenced by dietary calcium.</a> Endocrinology. 145, 2046-2053 (2004).</li>
<li>Gunther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+parathyroid+glands+reveals+another+source+of+parathyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of parathyroid glands reveals another source of parathyroid hormone.</a> Nature. 406, 199-203 (2000).</li>
<li>Hough, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+calcium-sensing+receptor+mutation+in+the+mouse+is+associated+with+cataracts+and+ectopic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activating calcium-sensing receptor mutation in the mouse is associated with cataracts and ectopic calcification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13566-13571 (2004).</li>
<li>Hannan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calcilytic+Agent+NPS+2143+Rectifies+Hypocalcemia+in+a+Mouse+Model+With+an+Activating+Calcium-Sensing+Receptor+%28CaSR%29+Mutation%3A+Relevance+to+Autosomal+Dominant+Hypocalcemia+Type+1+%28ADH1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Calcilytic Agent NPS 2143 Rectifies Hypocalcemia in a Mouse Model With an Activating Calcium-Sensing Receptor (CaSR) Mutation: Relevance to Autosomal Dominant Hypocalcemia Type 1 (ADH1).</a> Endocrinology. 156, 3114-3121 (2015).</li>
<li>Libutti, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+gland-specific+deletion+of+the+mouse+Men1+gene+results+in+parathyroid+neoplasia+and+hypercalcemic+hyperparathyroidism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Parathyroid gland-specific deletion of the mouse Men1 gene results in parathyroid neoplasia and hypercalcemic hyperparathyroidism.</a> Cancer Res. 63, 8022-8028 (2003).</li>
<li>Bi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+Toxin-+and+GFP-Based+Mouse+Models+of+Acquired+Hypoparathyroidism+and+Treatment+with+a+Long-Acting+Parathyroid+Hormone+Analog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Diphtheria Toxin- and GFP-Based Mouse Models of Acquired Hypoparathyroidism and Treatment with a Long-Acting Parathyroid Hormone Analog.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Buch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-inducible+diphtheria+toxin+receptor+mediates+cell+lineage+ablation+after+toxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A Cre-inducible diphtheria toxin receptor mediates cell lineage ablation after toxin administration.</a> Nat Methods. 2, 419-426 (2005).</li>
<li>Dunn, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoblasts+in+the+stroma+of+the+parathyroid+glands+of+strain+C58+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Melanoblasts in the stroma of the parathyroid glands of strain C58 mice.</a> J Natl Cancer Inst. 10, 725-733 (1949).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Demostramos la técnica de paratiroidectomía GFP guiada por el uso de ratones transgénicos con la expresión de GFP selectivamente en las glándulas paratiroides. En los PTHcre; mTmG ratones, el doble de fluorescencia (GFP verde en las células expresadas por Cre y tomate rojo en la no-Cre expresó células) nos ha permitido identificar con claridad, y para extraer con precisión todas las glándulas paratiroides sin la eliminación de la tiroides. Aunque preferimos el uso de la doble fluorescencia mTmG ratones para la capacidad de identificar tejido no paratiroidea rojo fluorescente, nuestro procedimiento también debería funcionar bien el uso de animales fluorescentes individuales tales como el rojo tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) / J del ratón Hze). El procedimiento es relativamente fácil de realizar, requiere aproximadamente 20 min por ratón, y los resultados en un fenotipo grave hipoparatiroidismo y sostenido. Además, otra ventaja de las glándulas paratiroides positivas para GFP es la facilidad de detección de las glándulas paratiroides aberrantes. Nuestros estudios demuestranmislocalization de las paratiroides en aproximadamente un cuarto de los ratones B6 (Figura 1), que son detectados fácilmente en nuestro modelo de ratón por la fluorescencia verde. Contrariamente a Thyro-paratiroidectomía, nuestra técnica evita la eliminación de la tiroides con la consiguiente necesidad de reemplazo de la hormona tiroidea y el efecto desconocido de la eliminación de células C de la tiroides productoras de calcitonina. glándulas paratiroides marcadas fluorescentemente se podrían también utilizar para otras investigaciones que requieren el aislamiento de las glándulas paratiroides. La limitación de este modelo incluye el requisito para la cirugía. Se requieren habilidades básicas de microcirugía y un microscopio de disección con una fuente de luz fluorescente. Una segunda técnica para generar ratones hipoparatiroidismo que elimina la necesidad de cirugía se demuestra. La toxina de la difteria-ratones tratados PTHcre-IDTR exhiben un fenotipo más leve hipoparatiroidismo, sino que simplemente requieren la inyección de DT por vía intraperitoneal en el ratón. La parte fundamental for generando este modelo fue la optimización de la dosis y el régimen de dosificación. Las altas dosis de DT llevaron a toxicidad, pero las dosis bajas disminuyó la eficacia del enfoque. Se determinó que el regimiento dosis de 2 inyecciones a 5 mg / kg, administrada 3 días de diferencia, dio lugar a hipocalcemia fiable y estable sin mortalidad / mínima. En última instancia, esperamos que estos dos enfoques proporcionan modelos útiles de ratón para el hipoparatiroidismo adquirida. Usando una nueva PTH de acción prolongada, se informó de la primera utilización de ambos de estos modelos para determinar la eficacia de nuevos fármacos para el hipoparatiroidismo 17.

Desde la primera descripción sistemática de las glándulas paratiroides en humanos y en otras especies por Sandström en 1880 1, la comprensión de la importancia de este pequeño órgano endocrino para la fisiología humana y la enfermedad ha mejorado continuamente. Estas glándulas secretan la hormona paratiroidea (PTH), el principal regulador del metabolismo del calcio. La PTH es también una hormona importante para la homeostasis fosfato y el recambio óseo 1, 2. La eliminación accidental o daño de las paratiroides durante la cirugía de cuello es la causa más común de hipoparatiroidismo, una enfermedad caracterizada por niveles bajos de calcio, PTH baja, y el fósforo elevados 1. Para un mejor estudio adquirida hipoparatiroidismo y la prueba de nuevas terapias, fiable y fácilmente se requieren modelos de ratones accesibles. Los ratones se usan ampliamente en la investigación debido a una amplia variedad de herramientas genéticas son unavailable en esta especie que permiten estudios sobre los mecanismos sofisticados in vivo. Sin embargo, mientras que la paratiroidectomía quirúrgica (PTX) se puede utilizar en las ratas 2, 3, 4, 5, y los mamíferos más grandes 6, 7, 8, es técnicamente muy difícil en los ratones, debido al tamaño pequeño de las glándulas y su distribución anatómica variable de 9. Por lo tanto, Thyro-paratiroidectomía (TPTX) se lleva a cabo normalmente en ratones, en los que la tiroides y glándulas paratiroides se retiran juntos 10. Sin embargo, los niveles bajos de la hormona de la tiroides son un potencial de confusión en los experimentos, lo que complica este modelo. Además, las células C dentro de la glándula tiroides, que producen calcitonina, una hormona importante en la homeostasis del calcio en los roedores, también se pierden después de la retirada de los THyroids 11. Existen varios modelos genéticos de ratón de hipoparatiroidismo, que incluyen el ratón PTH-12 nulos, el ratón nulo GCM2 13, y el ratón Nuf con una mutación activadora en el receptor sensible al calcio (RSCa) 14, 15. Sin embargo, estos defectos genéticos ya están presentes durante el desarrollo embrionario, y la función de las paratiroides tanto, es ya deteriorados durante la embriogénesis. Esto puede afectar el desarrollo de órganos tales como el esqueleto. Esto contrasta con los pacientes con hipoparatiroidismo postquirúrgico que adquieren la enfermedad más adelante en la vida. Por otra parte, algunos de estos modelos de ratón exhiben letalidad temprana y reducción de la fertilidad, lo que complica aún más su uso 12, 13, 14. Hemos desarrollado dos nuevos ratón modelos el hipoparatiroidismo adquirida. Utilizando ratones manipulados genéticamente que expresan GFP específicamente en las paratiroides permite a las glándulas paratiroideas para ser fácilmente identificados por la extirpación quirúrgica sin la eliminación de la glándula tiroides. Este ratón se generó por cruzar el ratón PTH-Cre, que expresa Cre recombinasa bajo el control del promotor de PTH 5,5 kb 16 con el ratón ROSA mTmG. Los PTHcre resultantes; mTmG ratones expresan la proteína verde fluorescente específicamente en las células paratiroideas. El segundo modelo de ratón utiliza el mismo PTH-Cre, esta vez para eliminar un casete de STOP del ratón DTR inducible, lo que resulta en la expresión del receptor de toxina de la difteria específicamente en las paratiroides. La administración sistémica de DT destruye las células paratiroideas, haciendo que los animales hipoparatiroidismo sin necesidad de cirugía. Los dos modelos de ratón presentados en este estudio demuestran un fenotipo hipocalcemia estable en los peri observación de tres mesessobredosis. Los procedimientos son fáciles de realizar, el fenotipo es reproducible, y los ratones hipoparatiroidismo exhiben una alta tasa de supervivencia 17.

<table><tbody><tr><td>Ratones ROSAmT/mG</td><td>Ratones The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>PTH-Cre</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polyglactin 910 sutura con aguja</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de seguridad de un solo filo</td> Compañía <td>Americana de Navajas de Afeitar</td> <td>de Seguridad66-0089</td><td></td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar de seguridad de plumas</td> de<td>bisturí desechable</td> Co., LTD <td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de povidona-yodo</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>de capa Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio al 0,9%</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 29 g Jeringa de insulina</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>cortinas de inciso quirúrgicas</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Dumstar Biology</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tijeras de resorte de disección</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>MILTEX.,Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrometanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>para disolver el polvo de toxina diftérica 2,2,2-tribrometanol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>Disolver en una solución de cloruro de sodio al 0,9% a 1 mg/mL como solución madre en -80 &#176; C</td></tr><tr><td>Tubos capilares de extracción de sangre Multicap</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>Para la extracción de sangre en el análisis de iCa2+ utilizando el analizador RapidLab 348 Ca2+/pH</td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>para el análisis de iCa2+</td></tr></tbody></table>

dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: una paratiroidectomía utilizando gfp glándulas y difteria-mediadas por toxinas paratiroidea ablación

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

El hipoparatiroidismo (HP) es un trastorno caracterizado por bajos niveles de PTH que conducen a hipocalcemia, hiperfosfatemia y bajo recambio óseo. La causa más común de la enfermedad es la extirpación accidental de las glándulas paratiroides durante la cirugía de tiroides. Se necesitan terapias novedosas para la HP, pero para probarlas se necesitan modelos animales fiables de la HP adquirida. 
Aquí, demostramos la generación de dos modelos de ratón de HP adquiridos. En el modelo GFP-PTX, se crearon ratones con proteína verde fluorescente (GFP) expresada específicamente en las paratiroides (PTHcre-mTmG) cruzando ratones PTHcre+ con ratones Rosa-mTmGfl/fl. Las glándulas paratiroides fluorescentes verdes se identifican fácilmente bajo un microscopio de disección de fluorescencia y la paratiroidectomía se realiza en menos de 20 minutos. Después de la cirugía guiada por fluorescencia, los ratones presentan una hipocalcemia profunda. A diferencia de la tiroparatiroidectomía tradicional, este enfoque quirúrgico preciso deja intactas las glándulas tiroides y la función tiroidea. El segundo modelo, que no requiere cirugía, se basa en un enfoque de difteria-toxina. Los ratones PTHcre-iDTR, que expresan el receptor de la toxina diftérica (DT) específicamente en las paratiroides, se generaron cruzando el ratón DTR inducible con el ratón PTHcre. De este modo, las células paratiroideas se vuelven sensibles a la toxina diftérica (DT) y pueden destruirse selectivamente inyectando sistemáticamente DT a ratones. El fenotipo hipocalcémico resultante es estable.

Ubicación de la glándulas paratiroides En primer lugar, se registró la distribución de las glándulas paratiroides de 54 ratones PTHcre-mTmG como se observa bajo el microscopio de disección fluorescente. 74% (40/54) ratones tenían dos glándulas paratiroides verdes (Figura 1 A, C, E), 26% (14/54) ratones tenían un tercer glándula paratiroidea adicional (Figura 1 B, D, F). No se observó ratón con un solo glándula o más de tres glándulas. Por lo general, las glándulas paratiroides se encuentran cerca del borde superior de la glándula tiroides (58%, 71/122; Figura 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) glándulas se encuentran cerca del borde inferior de la glándula tiroides (Figura 1C (1), D (3), F (1)), y el 13% (16/122) se encuentra lejos de la tglándula hyroid (Figura 1B (3), E (1), F (2)). Nuestros resultados son consistentes con los resultados anteriores y se extienden de diferentes lugares de las glándulas paratiroides 20. Los ratones GFP-PTX La cirugía completa de la anestesia para el cierre de la incisión de la piel se llevó aproximadamente 20 min por ratón. La tasa de supervivencia de los ratones posquirúrgicas más de un período de observación de 3 meses fue del 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) ratones GFP-PTX exhibieron niveles de calcio ionizado que eran 2 DE por debajo de la media de los ratones de control con operación simulada o inferior. El fenotipo hipoparatiroidismo en los ratones GFP-PTX (hipocalcemia, bajo PTH y fosfato sérico elevado) se mantuvo estable durante todo el tiempo de observación de 3 meses. Es importante destacar que la función tiroidea no era diferente de los animales con operación simulada 3 meses después de la cirugía (TSH = 42 ± 24 frente a 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs. 3,1 ± 0,9 mg / dl, p = 0,707 (Figura 2). PTH-cre-IDTR ratones DT ratones inyectados con PTH-Cre-IDTR hipoparatiroidismo desarrollado (calcio ionizado en sangre baja, fósforo arterial elevada, y los niveles de PTH inapropiadamente bajos de lo normal). Anteriormente hemos informado de que las células positivas algunos de PTH escapar de la ablación por toxina de la difteria, explicando la medible PTH circulante y la por lo tanto, el fenotipo algo más suave de estos ratones 17. Hipoparatiroidismo en ratones GFP-PTX y PTH-cre-IDTR ratones Se observaron reducciones significativas de Ca ++ en la sangre y los niveles séricos de PTH en PTX-GFP ratones 3 días después de la cirugía, en comparación con los niveles encontrados en los ratones con operación simulada (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 32 ± 22 vs. 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). El fenotipo hipoparatiroidismo se mantuvo estable durante el período de observación de 3 meses (Figura 3A, reimpreso con el permiso del (referencia # 17)). Después de 2 inyecciones de 5 mg / kg DT en 3 días de intervalo, una dosis y régimen optimizado para utilizar la menor cantidad de DT para dar el fenotipo hipoparatiroidismo máxima, el DT inyectado ratones de IDTR PTH-cre mostraron hipocalcemia significativa y la reducción de la PTH en comparación con los ratones de control del vehículo, que persistieron durante el periodo de observación de 90 días (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / L vs 1,26 ± 0,05 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml frente a 572 ± 164 pg / ml, p &lt;0,05) (Figura 3B, reimpreso con el permiso del (referencia # 17)). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; Imágenes representativas de los diferentes localizaciones de la glándulas paratiroides en 54 ratones PTHcre-mTmG bajo microscopio fluorescente disección. Los ratones tenía ya sea dos (A, C, E) o tres (B, D, F) glándulas paratiroides verdes. Glándulas paratiroides La mayoría se encuentran cerca del borde superior (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F cerca del borde inferior (3) o de la glándula tiroides (C (1), D (3), F (1)). En casos raros, algunos se encuentra ectópica (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figura 2: la TSH y T4 Nivel de ratones GFP-PTX. 3 meses después de GFP-PTX, se obtuvo el suero de TSH y T4 measurem<html> entos. GFP-PTX ratones mostraron concentraciones de TSH (42 ± 24 mU / L) las concentraciones de (A) y T4 (3,0 ± 0,6 mg / dl) (B) que no eran diferentes de los ratones de control (TSH = 30 ± 15 mU / L, P = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figura 3: La sangre de Ca ++ y los niveles de PTH en ratones GFP-PTX y DT-ratones inyectados IDTR PTH-cre. Ambos ratones GFP-PTX (A) y DT inyectaron PTH-cre-IDTR ratones (B) exhibió hipocalcemia estable y reducen los niveles de PTH más de 3 meses periodo de observación (N = 6 - 8, *** p &lt;0,001) (re-impreso con la autorización de referencia # 17).en / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los ratones con hipoparatiroidismo adquirido serían útiles para estudiar nuevas terapias farmacológicas para el hipoparatiroidismo. Se demuestran dos procedimientos para crear este tipo de ratones. El ratón GFP-PTX se genera mediante paratiroidectomía quirúrgica guiada por glándulas paratiroides fluorescentes verdes. Un segundo abordaje, no quirúrgico, se basa en la expresión paratiroidea específica del receptor de la toxina diftérica.

Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

El objetivo general de este procedimiento es generar dos modelos murinos de hipoparatiroidismo adquirido que sean fáciles de usar, produzcan un fenotipo estable y dejen intacta la función tiroidea. La principal ventaja de estos dos modelos es que permiten la extirpación precisa de las glándulas paratiroides en ratones, ya sea mediante cirugía guiada por fluorescencia o mediante la expresión específica de la hormona paratiroidea (PTH) del receptor de la toxina diftérica, lo que permite dirigirse selectivamente a las células y destruirlas sin interferir con la glándula tiroides adyacente. Esperamos que nuestros modelos murinos puedan responder preguntas clave en el campo del hipoparatiroidismo.Por ejemplo, ¿pueden las terapias con análogos de la PTH ayudar a mantener niveles normales de calcio sérico sin aumentar la excreción urinaria de calcio? Estos modelos también pueden utilizarse para estudiar otras preguntas clínicas en la hipoparatiroidismo. Por ejemplo, ¿se ve afectada la resistencia ósea por el hipoparatiroidismo y cambia con el tratamiento?Preguntas como estas son difíciles de responder en pacientes, pero estos modelos de ratón pueden utilizarse para abordarlas. Comience por anestesiar ratones de ocho a 10 semanas de edad, que expresan GFP específicamente en las paratiroides según un protocolo aprobado. Coloque al animal en posición supina y asegure una profundidad adecuada de anestesia mediante la ausencia del reflejo de retirada del dedo del pie u otros métodos.Extienda la región ventral del cuello y prepare para la cirugía afeitando el pelaje. Desinfecte la piel afeitada con una compresa antiséptica de povidona yodada, y luego prepare el sitio de incisión utilizando un antiséptico quirúrgico y un enjuague con alcohol según su protocolo aprobado. A continuación, cubra al animal con campos quirúrgicos estériles para reducir la contaminación del sitio quirúrgico.Después de realizar una incisión longitudinal de 2 centímetros con un bisturí quirúrgico, utilice pinzas curvas dentadas para diseccionar la fascia y desplazar las glándulas salivales hacia un lado. Luego, observando el sitio quirúrgico a través de un microscopio de disección, use las puntas de pinzas finas para cortar y separar los músculos paratraqueales y exponer la tráquea. Identifique los lóbulos derecho e izquierdo de la glándula tiroides ubicados junto a la tráquea.Luego cambie la fuente de luz a luz fluorescente y visualice las dos glándulas paratiroides fluorescentes verdes. Los roedores normalmente solo tienen dos glándulas paratiroides. Si no puede identificar las dos glándulas paratiroides junto a la tiroides en cada lado, se debe sospechar de glándulas paratiroides ectópicas y se debe realizar una búsqueda cuidadosa a lo largo de la tráquea.A continuación, utilice fórceps quirúrgicos y tijeras para extraer cuidadosamente las glándulas paratiroides verdes y revise minuciosamente a lo largo de la tráquea para asegurarse de que todo el tejido verde haya sido eliminado. Utilice gasa estéril para lograr la hemostasia. Cierre los músculos paratraqueales con puntos de sutura separados.Cierre la incisión cutánea con puntos de sutura Halstead. Coloque al animal posoperatorio en una jaula aparte sobre una almohadilla térmica para la recuperación de la temperatura corporal. Una vez que el ratón esté despierto, coloque alimento en gránulos y agua con algo de alimento gelatinoso en el piso de la jaula.Después de un período de observación postquirúrgica de dos horas, devuelva el ratón a las instalaciones para animales. Tres días después de la paratiroidectomía, analice 10 microlitros de sangre de la cola para determinar el calcio ionizado utilizando un analizador como el sistema de gases en sangre, analizador de calcio y pH. Si la paratiroidectomía es exitosa, el calcio ionizado en sangre será igual o menor a dos desviaciones estándar por debajo del valor de los ratones control sometidos a cirugía simulada.Comience preparando la solución de toxina diftérica diluyendo el polvo de toxina diftérica con solución salina estéril hasta una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Filtre estérilmente la solución y divídala en alícuotas. Inyecte cinco microgramos por kilogramo de peso corporal de toxina diftérica en ratones de ocho a 10 semanas de edad que expresan receptores de toxina diftérica específicamente en las paratiroides.Tres días después de una segunda inyección de toxina diftérica, analice 10 microlitros de sangre de la cola para determinar el calcio ionizado, como antes. A continuación se muestran imágenes representativas de las diversas ubicaciones de las glándulas paratiroides en ratones que expresan GFP específicamente en la paratiroides. Los ratones tenían ya sea dos o tres glándulas paratiroides verdes.La mayoría de las glándulas paratiroides se ubicaron cerca del borde superior o cerca del borde inferior de la glándula tiroides. En casos raros, algunas glándulas paratiroides se ubicaron de forma ectópica. Una de las ventajas de nuestro modelo de ratón es que la glándula tiroides permanece intacta.Esta figura muestra los niveles de TSH en ratones GFP-PTX tres meses después de la paratiroidectomía. Esta figura muestra las mediciones de T4. Los ratones GFP-PTX presentan concentraciones de TSH y concentraciones de T4 que no difirieron de los ratones control.Esta imagen muestra los niveles sanguíneos de calcio y los niveles de PTH en ratones GFP-PTX. Esta imagen muestra los niveles sanguíneos de calcio y los niveles de PTH en ratones PTHcre-iDTR inyectados con toxina diftérica. Tanto los ratones GFP-PTX como los ratones PTHcre-iDTR inyectados con DT exhibieron hipocalcemia estable y niveles reducidos de PTH durante un período de observación de tres meses.Una vez dominada, la paratiroidectomía guiada por GFP puede realizarse en aproximadamente 20 minutos para todo el procedimiento. Una sola inyección de toxina diftérica no lleva más de un minuto si se realiza correctamente. Tras este procedimiento, estos ratones desarrollan hipoparatiroidismo y pueden utilizarse como un modelo preclínico de enfermedad.Se pueden abordar preguntas como la eficacia de diferentes análogos de la hormona PTH en el tratamiento de la hipoparatiroidismo. No olvide que la toxina diftérica es peligrosa y que los trabajadores deben contar con las inmunizaciones habituales contra la toxina diftérica. Siempre se debe usar equipo de protección personal, como mascarillas y guantes, al realizar estos procedimientos.

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Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación (Video) | JoVE Journal

Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación

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