Dos técnicas para crear ratones hipoparatiroidismo: Una paratiroidectomía utilizando GFP Glándulas y Difteria-mediadas por toxinas paratiroidea Ablación

El objetivo general de este procedimiento es generar dos modelos de ratón de hipoparatiroidismo adquirido que sean fáciles de usar, produzcan un fenotipo estable y dejen intacta la función tiroidea. La principal ventaja de estos dos modelos es que permiten la extirpación precisa de las glándulas paratiroides en ratones, ya sea por cirugía guiada por fluorescencia o por expresión específica de PTH del receptor de la toxina diftérica, lo que permite que las células sean selectivamente dirigidas y destruidas sin interferir con la glándula tiroides vecina. Esperamos que nuestros modelos de ratón sean capaces de responder a preguntas clave en el campo del hipoparatiroidismo.

Por ejemplo, ¿pueden las terapias con análogos de la PTH ayudar a mantener los niveles normales de calcio sérico sin aumentar la excreción urinaria de calcio? Estos modelos también se pueden utilizar para estudiar otras cuestiones clínicas en el hipoparatiroidismo. Por ejemplo, ¿la fuerza ósea se ve afectada por el hipoparatiroidismo y cambia con el tratamiento?

Preguntas como estas son difíciles de responder en los pacientes, pero estos modelos de ratón se pueden utilizar para abordarlas. Comience por anestesiar ratones de ocho a 10 semanas de edad, que expresen GFP específicamente en paratiroides de acuerdo con un protocolo aprobado. Coloque al animal en posición supina y asegure una profundidad adecuada de anestesia mediante la ausencia de un reflejo de retirada de pellizco de los dedos del pie u otros medios.

Extienda la región ventral del cuello y prepárese para la cirugía afeitando el pelaje. Desinfecte la piel afeitada con una almohadilla antiséptica de yodo povidona y luego prepare el sitio de la incisión con un exfoliante quirúrgico y un enjuague con alcohol según su protocolo aprobado. A continuación, cubra al animal con paños quirúrgicos estériles para reducir la contaminación del sitio quirúrgico.

Después de cortar una incisión longitudinal de 2 centímetros con un bisturí quirúrgico, use pinzas curvas dentadas para diseccionar la fascia y empuje las glándulas salivales hacia un lado. Luego, mientras observa el sitio quirúrgico a través de un microscopio de disección, use las puntas de las pinzas afiladas para cortar y separar los músculos paratraqueales y exponer la tráquea. Identifica los lóbulos derecho e izquierdo de la glándula tiroides ubicados junto a la tráquea.

A continuación, cambie la fuente de luz a luz fluorescente y visualice las dos glándulas paratiroides fluorescentes verdes. Por lo general, los roedores solo tienen dos glándulas paratiroides. Si no puede identificar las dos glándulas paratiroides junto a la tiroides a cada lado, se debe sospechar de las glándulas paratiroides ubicadas ectópicamente y se debe realizar una búsqueda cuidadosa de ellas a lo largo de la tráquea.

A continuación, use pinzas quirúrgicas y tijeras para extraer con cuidado las glándulas paratiroides verdes y revise cuidadosamente a lo largo de la tráquea para asegurarse de que se haya eliminado todo el tejido verde. Use gasa estéril para la hemostasia. Cierre los músculos paratraqueales con suturas interrumpidas.

Cierre la incisión cutánea con suturas Halstead. Coloque al animal posquirúrgico en una jaula separada sobre una almohadilla térmica para recuperar la temperatura corporal. Una vez que el ratón esté despierto, coloque comida de pellets y agua con un poco de comida de gelatina en el piso de la jaula.

Después de un período de observación postquirúrgica de dos horas, devuelva el ratón al animalario. Tres días después de la paratiroidectomía, analice 10 microlitros de sangre de cola para detectar calcio ionizado utilizando un analizador como el sistema de gases en sangre, el analizador de calcio y pH. Si la paratiroidectomía es exitosa, el calcio ionizado en la sangre será igual o menos dos desviaciones estándar del de los ratones de control operados simuladamente.

Comience preparando la solución de toxina diftérica diluyendo el polvo de toxina diftérica con solución salina estéril a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Filtre estérilmente la solución y alocución. Inyecte cinco microgramos por kilogramo de toxina diftérica de peso corporal en ratones de ocho a 10 semanas de edad, expresando los receptores de toxina diftérica específicamente en las paratiroides.

Tres días después de una segunda inyección de toxina diftérica, analice 10 microlitros de sangre de cola para detectar calcio ionizado, como antes. Las siguientes son imágenes representativas de las diversas ubicaciones de las glándulas paratiroides en ratones que expresan GFP específicamente en la paratiroides. Los ratones tenían dos o tres glándulas paratiroides verdes.

La mayoría de las glándulas paratiroides estaban localizadas cerca del borde superior o cerca del borde inferior de la glándula tiroides. En casos raros, algunas glándulas paratiroides se localizaron ectópicamente. Una de las ventajas de nuestro modelo de ratón es que la glándula tiroides se mantiene intacta.

Esta figura muestra los niveles de TSH de los ratones GFP-PTX tres meses después de la paratiroidectomía. Esta figura muestra las mediciones de T4. Los ratones GFP-PTX muestran concentraciones de TSH y concentraciones de T4 que no fueron diferentes de las de los ratones control.

Esta imagen muestra los niveles de calcio en sangre y los niveles de PTH en ratones GFP-PTX. Esta imagen muestra los niveles de calcio en sangre y los niveles de PTH en ratones PTHcre-iDTR inyectados con toxina diftérica. Tanto los ratones GFP-PTX como los ratones con PTHcre-iDTR inyectados con DT mostraron hipocalcemia estable y niveles reducidos de PTH durante un período de observación de tres meses.

Una vez dominada, la paratiroidectomía guiada por GFP se puede realizar en unos 20 minutos durante todo el procedimiento. Una sola inyección de toxina diftérica no toma más de un minuto si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, estos ratones desarrollan hipoparatiroidismo y se pueden utilizar como modelo preclínico de la enfermedad.

Se pueden abordar cuestiones como la eficacia de diferentes análogos de la hormona PTH en el tratamiento del hipoparatiroidismo. No olvide que la toxina diftérica es peligrosa y que los trabajadores deben recibir las vacunas habituales contra la toxina diftérica. Siempre se debe usar equipo de protección personal, como mascarillas y guantes, mientras se realizan estos procedimientos.