Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la colocación quirúrgica de células anaplásicas humanas, carcinoma tiroideo o TC en la tiroides con el fin de establecer un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico. Esto se logra primero cultivando y cosechando células TC. Después de preparar al ratón para la cirugía, exponga la tiroides mediante dos incisiones longitudinales sucesivas en el cuello e inyecte las células A TC lentamente en la glándula tiroides derecha.

El paso final es cerrar las incisiones con suturas y permitir que el ratón se recupere. En última instancia, el examen histológico de los especímenes de los tejidos resecados se utiliza para mostrar el crecimiento y la invasión del tumor en una variedad de afecciones. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el trasplante subcutáneo de xenoinjertos, es que el trasplante ortotópico sitúa a las células TC en su nicho biológico y replica de cerca la progresión de la enfermedad y la patología tal y como ocurre en los humanos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como determinar los mecanismos biológicos de la agresividad del cáncer de tiroides. Comience este procedimiento cultivando la línea celular humana A TC TJ 11 T en seis placas de cultivo de pocillos utilizando medios suplementados completos con RPMI 1640 un día antes de la recolección de células cuando las células estén descongeladas en un 70 a 80% de confluentes, 0,01 mililitros de gel principal a cuatro grados Celsius. Coseche las células con tripsina una vez que se hayan vuelto 80 a 90% confluentes una vez que las células se hayan granulado, aspire el medio y vuelva a suspender las células en dos mililitros de medios RPMI 1640 suplementados por cada placa de seis pocillos cosechada.

A continuación, determine la densidad celular mezclando la suspensión celular uno a uno con un tinte azul Triam al 0.4% para determinar la densidad celular utilizando un contador celular automatizado TC 10. Calcule el volumen de la suspensión celular necesario para inyectar 500.000 células por ratón. Asegúrese de que haya células adecuadas disponibles para la implantación calculando el doble del número de implantes planificados.

Transfiera el volumen requerido de suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar a 200 Gs durante cuatro minutos a temperatura ambiente. A continuación, aspire el medio y vuelva a suspender las células a 100 millones de células por mililitro en un medio complementado completo con RPMI 1640.

A continuación, transfiera las células a un tubo de 1,6 mililitros. Agregue un volumen de gel de matri y mezcle suavemente pipeteando lentamente hacia adentro y hacia afuera. Coloque la suspensión de celdas en hielo hasta que sea necesario.

Primero, esterilice la zona quirúrgica, que incluye el endoscopio de disección y el área circundante, limpiando todas las superficies con etanol al 70%. A continuación, prepare la zona de recuperación encendiendo las lámparas de calefacción y colocando almohadillas estériles. Anestesia al ratón y prepáralo para la cirugía afeitando primero la región del cuello del ratón desde la línea de la mandíbula hasta la parte superior del esternón y hacia cada brazo.

A continuación, enrosque el área quirúrgica tres veces alternando cuadrados de gau empapados en clorhexidina y etanol. Luego, una última vez con una gasa empapada en Betadine. También aplique suavemente ungüento para los ojos para evitar que los ojos se sequen.

En este punto, verifique el reflejo del pedal para asegurarse de que el mouse esté adecuadamente sedado. A continuación, coloque el dorso del ratón reclinado sobre una barrera de campo estéril desechable. Debajo del visor de disección, asegure el mouse en su lugar con cinta de tela.

A continuación, frote bien las manos y las uñas y póngase guantes quirúrgicos estériles de forma estéril, abra el paquete quirúrgico y coloque los instrumentos. Finalmente, coloque un paño estéril sobre el ratón, dejando solo expuesto el sitio quirúrgico. Comience haciendo una incisión longitudinal de uno a 1,5 centímetros a lo largo de la línea media de la garganta con un bisturí desechable estéril.

No se desvíe de la línea media, ya que esto aumentaría la posibilidad de cortar o cortar las arterias grandes. Haga una segunda incisión en los músculos de la correa que rodean la tráquea. A continuación, tire del lado derecho del músculo inciso hacia un lado, exponiendo la glándula tiroides derecha.

Pídele a un asistente que te entregue la jeringa. Inyéctelo lentamente en la glándula tiroides derecha con una jeringa de insulina de calibre 31. A continuación, retire suavemente la aguja y suture la capa muscular con material de sutura de monofilamento de nylon de seis oh, utilizando un estilo de sutura interrumpido.

Finalmente, cose la piel de la misma manera después de la operación. Aplique una capa de ungüento antibiótico triple directamente sobre el sitio de la incisión. Permita que el ratón recupere la espalda dorsal recostada bajo una lámpara.

Una vez que el ratón puede alcanzar la decúbito esteral sin ayuda, se puede volver a colocar con otros ratones en su jaula. Revise el sitio de la incisión y la salud general del ratón diariamente durante una semana después de la cirugía. A continuación, revíselo una vez a la semana.

Si en algún momento el ratón muestra signos de deterioro de la salud, se le debe aplicar la eutanasia y recolectar sus tejidos. Una vez que los ratones han alcanzado un punto de tiempo postoperatorio predeterminado, se anestesia con ketamina y xilacina y se perfunde al animal tardíamente con tampón, seguido de fijador, luego se extraen los tejidos y se procesan para la histología. Aquí se muestran la tiroides y la tráquea de un animal control no inyectado, con los folículos de tinción de hematina y eosina que muestran una asociación estrecha pero laxa y tienen una morfología esencialmente redonda.

Por el contrario, los ratones que reciben una inyección ortotópica de 500.000 células TC A exhiben una infiltración significativa de células cancerosas en la tiroides cuatro semanas después de la inyección. La naturaleza de las células invasoras muestra células características en forma de huso y células de tamaño mediano a gigante con citoplasma eosinófilo y núcleos grandes. Debido al pequeño tamaño de la tiroides y al uso de la administración inyectable, pueden surgir resultados no intencionales, como el desarrollo de una masa tumoral fuera de la tiroides, pero que no la abarque.

Esto se debe a la penetración de la aguja a través de la tiroides cuando las células son expulsadas. Ocasionalmente, los ratones que no presentan crecimiento tumoral, tanto macroscópica como histológicamente, se detectan como se muestra aquí. La ausencia de desarrollo tumoral detectable es causada por la expulsión de la suspensión celular desde el lugar de la inyección a los tejidos y cavidades vecinos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar su propio modelo ortotópico para el carcinoma anaplásico de tiroides.

Mediante el acceso quirúrgico a la glándula tiroides y la inyección de células C cultivadas.