In Situ Detección y cuantificación de la célula de las nanopartículas de óxido de Metal usando análisis de microsonda Nuclear

Las nanopartículas se utilizan cada vez más en la industria y la medicina debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas. Sin embargo, persisten las preocupaciones por la salud humana asociadas con la exposición prolongada a nanopartículas. Estos riesgos se pueden cuantificar estudiando el comportamiento de las nanopartículas dentro de las células y las respuestas metabólicas inducidas de las células a las nanopartículas.

Esto se debe, en parte, a la falta de métodos que permitan la detección y cuantificación de nanopartículas internalizadas en una célula sincle. Si bien se pueden utilizar numerosas herramientas analíticas, como la microscopía y la espectrometría de masas, para estimar la absorción celular de nanopartículas, estas solo proporcionan información cualitativa a nivel microscópico. Por el contrario, los métodos in situ basados en la espectroscopia atómica pueden reducir la cantidad de artefactos de imagen que surgen de la preparación de la muestra y pueden producir la observación directa de nanopartículas.

Para aprovechar esto, presentamos un enfoque correlativo que nos permite estudiar nanopartículas ya sea en estado nativo o en lecho de laboratorio con una etiqueta fluorescente. En este trabajo describimos un método basado en la combinación de microscopía de fluorescencia y análisis de microsonda nuclear. Esto proporciona imágenes de la densidad celular, la distribución especial de los elementos químicos y la cantidad de nanopartículas por célula.

A modo de demostración, investigaremos a partir de células expuestas a nanopartículas de dióxido de titanio durante 24 horas utilizando tanto microscopía de fluorescencia como análisis de microsonda nuclear. Para este protocolo, se necesita un portamuestras personalizado hecho con el polímero PEEK. Debe ser adecuado para el cultivo celular y la observación in vitro.

Cubra el soporte con una lámina de policarbonato de dos micras de grosor. La lámina de policarbonato se pega a la placa de PEEK con una fina capa de solución de Formvar. Una vez montado, el portamuestras debe esterilizarse.

Se pueden almacenar varios portamuestras estériles, uno por pocillo, en una placa estéril de doce pocillos hasta que se necesiten para su uso. Las células transfectadas con plásmidos GFP de la fila de la matriz se comprueban mediante microscopía de fluorescencia para asegurar que la transfección se ha producido con éxito y que expresan la proteína fluorescente. Recolecta las células con tripsina e incubarlas durante tres minutos a 37 grados centígrados.

Detenga la acción de la tripsina agregando medio de cultivo fresco. Peletizar las células por centrifugación durante cinco minutos a 1200 revoluciones por minuto a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y añada un volumen adecuado de medio de cultivo fresco.

Contar las células y realizar una dilución con medio de cultivo completo fresco y termostatizado para obtener una suspensión celular de 500 células por microlitro. Coloque una gota de 40 microlitros en el centro de la lámina de policarbonato. Coloque con cuidado la muestra en la incubadora de celdas durante dos horas.

Agregue suavemente dos mililitros de medio de cultivo fresco y déjelos durante 24 horas. Se diseñaron, sintetizaron e injertaron nanopartículas fluorescentes de óxido de titanio dimodificado con fluoróforos de uso común para detectar, rastrear y localizar nanopartículas in vitro. Para este paso, ya se debería haber preparado una suspensión de nanopartículas de dióxido de titanio en agua ultrapura con una concentración de un miligramo por mililitro.

Disperse las nanopartículas mediante el uso de pulsos de sonicación intensos de un minuto de duración a temperatura ambiente. Diluir las nanopartículas en un medio de cultivo adecuado para obtener una suspensión de exposición de cuatro microgramos por centímetro cuadrado. Cambie el medio de cultivo celular anterior por este nuevo medio que contiene nanopartículas y mézclelo suavemente para lograr una distribución homogénea de nanopartículas.

Prepare un conjunto de celdas de control de la misma manera sin la adición de nanopartículas de dióxido de titanio. Incubar las poblaciones celulares durante 24 horas. Usando paraformaldehído, estas muestras pueden fijarse y procesarse para obtener imágenes in situ y de una sola célula utilizando microscopía de fluorescencia.

Sin embargo, la fijación física criogénica preserva la ultraestructura y la integridad bioquímica de la célula. La fijación por congelación por inmersión detiene rápidamente la actividad celular en milisegundos y evita el uso de compuestos fijadores. Para fijar criogénicamente las células, realizamos lo siguiente.

Prepare una placa de transferencia de aluminio enfriándola en nitrógeno líquido. Guarde la placa en una caja llena de nitrógeno líquido, manteniendo la superficie de la placa por encima del líquido en el vapor de nitrógeno frío. Enfríe una cantidad suficiente de 2-metilbutano a 150 grados centígrados.

Prepara un Halcón de 50 mililitros con medio de cultivo y dos Halcones con agua ultrapura. Asegúrese de que haya papel absorbente cerca para secar la muestra antes de congelarla. Enjuague las células una vez en el medio de cultivo y luego dos veces más en agua estéril ultrapura para eliminar el exceso de sales que quedan en el medio de cultivo.

Seque rápidamente la muestra sobre el papel absorbente. Congele las celdas en el 2-metilbutano enfriado durante 30 segundos y colóquelas en la placa de transferencia de aluminio enfriada. Es fundamental que la caja se mantenga cerrada tanto como sea posible para evitar que el vapor de agua se condense en la superficie de la placa fría.

Después de congelar todas las muestras, la liofilización se realiza mediante el siguiente método para sublimar el agua. Primero, realice una desecación primaria durante 12 a 24 horas a baja presión y baja temperatura. A continuación, manteniendo la presión baja, realice una fase de desecación secundaria durante al menos 24 horas con la temperatura de la placa aumentada a 40 grados centígrados.

Después de la criofijación, las muestras pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días en condiciones estériles y secas, protegidas del polvo y la humedad. El análisis de microsondas nucleares se llevó a cabo en las instalaciones de Ifera en Burdeos, Francia. Un acelerador de partículas singletron de 3,5 megavoltios emite un haz de iones ligeros en el rango de energía de megaelectronvoltios.

Las imágenes de elementos químicos se llevaron a cabo en la línea de luz de la microsonda utilizando técnicas analíticas complementarias de haz de iones. Las técnicas utilizadas a través de un micro-PIXE, emisión de rayos X inducida por partículas, STIM, microscopía iónica de transmisión de barrido y micro-RBS, espectrometría de retrodispersión de Rutherford. Las muestras se colocan dentro de la cámara de análisis y se irradian al vacío con diferentes partículas para realizar diferentes análisis de haz de iones.

STIM se utiliza para registrar mapas de densidad aérea de células basados en las partículas de energía sueltas que pasan a través de regiones de células con diferentes densidades. Los análisis Micro-PIXE y micro-RBS proporcionan la distribución espacial y la cuantificación de elementos químicos a nivel de una sola célula. Un microhaz de protones de 1,5 megaelectrones-voltios se enfoca hasta un diámetro de aproximadamente 1 micrómetro y se escanea a través de las células de interés, identificadas por STIM.

Los rayos X emitidos por los átomos presentes en la muestra, que van desde el sodio hasta el titanio, permiten determinar las concentraciones elementales. Los protones retrodispersados se recogen para medir el número total de partículas entrantes necesarias para normalizar las intensidades de los rayos X. Es fundamental contar con estándares de calibración certificados para la cuantificación de concentraciones elementales con el fin de calibrar la respuesta del detector de rayos X.

Con el fin de analizar los datos del haz de iones, desarrollamos un nuevo complemento para ImageJ. En primer lugar, se calcularon los mapas de densidad STIM. El contraste en las imágenes de microscopía de hierro de transmisión de barrido se debe a las diferencias locales de densidad y permite la detección de estructuras celulares como el núcleo y el citoplasma.

Se pueden procesar varios mapas a la vez. Cada mapa corresponde al medio que transmite la energía de las partículas entrantes. El segundo paso en el análisis de datos consiste en calcular los espectros de las células individuales.

El análisis de emisión de rayos X inducido por partículas proporciona tanto la composición química de la muestra como los mapas elementales de los elementos químicos. Los mapas de elementos químicos se calculan después de clasificar los fotones de acuerdo con la posición del haz en el momento del registro y seleccionar una ventana de energía centrada alrededor de un elemento específico. Los mapas suelen representar el número de eventos detectados en la posición del haz y contienen datos cuantitativos.

Se calcula una pila de mapas químicos, uno para cada elemento seleccionado. Las regiones de interés para cada célula se encuentran utilizando los datos de PIXE para el fósforo. Los espectros correspondientes a cada célula entera se calculan sumando los espectros individuales en la región de interés de cada célula.

A partir de aquí, se pueden extraer datos cuantitativos sobre las abundancias químicas en cada célula utilizando el software de análisis PIXE e IBS dedicado. Aquí mostramos imágenes de fluorescencia de las células después de la fijación con paraformaldehído. La fila superior muestra las células que no han sido expuestas a nanopartículas de dióxido de titanio, mientras que la fila inferior sí lo ha estado.

El canal azul muestra el núcleo celular, el canal verde muestra las mitocondrias y el canal rojo muestra el titanio. Se puede ver claramente que no hay dióxido de titanio en los controles. Desde el canal fusionado de la derecha, se puede ver que las nanopartículas se encuentran exclusivamente en el citoplasma y están excluidas de las mitocondrias.

Lo que le falta a este método, sin embargo, es información cuantitativa sobre la concentración de nanopartículas. El análisis de microsondas nucleares puede esperar proporcionar esto. Todas estas imágenes han sido tomadas utilizando diversas técnicas de análisis de microsondas.

De nuevo, la fila superior muestra las celdas de control y la fila inferior muestra las celdas que contienen nanopartículas de titanio. La imagen de la izquierda muestra las mediciones STIM de la densidad de las células fijadas criogénicamente. Los siguientes tres paneles muestran la abundancia de potasio, fósforo y titanio presentes en las células obtenidas por PIXE.

Una vez más, no hay titanio visible en los controles ni en los núcleos celulares. Con el fin de cuantificar, célula por célula, la absorción de titanio, definimos regiones de interés en función de los límites de las células que se muestran en el panel de la derecha y medimos las abundancias elementales en estas regiones. A partir de estas mediciones de PIXE, hemos trazado la distribución de las abundancias elementales a nivel de una sola célula para el control y las poblaciones expuestas.

La población de control se representa en blanco y la población expuesta se representa en amarillo. El contenido medio de titanio presente aquí es bastante bajo en comparación con la dosis de exposición de cuatro microgramos por centímetro cuadrado. El rango de absorción de titanio muestra una gran variación en toda la población, desde 0,2 microgramos por centímetro cuadrado hasta 1,8 microgramos por centímetro cuadrado.

También observamos un aumento de iones intracelulares libres, como el potasio y el calcio, en las muestras expuestas a nanopartículas, lo que sugiere una alteración de la homeostasis celular inducida por la presencia de nanopartículas de dióxido de titanio. El análisis de microsondas nucleares puede proporcionar información útil a nivel subcelular y proporciona una cuantificación de los elementos químicos que componen una muestra biológica. Estas técnicas presentan muchas ventajas.

Uno, en la preparación de muestras que no requieren fijación química. Dos, la posibilidad de estudiar áreas más grandes con la capacidad de enfocarse en regiones adicionales de interés. Tres, la cuantificación de elementos químicos con una sensibilidad de unos pocos microgramos por gramo.

Y cuatro, la identificación de los compartimentos celulares como el núcleo, el nucléolo y el citoplasma. La determinación precisa de estos, cuando se estudia la internalización de nanopartículas en células individuales, es esencial para la toxicología cuantitativa de nanopartículas. Como se muestra en los casos estudiados aquí, la capacidad de observar y cuantificar nanopartículas dentro de células individuales nos permite comprender mejor la acumulación de valor de los elementos químicos endógenos y exógenos, como las nanopartículas de óxido metálico.

Este protocolo pone de manifiesto la idoneidad del análisis de microsondas nucleares para futuros estudios de la interacción de nanopartículas con células vivas. El enfoque cuantitativo proporciona información sobre el impacto de estas nanopartículas en términos de detección, identificación, localización y cuantificación, y a nivel de una sola célula tanto para nanopartículas nativas como para nanopartículas modificadas químicamente.