Un sistema de microfluidos con modelar superficie de Investigación de la burbuja de cavitación (s) Interacción -Cell y los Bioefectos resultante en el nivel de celda única

El objetivo general de este procedimiento experimental es investigar los efectos biológicos inducidos por la cavitación en el confinamiento microfluídico utilizando patrones de superficie para controlar con precisión la generación de burbujas en tándem y la ubicación y forma de las células objetivo individuales. Este sistema microfluídico permite la experimentación de este tránsito, cavitación, burbujas y células que son relevantes para la publicación terapéutica y sonora y el funcionamiento del sonido. La principal ventaja de esta técnica proviene de la mejora de la precisión del patrón de superficie.

Nos permite estudiar los efectos biológicos de las células individuales y es una alta carga de flujo a partir de una interacción confiable entre burbujas. La demostración visual de los procedimientos es fundamental, ya que el patrón de la superficie y la preparación de las celdas en los pasos del chip son complejos y requieren varias técnicas y puntas. Realice todos los procedimientos de microfabricación en una sala limpia mientras usa un traje de sala limpia.

Diseñe el área de cada punto de oro dentro de 25 a 30 micras cuadradas, de modo que sea lo suficientemente grande como para absorber la energía del láser para la generación de burbujas, pero lo suficientemente pequeño como para evitar que las células individuales se adhieran a él. Limpie el portaobjetos de vidrio en una campana química de acuerdo con el protocolo de texto, luego proceda a la campana de recubrimiento giratorio. Programe el codificador de giro para acelerar a 1000 RPM durante dos segundos y mantener esa velocidad durante cinco segundos, luego haga que aumente a 3000 RPM durante tres segundos y mantenga esa velocidad durante 30 segundos.

A continuación, asegure la corredera de vidrio al codificador de espín usando la aspiradora. Luego, cubra la corredera con P20 e inicie el ciclo de centrifugado. A continuación, aplique la fotorresistencia negativa NFR utilizando el mismo ciclo.

Ahora, hornee el portaobjetos en un plato caliente a 95 grados centígrados durante 60 segundos. Una vez enfriado a temperatura ambiente, realice la fotolitografía. Monte la máscara cromada en el alineador de máscaras y asegúrese de que el lado del patrón esté hacia abajo, hacia la corredera.

A continuación, configure la receta de fotolitografía en modo de exposición dura con nueve segundos de exposición a los rayos UV y alinee el sustrato de vidrio con la mascarilla. Después de la exposición a los rayos UV, hornee el portaobjetos a 95 grados centígrados durante un minuto y luego déjelo enfriar como antes. Para desarrollar el patrón en el portaobjetos, colóquelo en una solución reveladora durante 60 segundos, luego lave el portaobjetos con agua destilada y séquelo con gas nitrógeno.

Después de confirmar el patrón mediante inspección microscópica, hornee el portaobjetos a 120 grados centígrados durante cinco minutos y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Ahora, limpie la diapositiva con plasma en la máquina de grabado de iones reactivos durante 90 segundos a 500 tor y 100 vatios. Con un evaporador de haz E, pegue la muestra con cinta adhesiva al soporte de la placa.

Programe la máquina para depositar una capa de titanio de 5 nanómetros, seguida de una capa de oro de 15 nanómetros. Una vez que se complete esa posición, ventile la máquina. A continuación, remoje el portaobjetos durante la noche en un vaso de precipitados con disolvente removedor de fotorresistencia para eliminar el oro que descansa sobre la resina NFR.

Al día siguiente, lave el portaobjetos con acetona, seguido de IPA y luego séquelo con nitrógeno. Enjuague el portaobjetos con agua desionizada y séquelo nuevamente con nitrógeno. Ahora, calienta el portaobjetos a 115 grados centígrados durante cinco minutos.

Luego, limpie el portaobjetos con patrón de punto dorado usando un asher de plasma de oxígeno a 100 vatios durante 90 segundos. Establezca el área de cada isla codificada con fibronectina entre 700 y 900 micras cuadradas para facilitar la propagación adecuada de las células hela en una región cuadrada y minimizar las posibilidades de que se agreguen varias células en la isla. La fabricación es muy parecida a la del patrón de oro.

Gire el código de la diapositiva como antes usando fotorresistencia positiva S18 y hornee en la codificación a 115 grados centígrados. A continuación, realiza la fotolitografía, alineando las marcas de la mascarilla con las del sustrato. Verifique el patrón en la parte central para confirmar el ángulo correcto y ajuste la distancia de separación desde los puntos dorados hasta el patrón H.

Ejecute la exposición UV durante nueve segundos sin horneado posterior. La siguiente diferencia es que el paso de desarrollo solo toma 45 segundos. Para el grabado de iones reactivos, ajuste los parímetros a 500 o 100 vatios y 90 segundos.

A continuación, aplique una gota de solución pasivante de clavija PLLG sobre un trozo de película de parafina y coloque la solución en el lado del patrón de la guía. Evite atrapar burbujas. Después de 45 minutos, retire la diapositiva de la película.

Enjuague el portaobjetos con agua desionizada y luego séquelo con nitrógeno. A continuación, remoje el portaobjetos consecutivamente en el removedor fotorresistente 1165. Luego, 50 por ciento 1165 en agua desionizada.

Luego, solo agua desionizada. Durante cada baño, agite la solución en un baño de ultrasonido durante 90 segundos. Ahora, seque el portaobjetos en una placa caliente, luego séllelo en un desecador y guárdelo a 4 grados centígrados.

Ensamble las diapositivas en un chip de microcanal como se describe en el protocolo de texto. Preste mucha atención para proteger el área estampada del sustrato de vidrio con la pequeña losa de PDMS antes de usar el grabado iónico reactivo para quitar la clavija PLLG del área periférica. Recupere el vidrio estampado de la máquina RIE y retire la pequeña losa de PDMS.

Después de tratar el PDMS de microcanales con una dosis reducida de plasma de oxígeno, alinéelo con el sustrato de vidrio estampado bajo un estereoscopio. Ponga el microcanal PDMS y el sustrato de vidrio estampado en contacto conforme. Ahora, proceda a usar el chip.

Primero, cebe el chip haciendo fluir PBS por el microcanal durante 30 minutos a un microlitro por minuto. A continuación, infunda el chip con la solución de fibronectina durante 45 minutos con el mismo flujo. Mientras espera, prepare las células a cinco millones de células por mililitro.

El estado saludable y la alta confluencia son fundamentales para este procedimiento. Más tarde, reemplace la solución que fluye a través del chip con PBS y aumente el caudal a diez microlitros por minuto. Deje que el PBS fluya durante cinco minutos.

A continuación, inyecte las células preparadas en el chip con una jeringa. Cuando una gota haya salido del tubo, detenga la inyección y sujete la salida. Luego, coloque el chip en una incubadora durante 30 minutos.

Posteriormente, suelte la salida y enjuague el chip con medio de cultivo celular a diez microlitros por minuto durante cinco minutos. Después de cinco minutos, reduzca el flujo a 0,75 microlitros por minuto y transfiera el chip y la bomba a una incubadora durante dos horas. Después de dos horas, proceda con la generación de burbujas en tándem viendo el chip bajo un microscopio invertido con dos láseres NDI pulsados en controles de tiempo dirigidos al patrón de punto dorado y con una cámara de alta velocidad lista para capturar los resultados.

Para burbujas de 50 micras, establezca el retraso entre los dos láseres en 2,5 microsegundos y ajuste su potencia a diez microjulios. A continuación, sincroniza la grabación de la cámara de alta velocidad con los láseres y realiza grabaciones a dos millones de fotogramas por segundo con exposiciones de 200 nanosegundos. Por lo tanto, se registra la dinámica de la expansión de la burbuja, la interacción del colapso entre burbujas y la formación de chorros.

Las interacciones burbuja-burbuja y una variedad de bioefectos inducidos por la cavitación se estudiaron a nivel de una sola célula utilizando la técnica descrita, como las interacciones transitorias de las burbujas en tándem con la formación del chorro, la visualización del campo de flujo resultante y el cálculo de la velocidad del chorro. El flujo de chorro direccional alrededor de la burbuja en tándem es de unos diez metros por segundo, tiene unas diez micras de ancho y, por lo tanto, es capaz de producir un gradiente de estrés puro e impulsivo y localizado en las células objetivo cercanas. También se estudió la deformación de la membrana celular inducida por burbujas en tándem.

La deformación y recuperación de la membrana se destacan por el desplazamiento de perlas funcionalizadas unidas al borde delantero de la membrana celular. A partir de las coordenadas de una tríada de cuentas adyacentes, se calculó la deformación del área local. Este esquema muestra el cambio de área máximo en diferentes ubicaciones de la superficie de la celda.

El borde de ataque se estira principalmente, mientras que el borde de salida o los lados laterales de la célula se comprimen, lo que indica heterogeneidad y deformación de la célula producida por el flujo de inyección inducido por burbujas en tándem. La variación temporal de la deformación del área en el borde de ataque de la célula se compone de unas pocas oscilaciones rápidas seguidas de un estiramiento grande y sostenido durante unos 100 microsegundos, y una recuperación gradual posterior en una escala de tiempo de varios milisegundos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer una interacción burbuja-burbuja controlable para estudiar los efectos biológicos de células individuales con forma y ubicación controladas a partir de patrones de superficie.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como el adelgazamiento del citoesqueleto y las imágenes conyugales para estudiar el reordenamiento del citoesqueleto celular del tratamiento con burbujas en tándem. Después de su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la ultrasonido subpético exploren los efectos biológicos inducidos por la captación a nivel de una sola célula. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una buena confluencia celular y condiciones para el éxito durante el patrón celular.

No olvide que trabajar con productos químicos y láseres para salas limpias puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas láser al realizar este procedimiento.