Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

El objetivo principal del método presentado en este artículo de video es generar rápidamente patrones celulares definidos espacialmente para facilitar el análisis in situ espaciotemporal de las interacciones entre células. La estrategia presentada aprovecha la tecnología de la sonda microfluídica. La cabeza de la sonda microfabricada localiza volúmenes en nanolitros de productos bioquímicos sobre sustratos biológicos para crear patrones en monocapas celulares.

La principal ventaja de una técnica de patrones basada en MFP es que es casi instantánea, gracias a la lisis local, lo que permite la modificación en tiempo real de los patrones que se generan. Tuvimos la idea de este método cuando notamos que otros métodos para generar patrones celulares requieren protocolos largos y de múltiples pasos antes de poder observar realmente el éxito de los patrones celulares. Para realizar experimentos estables con un confinamiento de flujo hidrodinámico sobre una superficie celular, es necesario optimizar los parámetros del MFP.

Para este propósito, la demostración visual es fundamental. Aditya Kashyap y Julien Cors demostrarán este procedimiento. Los módulos operativos de la plataforma comprenden jeringas motorizadas, etapas motorizadas y un controlador.

El MFP está conectado a una etapa Z motorizada para controlar la distancia de separación entre la punta y el sustrato, y el portasustrato está unido a las etapas motorizadas X e Y que constituyen el sistema de escaneo. La punta del MFP tiene vías fluidicas para conectarse a la estación de bombeo, orificios de montaje para fijar la punta a la etapa Z y canales que salen por el ápice pulido. El ápice se coloca coplanario con el sustrato de cultivo celular.

Para preparar la estación de bombeo y el equipo de manejo de fluidos, limpie las jeringas y los émbolos de jeringa mediante sonicación y una solución de lejía al 0,5 % en agua ultrapura antes y después de los experimentos con células vivas. Enjuáguelos cuidadosamente con agua. Llene las jeringas con agua sumergiendo completamente sus puntas en un baño de agua y aspirando mediante el émbolo.

Evacúe el líquido mientras se encuentra en el baño de agua, con el eje de la jeringa en contacto con el sello en la salida de la jeringa. Continúe aspirando y purgando hasta que no se observen burbujas de aire en las columnas de la jeringa. Conecte las jeringas llenas a las bombas de jeringa utilizando conectores de bloqueo inferior.

Utilice la válvula de conmutación montada en las bombas para dirigir el líquido desde la jeringa hacia una de las dos capilares que conducen ya sea a la cabeza MFP o a los depósitos de líquido. Purifique ambas capilares con agua procedente de las jeringas a un caudal de aproximadamente 10 a 50 microlitros por minuto, según el tamaño de la jeringa, hasta que queden aproximadamente 10 microlitros de agua en las jeringas. Limpie la cabeza MFP mediante sonicación utilizando detergente para material de vidrio para una limpieza estándar, o lejía al 0,5 % para una limpieza rigurosa, durante cinco minutos.

Limpie los canales con agua sumergiendo el ápice en agua y aplicando un vacío a los orificios. Inspeccione los canales bajo un microscopio estereoscópico en busca de posibles obstrucciones y repita el paso anterior, si es necesario. A continuación, monte la pieza limpia en el soporte de cabeza y enrosque el conector en la cabeza.

Inserte los capilares purgados en un adaptador de conector microfluídico adecuado que se conecte con los orificios del canal en la cabeza. Sujete el soporte de la cabeza al escenario Z, que se utiliza para controlar la distancia del espacio entre la cabeza y la monocapa celular, antes de realizar la calibración final según se describe en el protocolo escrito. Obtenga una distancia de espacio cero aproximada acercando la cabeza MFP sobre una cámara portaobjetos sin células y descendiendo lentamente en pasos de cinco micrómetros.

Al entrar en contacto la sonda con el sustrato, se deberían observar los anillos de Newton. Esta es una estimación aproximada. Una posición precisa se obtendrá después de ajustar la coplanaridad del ápice de la sonda con el sustrato.

Una vez formados, asegúrese de que los anillos de Newton sean simétricos. Para garantizar la coplanaridad del ápice de la sonda, ajuste la inclinación de la cabeza utilizando un goniómetro en la interfaz entre la cabeza y la etapa Z. Mueva la cabeza de la MFP 20 micrones lejos del sustrato y ajuste la inclinación utilizando el goniómetro.

Repita el descenso, el ajuste a cero y el ajuste de inclinación hasta que los anillos de Newton sean simétricos al hacer contacto. Con la inclinación ajustada, establezca la posición Z, que produce anillos de Newton simétricos, en cero. A continuación, prepare el líquido de procesamiento para el canal de inyección interno y la solución tampón de extracción necesaria para la inyección externa, tal como se describe en el protocolo escrito.

Utilizando la línea de drenaje conectada a las bombas de jeringa, purgue el agua restante y aspire las soluciones desgasificadas hacia las jeringas de inyección a 40 microlitros por minuto hasta que las jeringas estén llenas. Esto asegura el llenado libre de burbujas en las jeringas, conectores y capilares. Para preparar las monocapas celulares en portaobjetos con cámara, expanda las células en matraces tipo T utilizando protocolos estándar de cultivo celular.

Al alcanzar la confluencia celular en los frascos de cultivo, realizar una tripsinización y recolectar las células. Sembrar 0,2 millones de células por centímetro cuadrado en cada una de las cámaras de las laminillas para el patrón. Cultivar las células durante 48 horas utilizando las células en una de las cámaras como control del crecimiento y viabilidad celular.

Al alcanzar la confluencia celular en las cámaras portaobjeto, incubar las células durante 45 minutos con 500 microlitros de solución de colorante marcador de células a una concentración de 10 micromolar preparada en medio sin suero. Esto se realiza para la visualización celular durante el trazado de patrones. Lavar las células marcadas con PBS mediante lavado suave de cada cámara utilizando una pipeta.

Posteriormente, cultive las células en medio suplementado con suero para los experimentos de patrón. La confinamiento hidrodinámico por flujo localiza los líquidos mediante la inyección y aspiración simultáneas de un líquido de procesamiento. En el confinamiento jerárquico, se confinan múltiples líquidos de procesamiento, siendo el HFC externo el que protege la muestra del HFC de procesamiento interno.

Mueva la MFP sobre la monocapa celular hasta una distancia de separación de 50 micrones desde la lámina de vidrio. Esta distancia de separación garantiza el contacto de la HFC jerárquica y también tiene en cuenta la variación de la superficie y del grosor de la monocapa. Inyecte hidróxido de sodio a seis u ocho microlitros por minuto a través de I-dos.

Evalúe otros caudales utilizando las reglas de flujo descritas en el protocolo del texto. Module el tamaño del HFC interno cambiando la relación de los caudales de inyección QI-dos y QI-uno mediante las jeringas de inyección. Por ejemplo, utilice un QI-uno entre 1,3 microlitros por minuto y cuatro microlitros por minuto, manteniendo el QI-dos fijo en ocho microlitros por minuto, para obtener una huella de hidróxido de sodio de entre 150 y 300 células.

Injecte medio completo desde las aberturas más externas de la cabeza MFP a un caudal de 20 microlitros por minuto para compensar la evaporación del medio y la aspiración durante el funcionamiento del hHFC. Para trazar las monocapas celulares, configure el software de la platina para escanear la cabeza de la sonda sobre la monocapa celular siguiendo patrones definidos por el usuario a una velocidad de escaneo de 10 micrones por segundo y una distancia de separación de 50 micrones. Con el hHFC anidado en funcionamiento y en contacto con la monocapa, escanee el MFP siguiendo la trayectoria del patrón deseado para lograr la eliminación celular en patrón.

Para un cultivo conjunto tras la eliminación del primer tipo de células, siembre una línea celular diferente para llenar los espacios, como antes. Prepare la estación de muestreo para el análisis posterior del lisado. Aquí se muestra un ejemplo de una estación de muestreo, que comprende un portador de PCR de ocho franjas impreso en tres dimensiones.

Limpie el porta-tubos con etanol al 70 % u otros descontaminantes de superficie, según el grado de rigurosidad deseado para la aplicación. Utilice un clip magnético en el porta-tubos para fijarlo al porta-sustrato. Después de preparar la estación de muestreo, coloque la cabeza del MFP a 100 micrómetros de la monocapa.

Comience a operar el hHFC con una solución de hidróxido de sodio 50 milimolar como líquido de procesamiento para el canal de inyección interno con un caudal de un microlitro por minuto para QI-uno, seis microlitros por minuto para QI-dos, menos siete microlitros por minuto para QA-uno y menos 17,5 microlitros por minuto para QA-dos. Una vez que el confinamiento del flujo se haya estabilizado, baje la cabeza de la sonda hasta una distancia de separación de 50 micrones para realizar la lisis local basada en hidróxido de sodio en la subpoblación elegida de células con el hHFC. Una vez completada la lisis de la subpoblación, dirija la cabeza hacia los tubos en la estación de muestreo.

Expulse el lisado recolectado directamente en los tubos de PCR. Después de procesar el lisado, como se describe en el protocolo escrito, cargue el lisado en un flujo de trabajo estándar de qPCR según lo establecido por el proveedor del instrumento. Al controlar la relación de los líquidos de inyección en el HFC jerárquico, se modula el tamaño de la huella en contacto con la superficie celular.

Los caudales se seleccionaron de manera que el efecto químico, y no el esfuerzo cortante, fuera el mecanismo dominante para la lisis celular. Esto se corroboró mediante la determinación del esfuerzo cortante utilizando dinámica de fluidos computacional. Aquí se muestra la generación de una cuadrícula de islas celulares mediante programación de trayectoria de escaneo con el MFP.

La modulación del tamaño de la huella mediante la relación del líquido de inyección permite controlar la resolución de la eliminación de células. Este método puede utilizarse para el cultivo secuencial de múltiples poblaciones celulares, generando así patrones complejos de interacciones célula a célula. El uso de hidróxido de sodio como líquido de procesamiento hace que el lisado sea compatible con el análisis basado en PCR de las células.

Aquí, el contenido de ADN se cuantificó a partir de cinco y una huella dactilar, lisados utilizando el método descrito. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en células en menos de 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que los canales y las capilares estén libres de burbujas de aire, ya que esto podría afectar negativamente la HFC.

No olvide que trabajar con hidróxido de sodio, una solución química corrosiva, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad y batas de laboratorio al realizar este procedimiento. Tras seguir este procedimiento, podemos analizar localmente las células mediante inmunomarcado o secuenciación de ADN-RNA mediante lisis mediada por MFP para responder preguntas adicionales, como qué proteínas se sobreexpresan debido al confinamiento geométrico de las células. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología molecular exploren la señalización intra- y extracelular durante la generación y degeneración de tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar patrones sustractivos en monocapas celulares configuradas en MFP para procesamiento local y crear geometrías complejas de cultivos celulares mixtos.