Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

El objetivo principal del método presentado en este artículo de video es generar rápidamente patrones celulares definidos espacialmente para facilitar el análisis espacio-temporal in situ de las interacciones célula a célula. La estrategia presentada aprovecha la tecnología de sonda microfluídica. El cabezal de sonda microfabricado localiza volúmenes de nanolitros de bioquímicos en sustratos biológicos para modelar monocapas celulares.

La principal ventaja de una técnica de modelado basada en MFP es que es casi instantánea, debido a la lisis local, lo que permite la modificación en tiempo real de los patrones que se van a generar. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que otros métodos para generar patrones celulares requieren protocolos largos y de varios pasos antes de ver realmente el éxito de los patrones celulares. Para realizar experimentos estables con un confinamiento de flujo hidrodinámico en la superficie de una celda, es necesario optimizar los parámetros de la impresora multifunción.

Para este propósito, la demostración visual es fundamental. Aditya Kashyap y Julien Cors harán una demostración de este procedimiento. Los módulos operativos de la plataforma comprenden jeringas motorizadas, etapas motorizadas y un controlador.

La impresora multifunción está conectada a una etapa Z motorizada para controlar la distancia entre el cabezal y el sustrato, y el soporte de sustrato está conectado a las etapas motorizadas X e Y que constituyen el sistema de escaneo. El cabezal MFP tiene vías fluídicas para conectarse a la estación de bombeo, orificios de montaje para montar el cabezal en la etapa Z y canales que salen del ápice pulido. El ápice se coloca coplanar con respecto al sustrato del cultivo celular.

Para preparar la estación de bombeo y el aparato de tratamiento de fluidos, limpie las jeringas y los émbolos de las jeringas mediante sonicación y solución de lejía al 0,5% en agua ultrapura antes y después de los experimentos con células vivas. Enjuágalos bien con agua. Llene las jeringas con agua sumergiendo completamente sus puntas en un baño de agua y aspirando con el émbolo.

Purgue el líquido mientras está dentro del baño de agua con el eje de la jeringa en contacto con el sello en la salida de la jeringa. Continúe aspirando y purgando hasta que no se vean burbujas de aire en las columnas de la jeringa. Conecte las jeringas llenas a las bombas de jeringa mediante conectores de bloqueo inferior.

Utilice la válvula de interruptor montada en las bombas para dirigir el líquido desde la jeringa a uno de los dos capilares que conducen a la cabeza de la impresora multifunción o a los depósitos de líquido. Purgue ambos capilares con agua de las jeringas a un caudal de aproximadamente 10 a 50 microlitros por minuto, dependiendo del tamaño de la jeringa, hasta que queden aproximadamente 10 microlitros de agua en las jeringas. Limpie el cabezal de la impresora multifunción por sonicación con detergente para cristalería para una limpieza estándar, o lejía al 0,5 % para una limpieza rigurosa, durante cinco minutos.

Purgue los canales con agua sumergiendo el ápice en agua y aplicando un vacío a las vías. Inspeccione los canales bajo un microscopio estereoscópico en busca de posibles obstrucciones y repita el paso anterior, si es necesario. A continuación, monte la cabeza limpia en el soporte de la cabeza y atornille el conector en la cabeza.

Inserte los capilares purgados en un adaptador de conector microfluídico apropiado que interactúe con las vías de canal en la cabeza. Atornille el soporte del cabezal a la etapa Z, que se utiliza para controlar la distancia del espacio entre el cabezal y la monocapa de la celda, antes de realizar la calibración del punto final como se describe en el protocolo de texto. Obtenga una distancia bruta de espacio cero llevando el cabezal de la impresora multifunción sobre un portaobjetos de cámara sin células y descendiendo lentamente en pasos de cinco micras.

Al entrar en contacto de la sonda con el sustrato, se deben observar los anillos de Newton. Esta es una estimación cruda. Se debe obtener una posición precisa después de ajustar la coplanaridad del ápice de la sonda al sustrato.

Cuando se forme, asegúrese de que los anillos de Newton sean simétricos. Para garantizar la coplanaridad del ápice de la sonda, ajuste la inclinación de la cabeza con un goniómetro en la interfaz de la cabeza y la etapa Z. Mueva el cabezal de la impresora multifunción a 20 micras del sustrato y ajuste la inclinación con el goniómetro.

Repita el ajuste de descenso, puesta a cero e inclinación hasta que los anillos de Newton sean simétricos al contacto. Con la inclinación ajustada, establezca la posición Z, que produce anillos de Newton simétricos, en cero. A continuación, prepare el líquido de procesamiento para el canal de inyección interno y la solución tampón de extracción necesaria para la inyección externa, como se describe en el protocolo de texto.

Usando la línea de drenaje, conéctese a las bombas de jeringa, purgue el agua restante y aspire las soluciones desgasificadas en las jeringas de inyección a 40 microlitros por minuto hasta que las jeringas estén llenas. Esto garantiza un llenado sin burbujas de las jeringas, los conectores y los capilares. Para preparar las monocapas celulares en portaobjetos de cámara, gaste las células en matraces en T utilizando protocolos estándar de cultivo celular.

Al llegar a la confluencia celular en los matraces de cultivo, tripsinizar y recolectar células. Siembre 0,2 millones de células por centímetro cuadrado en cada uno de los portaobjetos de dos cámaras para crear patrones. Cultive las células durante 48 horas utilizando las células en una de las cámaras como control del crecimiento y la viabilidad celular.

Al llegar a la confluencia celular en los portaobjetos de la cámara, incubar las células durante 45 minutos con 500 microlitros de solución de colorante rastreador de células a una concentración de 10 micromolares preparada en medio libre de suero. Esto se hace para la visualización de celdas durante la creación de patrones. Lave las células marcadas con PBS enjuagando suavemente cada cámara con una pipeta.

Posteriormente, cultive las células en un medio suplementado con suero para los experimentos de modelado. El confinamiento de flujo hidrodinámico localiza líquidos mediante inyección y aspiración simultáneas de un líquido de procesamiento. En el confinamiento jerárquico, se confinan múltiples líquidos de procesamiento, con el HFC externo protegiendo la muestra del HFC de procesamiento interno.

Mueva la impresora multifunción sobre la monocapa de la celda a una distancia de 50 micras del portaobjetos de vidrio. Esta distancia entre huecos garantiza el contacto del HFC jerárquico y también tiene en cuenta la variación de la superficie y el espesor de la monocapa. Inyección de hidróxido de sodio a seis u ocho microlitros por minuto a través de I-dos.

Evalúe otros caudales utilizando las reglas de flujo en el protocolo de texto. Module el tamaño del HFC interno cambiando la relación de los caudales de inyección QI-dos y QI-one utilizando las jeringas de inyección. Por ejemplo, utilice un QI-one entre 1,3 microlitros por minuto y cuatro microlitros por minuto, con el QI-dos fijado en ocho microlitros por minuto, para dar como resultado una huella de hidróxido de sodio de 150 a 300 células.

Inyecte el medio completo desde las aberturas más externas del cabezal de la impresora multifunción a un caudal de 20 microlitros por minuto para tener en cuenta la evaporación del medio y la aspiración durante el funcionamiento del hHFC. Para modelar las monocapas de la célula, configure el software de la etapa para escanear la cabeza de la sonda sobre la monocapa de la célula en patrones definidos por el usuario a una velocidad de escaneo de 10 micras por segundo y una distancia de separación de 50 micras. Con el hHFC anidado en funcionamiento y en contacto con la monocapa, escanee la impresora multifunción con la trayectoria del patrón deseado para efectuar la eliminación de células con patrón.

Para un cocultivo después de la primera eliminación del tipo de célula, siembre una línea celular diferente para llenar los vacíos, como antes. Prepare la estación de muestreo para el análisis posterior del lisado. Aquí se muestra un ejemplo de una estación de muestreo, que consta de un soporte de PCR de ocho tiras impreso en tres D.

Limpie el soporte del tubo con etanol al 70% u otros descontaminantes de superficies, según la rigurosidad deseada para la aplicación. Utilice un clip magnético en el soporte del tubo para fijarlo al soporte del sustrato. Después de preparar la estación de muestreo, coloque el cabezal de la impresora multifunción a 100 micras de la monocapa.

Comience a operar el hHFC con una solución de hidróxido de sodio de 50 milimolares como líquido de procesamiento para el canal de inyección interno con un caudal de un microlitro por minuto para QI-uno, seis microlitros por minuto para QI-dos, menos siete microlitros por minuto para QA-uno y menos-17,5 microlitros por minuto para QA-dos. Una vez que el confinamiento del flujo se haya estabilizado, descienda la cabeza de la sonda a una distancia de separación de 50 micras para realizar una lisis local basada en hidróxido de sodio en la subpoblación elegida de células con hHFC. Una vez completada la lisis de la subpoblación, dirija la cabeza hacia los tubos de la estación de muestreo.

Expulse el lisado recogido directamente en los tubos de PCR. Después de procesar el lisado, como se describe en el protocolo de texto, cargue el lisado en un flujo de trabajo de qPCR estándar según lo establecido por el proveedor del instrumento. Al controlar la proporción de los líquidos de inyección en el HFC jerárquico, se modula el tamaño de la huella en contacto con la superficie de la celda.

Se eligieron los caudales, de modo que el efecto químico, en lugar del cizallamiento, sea el mecanismo dominante para la lisis celular. Esto se corroboró mediante la determinación del cizallamiento mediante dinámica de fluidos computacional. Aquí se muestra la generación de una cuadrícula de islas de celdas mediante la programación de trayectorias de escaneo con la MFP.

La modulación del tamaño de la huella mediante la relación de líquido de inyección permite controlar la resolución de la eliminación de células. Este método se puede utilizar para el cocultivo secuencial de múltiples poblaciones celulares, generando así patrones complejos de interacciones de célula a célula. El uso de hidróxido de sodio como líquido de procesamiento hace que el lisado sea compatible con el análisis de las células basado en PCR.

Aquí, se cuantificó el contenido de ADN a partir de cinco y una huella, lisada mediante el método descrito. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en las células en menos de 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que los canales y los capilares estén libres de burbujas de aire, ya que esto puede afectar negativamente al HFC.

No olvide que trabajar con hidróxido de sodio, una solución química corrosiva, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como gafas de seguridad y batas de laboratorio al realizar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, podemos analizar localmente las células mediante inmunotinción o secuenciación de ADN-ARN mediante lisis mediada por MFP para responder a preguntas adicionales, como qué proteínas se sobreexpresan debido al confinamiento geométrico de las células. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología molecular exploren la señalización inter y extracelular durante la generación y degeneración de tejidos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo modelar sustractivamente monocapas de células configuradas en MFP para el procesamiento local y hacer geometrías complejas de cocultivos de células.