Name: Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a fabricar y operar un biorreactor microfluídico de picolitro para análisis de una sola célula en bacterias como Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli. Este método permite estudiar la heterogeneidad fenotípica con resolución espacial y temporal.

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Los autores desean agradecer a la técnica Agnes Müller-Schröer su valiosa contribución. Este trabajo se realizó en parte en la Instalación Nanoelectrónica de Helmholtz (HNF) en Forschungszentrum Jülich GmbH. Los autores están agradecidos por la generosa ayuda y apoyo.

1. Fabricación de obleas
<ol>
	<li>Diseñe el dispositivo microfluídico que contiene las entradas, salidas, canales principales y los PLBR (Figura 1A) utilizando software CAD.</li>
	<li>El diseño presentado en este protocolo (Figura 2) consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para la mezcla de dos sustratos diferentes, una salida y seis matrices de PLBRs. Cada matriz contiene 5 PLBR, lo que da como resultado 30 PLBR paralelos dentro de un dispositivo microfluídico.</li>
	<li>Cree una fotomáscara de litografía que contenga los diseños de chips deseados (Figura 1B). La fotomáscara fue producida internamente por escritura por haz de electrones con resolución submicrónica. La mascarilla utilizada estaba compuesta por una capa de cromo sobre una placa de vidrio 5 en2. 
	Nota: realice todos los pasos siguientes en condiciones de sala limpia de clase 100 o superior (en las Figuras 3A y 3B se muestra un diagrama de flujo del proceso).</li>
	<li>Limpie una oblea de silicona de 4 pulgadas con piraña (proporción de 10:1 de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) y ácido fluorhídrico durante varios minutos (Precaución: productos químicos peligrosos). Enjuague con agua desionizada (DI) durante aproximadamente 10 segundos.</li>
	<li>Deshidratar la oblea durante 20 min a 200 °C.</li>
	<li>Aplicar una capa de centrifugado de 1 μm SU-8 2000.5 fotorresistente sobre la oblea (1ª capa) (resistencia de 4 ml, centrifugar 10 segundos con, v = 500 rpm y a = 100 rpm/seg, centrifugar 30 segundos con v = 1.000 rpm y a = 300 rpm/seg).</li>
	<li>Coloque la oblea recubierta en una placa calefactora a 95 °C para eliminar el exceso de disolvente (1,5 min a 65 °C, 1,5 min a 95 °C y 1 min a 65 °C; lo ideal es utilizar dos placas calefactoras).</li>
	<li>Inserte la fotomáscara de1ª capa (aquí las regiones de captura de los reactores de picolitros) y la oblea dentro del alineador de la máscara y exponga la oblea a 350-400 nm (contacto de vacío, 64 mJ/cm², t = 3 seg, I = 7 mW/cm²).</li>
	<li>Realice el horneado posterior a la exposición en una placa calefactora a 95 °C para iniciar la polimerización de SU-8 (1 min a 65 °C, 1 min a 95 °C y 1 min a 65 °C). Nota: después de este paso se pueden ver las estructuras en la capa SU-8.</li>
	<li>Coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante 1 minuto y transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco durante unos segundos.</li>
	<li>Enjuague la oblea con isopropanol para eliminar el revelador SU-8 y seque la oblea utilizando el flujo de nitrógeno del centrifugador de obleas.</li>
	<li>Hornee la oblea durante 10 minutos a 150 °C.</li>
	<li>Aplicar una capa de centrifugado de 9 μm SU-8 2010 photoresist sobre la oblea (2ªcapa) (dispensar 4 ml de resistencia, centrifugar 10 seg con v = 500 rpm, a = 100 rpm/seg, y centrifugar 30 s con v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/seg).</li>
	<li>Coloque la oblea con SU-8 en una placa calefactora a 95 °C para eliminar el exceso de disolvente (15 min a 65 °C, 45-60 min a 95 °C y 10 min a 65 °C). Nota: hay que prestar atención a las arrugas y las burbujas. Si la oblea se calienta a 95 °C, el disolvente evaporado puede encapsularse en pequeñas burbujas de gas.</li>
	<li>Inserte la fotomascarilla con el diseño deseado (aquí canales principales para el suministro de nutrientes) y la oblea en el alineador de mascarillas y exponga a 350-400 nm (contacto duro, 64 mJ/cm², t = 10 seg, I = 7 mW/cm²)</li>
	<li>Realice el horneado posterior a la exposición en una placa calefactora a 95 °C para finalizar la polimerización de SU-8 (5 min a 65 °C, 3:30 min a 95 °C, 3 min a 65 °C). Nota: después de este paso se pueden ver las estructuras en la capa SU-8.</li>
	<li>Coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante 45 segundos, transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco y revele durante 60 segundos.</li>
	<li>Enjuague la oblea durante 20 segundos con isopropanol para eliminar cualquier residuo de revelador SU-8 y seque la oblea con nitrógeno a presión.</li>
	<li>Por último, hornee la oblea a 150 °C. Como resultado se obtiene la oblea final (Figura 1C), que se utilizará como molde maestro para el moldeo de PDMS.</li>
	<li>Realice mediciones de perfilómetro (Figura 3C) para validar las alturas de la estructura SU-8. Nota: las imprecisiones en la altura de la estructura pueden resultar en una captura ineficiente de las células o en la pérdida de células durante el cultivo.</li>
</ol>
2. Fabricación de chips de polidimetilsiloxano
Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse idealmente en condiciones de flujo laminar para evitar que las partículas de polvo interfieran con el procedimiento de fabricación (en la Figura 4 se muestra un diagrama de flujo del proceso).
<ol>
	<li>Prepare una mezcla de base de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en una proporción de 10:1. Mezcle con cuidado hasta lograr una solución homogénea que se vea opaca. Prepare todo lo que sea necesario para la altura de capa deseada (aquí 3 mm).</li>
	<li>Desgasifique la mezcla de PDMS durante aproximadamente 30 minutos bajo un ligero vacío hasta que todas las burbujas hayan desaparecido.</li>
	<li>Prepare el dispositivo de moldeo (o placa de Petri) con la oblea SU-8 adecuada y vierta la mezcla de PDMS en ella (Figura 1D).</li>
	<li>Hornee el PDMS durante 3 horas a 80 °C en el horno.</li>
	<li>Despegue con cuidado la losa de PDMS de la oblea. Corta la losa en trozos individuales con un bisturí limpio y afilado.</li>
	<li>Lave las papas fritas en un baño de n-pentano durante 90 minutos, seguido de dos baños de lavado con acetona (90 minutos cada uno). Seque las virutas durante la noche para eliminar cualquier residuo de disolvente. Precaución: realice el lavado del PDMS bajo una campana extractora. Nota: durante el lavado con n-pentano, los monómeros y dímeros se eliminan del PDMS curado y el tamaño de la viruta puede duplicarse temporalmente durante el procedimiento de lavado.</li>
	<li>Almacene los chips PDMS microfluídicos en recipientes cerrados hasta el experimento final.</li>
	<li>Justo antes del experimento, perfore los orificios de entrada y salida en el chip PDMS con una aguja (o perforadora) con un diámetro ligeramente más pequeño que los conectores que se utilizan para conectar tubos con el chip PDMS.</li>
	<li>Limpie cuidadosamente el chip microfluídico de PDMS con isopropanol y use cinta adhesiva para eliminar cualquier partícula de polvo que pueda adherirse al lado estructurado del PDMS. Use la cinta adhesiva varias veces hasta que no se vea ninguna partícula en el chip.</li>
	<li>Limpie sucesivamente un portaobjetos de vidrio fino de 170 μm con acetona e isopropanol. Finalmente limpiar con agua desionizada y secar con nitrógeno a presión.</li>
	<li>Antes de la activación del plasma, caliente el limpiador de plasma y haga funcionar el plasma durante aproximadamente 300 segundos. Portaobjetos de vidrio oxidado por plasma y chip PDMS (Potencia 50 W, Tiempo = 25 segundos, Caudal de oxígeno = 20 sccm).</li>
	<li>Alinee el PDMS y el chip de vidrio antes de unir. Finalmente, coloque el chip PDMS con cuidado en el portaobjetos de vidrio (Figura 1E). El PDMS y el vidrio se unirán en cuestión de segundos. Nota: no empuje con pinzas la parte superior del chip PDMS durante el proceso de unión. Esto puede provocar el llamado colapso del techo de los canales y pequeñas estructuras.</li>
	<li>Para fortalecer la unión, hornee el chip final de vidrio PDMS durante 10 segundos a 80 °C.</li>
</ol>
3. Preparación del cultivo bacteriano
Nota: Todos los cultivos deben prepararse en medio filtrado estéril para evitar la acumulación de partículas no deseadas, que pueden interferir durante el cultivo.
<ol>
	<li>Utilice una placa de agar que contenga los organismos deseados (en este caso, C. glutamicum ATCC 13032) e inocule una colonia en 20 ml de medio BHI fresco, incube durante la noche (≈ 8-14 h) a 30 °C en un agitador giratorio (120 rpm).</li>
	<li>Transfiera 10 μl del precultivo al medio deseado (en este caso, CGXII21) que se utilizará durante el cultivo microfluídico y deje que la célula crezca durante la noche a 30 °C en un agitador rotativo (120 rpm).</li>
	<li>Transfiera la cantidad deseada de suspensión celular (entre 10 y 500 μl, dependiendo del inicio del experimento) al medio deseado (aquí CGXII21) que se utilizará durante el cultivo de células microfluídicas. Nota: lo mejor es usar celdas de la fase logarítmica temprana para la siembra. Para el cultivo de C. glutamicum, la mejor densidad óptica (OD600) para la siembra estuvo entre 0,5 y 2.</li>
	<li>Transfiera 1 ml del cultivo bacteriano a un tubo estéril de 2 ml. Nota: esto debe hacerse justo después de ensamblar el chip PDMS microfluídico para minimizar el tiempo de transferencia entre el matraz de agitación y el cultivo microfluídico. Por lo general, el tiempo de transferencia es de alrededor de 15 minutos y debe mantenerse lo más pequeño posible para evitar el impacto en el metabolismo causado por la limitación de oxígeno y los cambios de temperatura.</li>
</ol>
4. Configuración experimental
Nota: Todos los pasos se realizan con un microscopio invertido.
<ol>
	<li>Encienda la incubadora del microscopio 2 horas antes del experimento para calentar el sistema. Nota: la microscopía debe estar equipada con una incubadora de tamaño completo para controlar la temperatura y, si se desea, el flujo de gas. No es necesario un control de humedad adicional, ya que el sistema de chips se infunde continuamente con medios.</li>
	<li>Abra el sistema de incubadora, seleccione el objetivo deseado y, si es necesario, agregue aceite de inmersión al objetivo.</li>
	<li>Monte el chip dentro del soporte para chips. Si es necesario, fije la placa de vidrio con cinta adhesiva para evitar cualquier movimiento durante el funcionamiento del escenario.</li>
	<li>Centre la muestra en el microscopio y concéntrela en las matrices PLBR.</li>
	<li>Conecte las entradas y salidas con la tubería adecuada (Figura 1F). Conecte la tubería a un depósito de desechos. Un chip representativo se puede ver en la Figura 4D.</li>
	<li>Inserte las jeringas en las bombas e inicie el flujo de medios. Utilice medio, tampón o, si es necesario, solución de recubrimiento y enjuague los canales microfluídicos durante aproximadamente 1 hora. Nota: la solución de recubrimiento se utiliza para recubrir las paredes del canal para evitar la adhesión celular inespecífica.</li>
	<li>En el caso de E. coli, se utiliza una solución al 0,1% de BSA para recubrir las paredes del canal. Para C. glutamicum no es necesario ningún recubrimiento. Después del procedimiento de recubrimiento, enjuague la viruta con medio antes de la siembra de celdas.</li>
	<li>Antes de la siembra y el cultivo de células, compruebe que no se produzcan fugas y que la temperatura sea constante.</li>
</ol>
5. Siembra de células bacterianas en el dispositivo microfluídico
<ol>
	<li>Asegúrese de que las soluciones bacterianas deseadas estén disponibles en jeringas adecuadas conectadas a los tubos.</li>
	<li>Desconecte el tampón o la solución de recubrimiento y conecte la suspensión de la celda al chip. Para minimizar el volumen de muerte, las burbujas de aire no deseadas y reducir el tiempo experimental, cambie la aguja completa, así como el tubo, en lugar de solo las jeringas.</li>
	<li>Infundir la suspensión celular en los canales a un caudal volumétrico de 200 nl/min hasta que la mayoría de los PLBR se llenen con la cantidad deseada de celdas (Figura 5A). Nota: los resultados óptimos de siembra dependen de la cepa bacteriana, OD600 y del medio de crecimiento del precultivo. Estos parámetros deben adaptarse para aumentar la eficiencia y el tiempo de captura hasta que un número suficiente de células queden atrapadas en las estructuras del reactor. Para C. glutamicum, típicamente se utilizó una suspensión celular de OD600 0.5-2; para E. coli el OD600 estuvo entre 0,5-1.</li>
	<li>Si solo se llena un pequeño número de PLBR, aumente el caudal a 800-1.200 nl/min.</li>
	<li>Desconecte la suspensión celular y conecte el medio de crecimiento al chip (Figura 5B). Asegúrese de que no se introduzca ninguna burbuja de aire durante el cambio de medio. Perfundir con medios de crecimiento frescos a 100 nl/min.</li>
</ol>
6. Imágenes de lapso de tiempo
<ol>
	<li>Seleccione PLBR específicos para imágenes de lapso de tiempo. Por lo general, se eligen PLBR que contienen una sola célula madre al comienzo de un experimento. El número de regiones de interés que se pueden investigar en un experimento depende de la velocidad de fotogramas deseada y de la configuración microscópica.</li>
	<li>Seleccione una velocidad de fotogramas adecuada en función del número de PLBR. Asegúrese de que el microscopio pueda manejar la cantidad deseada de ROI en el intervalo de lapso de tiempo.</li>
	<li>Elija los conjuntos de filtros adecuados (aquí YFP). Cierre automáticamente el obturador durante el movimiento del escenario y después de cada medición de lapso de tiempo para evitar el blanqueo de cromóforos.</li>
	<li>Configure la secuencia de microscopía de lapso de tiempo e inicie el experimento.</li>
	<li>Una vez que todos los PLBR están demasiado crecidos, el experimento se puede detener, el chip PDMS microfluídico se puede descartar y el experimento se puede evaluar.</li>
</ol>
7. Análisis
Nota: Los siguientes pasos o partes del procedimiento se pueden realizar manualmente o mediante programas de análisis de imágenes como ImageJ, etc.
<ol>
	<li>Determine los PLBR de interés en los que el cultivo cumple con todos los criterios deseados, por ejemplo, número de células madre, posición de las células madre, etc.</li>
	<li>Para determinar la tasa de crecimiento de una microcolonia, cuente el número de células en cada período de tiempo.</li>
	<li>Calcule la tasa de crecimiento máxima trazando el tiempo frente a ln (número de celda). La pendiente de la gráfica representa la tasa de crecimiento en [1/h] (ver Figura 6).</li>
	<li>El análisis de datos de fluorescencia depende en gran medida del experimento realizado. En este informe, se eligió un ejemplo para ilustrar la heterogeneidad de colonia a colonia y de célula a célula entre diferentes microcolonias isogénicas (ver Figura 7).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito la fabricación, la configuración experimental y los procedimientos de operación relacionados de un dispositivo PDMS microfluídico que contiene varios (PLBR) para el análisis unicelular de bacterias.
La microfabricación mediante técnicas de litografía blanda permite ajustes rápidos de las dimensiones del dispositivo para varios tamaños y morfologías de bacterias. Actualmente estamos optimizando el biorreactor de picolitros en cuanto al cultivo de diferentes organismos microbianos y el rendimiento del cultivo. Para aumentar la eficiencia de captura, también se está optimizando la geometría del reactor. La Figura 8 muestra cuatro nuevos dispositivos PLBR que están validados actualmente. En todas las figuras, el canal de siembra se rediseñó con respecto al ancho y la forma. En la práctica, esto parece tener un efecto en la cantidad de células que quedan atrapadas, pero necesita más investigaciones. También se lograron mejoras significativas con respecto a la eficiencia de captura mediante la incorporación de canales de desbordamiento adicionales que conducen a un mayor flujo conveccional a través del reactor y más células atrapadas. Sin embargo, al mismo tiempo aumenta el riesgo de lavar las células durante el cultivo.
El dispositivo es una alternativa interesante a los cultivos a macroescala que se han utilizado durante décadas para investigar los procesos de crecimiento y producción a nivel unicelular. Sin embargo, tiene algunos requisitos importantes: Para la monitorización paralela de varios biorreactores de picolitros, es obligatoria una configuración microscópica de alta resolución y totalmente motorizada con compensación de la deriva del foco. Además, se necesita un sistema de incubación para mantener constante la temperatura de cultivo deseada durante las mediciones.
Logramos una tasa de éxito del 95% en la fabricación de dispositivos. Los principales problemas están relacionados con la unión ineficiente de PDMS-vidrio, el colapso del techo PDMS o la fuga de fluido (consulte la Tabla 1 para la solución de problemas más frecuentes). Aunque el trabajo experimental se realiza parcialmente en condiciones no estériles, rara vez vemos contaminación durante los experimentos, debido al sistema fluídico cerrado. Los dispositivos microfluídicos PDMS son ópticamente transparentes, por lo tanto, se pueden utilizar para imágenes in vivo de alta resolución. Aunque PDMS parece ser perfecto para la aplicación, tiene una alta afinidad por las moléculas hidrofóbicas, lo que limita el uso de disolventes que se utilizan ampliamente en procesos biocatalíticos de células enteras. Sin embargo, existen recubrimientos adecuados para adaptar el protocolo a este tipo de aplicaciones.
El PLBR propuesto es muy adecuado para el análisis espacio-temporal de eventos celulares e incluso subcelulares de varios tipos de bacterias. Una ventaja importante del enfoque actual radica en la capacidad de cuantificar el crecimiento de microcolonias directamente en contraste con los métodos convencionales. Además, el PLBR permite el cultivo en condiciones definidas y constantes. Debido a que el sistema facilita el uso de pequeñas cantidades de reactivos o materiales, tiene las ventajas de ser económico, personalizable y susceptible de un alto rendimiento. En los métodos tradicionales, se consideran los valores promedio de toda la población al analizar el cultivo microbiano. Además, los métodos existentes necesitan un muestreo manual que puede provocar la degradación de las muestras y, por tanto, errores en la medición. El PLBR ofrece nuevas perspectivas para el desarrollo de bioprocesos y el análisis de heterogeneidad de poblaciones en microbiología. El PLBR es una herramienta prometedora para diversas aplicaciones dentro del desarrollo de bioprocesos y podría aplicarse en varios campos de investigación, por ejemplo, análisis de heterogeneidad de célula a célula, análisis de grupos celulares específicos dentro de linajes celulares, detección de cepas de producción microbiana e investigación en tiempo real de fenotipos celulares.

La microscopía de lapso de tiempo es una poderosa herramienta para estudiar células vivas in vivo1. Mientras tanto, las plataformas de microscopía totalmente automatizadas disponibles en el mercado, incluida la compensación de la deriva del foco inducida térmicamente, se aplican comúnmente en la investigación biológica para estudiar fenómenos dependientes del tiempo, que van desde la investigación de células cancerosas y neuronales hasta la ingeniería de tejidos y estudios dinámicos con células individuales de levadura o bacterias2-6.
Por lo general, se aplican placas de pocillos transparentes, almohadillas de agar o simplemente portaobjetos de microscopía para proporcionar entornos de cultivo celular durante la obtención de imágenes de lapso de tiempo7. A pesar de ser adecuados para ciertas investigaciones, estos sistemas simples tienen un control muy limitado sobre las condiciones ambientales y no permiten perturbaciones más complejas o cambios de medio bien definidos y rápidos. Los dispositivos de chip microfluídico desechables producidos en masa se han introducido en el mercado recientemente, pero en su mayoría están diseñadospara tipos de células eucariotas más grandes. Aunque se puede seguir el crecimiento, las investigaciones de crecimiento bien definidas relativas, por ejemplo, a la captura precisa de células, el tamaño de la colonia, la dirección del crecimiento y la capacidad de eliminación de células son limitadas. Los hábitats y reactores microfluídicos, en los que se cultivan células bacterianas en ambientes 3D se han desarrollado8-10, tienen inconvenientes cuando se trata de estudios cuantitativos a nivel de una sola célula. Si bien se puede analizar la heterogeneidad general de la población, muchos parámetros celulares no se pueden determinar con precisión con la resolución de una sola célula, ya que el crecimiento no se restringe a monocapas.
Esta limitación desencadenó el desarrollo de microsistemas que permiten el cultivo de células en canales y hábitats bien definidos, con células que crecen en monocapas planas con resolución de una sola célula y un control especialmente estricto sobre el suministro de medios y las condiciones ambientales6,11,12. Se han demostrado pocos ejemplos de sistemas microfluídicos para el cultivo de células bacterianas12-14. Las bacterias suelen exhibir tasas de crecimiento muy rápidas y requieren estructuras microfluídicas en el rango de unos pocos micrómetros o menos, especialmente cuando se desean monocapas celulares para la microscopía. Keymer y cols. Crecimiento y propagación demostrados de cepas de E. coli en paisajes microfabricados15,16. Como estaban interesados en la dinámica de poblaciones, no investigaron con resolución de una sola célula.
Hemos desarrollado el biorreactor de picolitros (PLBR)13, que actualmente se aplica para investigar diversos indicadores de rendimiento biotecnológico como el crecimiento17 y el análisis de productividad acoplado a fluorescencia a nivel de una sola célula18,19. El actual dispositivo microfluídico permite el control del reactor ambiental a un volumen de cultivo definido de aproximadamente un picolitro y la observación continua de una sola célula simultáneamente. En comparación con los sistemas de caja monocapa abierta11,14, donde uno o dos lados están abiertos al canal de suministro de medios, el PLBR permite el atrapamiento y cultivo controlados. El diseño permite el cultivo a largo plazo de bacterias sin el riesgo de que varias colonias adyacentes formen una gran población. Además, el sistema incorpora regiones de cultivo de 1 μm de altura (en el orden del diámetro de la célula) para restringir el crecimiento de las bacterias a monocapas celulares. Por el contrario, los canales de suministro son 10 veces más profundos para minimizar la resistencia hidráulica.
En comparación con los sistemas de cultivo por lotes miniaturizados20, el sistema actual permite el cultivo con parámetros ambientales constantes debido al flujo continuo de medios. Además, los parámetros ambientales, como la composición del medio, la temperatura, los caudales y el intercambio de gases, se pueden controlar y cambiar fácilmente en cuestión de segundos. Esto permite investigaciones específicas de la respuesta celular a los cambios ambientales relativos, por ejemplo, a la disponibilidad de nutrientes o a los estímulos de estrés. La demanda de volúmenes de medios reducidos, es decir, en el rango de unos pocos microlitros solamente, permite a los investigadores realizar estudios novedosos, por ejemplo, la perturbación de las células durante la obtención de imágenes de lapso de tiempo con sobrenadante de experimentos a gran escala que desentrañan la respuesta celular en estas condiciones ambientales específicas17. El biorreactor de picolitros proporciona a los investigadores un sistema robusto que controla estrictamente las condiciones biofísicas y funciona mediante bombas de jeringa de alta precisión y microscopía automatizada de campo claro y fluorescencia para obtener imágenes de lapso de tiempo. Aquí, informamos un protocolo completo que incluye el diseño del dispositivo, la fabricación y las aplicaciones ejemplares.

<table><tbody><tr><td>Oblea de silicona de 100 mm de diámetro, P/BOR < 100></td><td>Si-MAT, Materiales de silicio, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistencia SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotorresistencia SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Revelador mr DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Kit</td> <td>de elastómero de siliconaDow Corning; Farnell GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas dosificadoras Puntas de precisión&nbsp; 27 G; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm</td><td>Schott AG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perforadora AKA 5130-B-90</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm</td><td>Saint Gobain; VWR International GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas desechables &ndash; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Alemania</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas, 1 ml jeringas de vidrio estéril</td><td>INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicals</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&bull; 6H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido procatecuico</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa-monohidrato</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>Corynebacterium glutamicum ATTC 13032</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG 1655</td><td>DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Limpiador de obleas SSEC 3300</td><td>Solid State Equipment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alineador de mascarillas MA-6</td><td>Karl Suess</td> Placa calefactora <td></td><td></td></tr><tr><td>HP30A - 2</td><td>Torrey Pines Horno</td> de laboratorio científico <td></td><td></td></tr><tr><td>Memmert UN 200</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma FEMTO</td><td>Diener Electronics, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa neMESYS</td><td>Cetoni GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Eclipse Ti</td><td>Microscopía Nikon</td> Incubadora de microscopio <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pecon GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga minispin plus " línea negra"</td><td>Fotómetro Eppendorf</td><td>9776501</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>Agitador/incubadora de matraces 3031</td><td>GFL - Gesellschaft f&uuml; r Labortechnik mbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfilómetro, Dektak 150 Stylus Profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

En este protocolo se describe en detalle la fabricación, la configuración experimental y el funcionamiento básico del biorreactor microfluídico de picolitros (PLBR) recientemente introducido. El PLBR se puede utilizar para el análisis de bacterias individuales y microcolonias para investigar cuestiones relacionadas con la biotecnología y la microbiología relativas, por ejemplo, al crecimiento celular, la morfología, la respuesta al estrés y la producción de metabolitos o proteínas a nivel de una sola célula. El dispositivo cuenta con un flujo de medio continuo que permite condiciones ambientales constantes para estudios de perturbación, pero también permite cambios rápidos de medio, así como condiciones oscilantes para imitar cualquier situación ambiental deseada. Para fabricar los dispositivos de un solo uso, una oblea de silicio que contenía estructuras SU-8 de tamaño submicrométrico sirvió como molde de replicación para la fundición rápida de polidimetilsiloxano. Los chips se cortaron, ensamblaron, conectaron y configuraron en un microscopio de alta resolución y totalmente automatizado adecuado para imágenes de lapso de tiempo, una poderosa herramienta para el análisis de células espacio-temporales. Aquí, el organismo de la plataforma biotecnológica Corynebacterium glutamicum se sembró en el PLBR y se siguió el crecimiento celular y la fluorescencia intracelular durante varias horas para desentrañar la heterogeneidad de la población dependiente del tiempo a nivel de una sola célula, lo que no es posible con métodos de análisis convencionales como la citometría de flujo. Además de los conocimientos sobre la fabricación de dispositivos, se demuestra la preparación del precultivo, la carga, la captura de bacterias y el cultivo PLBR de células individuales y colonias. Estos dispositivos añadirán una nueva dimensión a la investigación microbiológica para analizar los fenómenos dependientes del tiempo de bacterias individuales bajo un estricto control ambiental. Debido al proceso de fabricación simple y relativamente corto, la tecnología se puede adaptar fácilmente en cualquier laboratorio de microfluídica y simplemente se adapta a necesidades específicas.

Fabricación del dispositivo
El sistema microfluídico de bioreactor de perfusión (PLBR) se fabrica mediante una capa de PDMS unida a un chip de vidrio delgado adecuado para microscopía de alta resolución. La fabricación consta de dos pasos principales: primero, la fabricación del molde patrón (Figuras 1A, 1B y 1C), y segundo, la fabricación del chip (Figuras 1D, 1E y 1F). Según el protocolo, se utilizan técnicas estándar de microfabricación fotolitográfica para crear el molde patrón. Los laboratorios que no cuentan con instalaciones de sala limpia pueden adquirir moldes patrón SU-8 personalizados disponibles comercialmente. Mediante moldes repetitivos de PDMS (Figuras 1A, 1B y 1C), se pueden producir cientos de chips desechables. El moldeo de PDMS y el ensamblaje del chip pueden realizarse en cualquier laboratorio y no requieren instalaciones de sala limpia, aunque es preferible contar con puestos de trabajo con flujo laminar.
El proceso comienza con el diseño del sistema de chip microfluídico. Por lo general, se utiliza software CAD para diseñar el chip microfluídico (Figura 1A). Tras el diseño CAD, se genera una máscara mediante un escritor de haz de electrones (Figura 1B) con resolución submicrométrica. En el presente estudio, se creó una máscara de cromo de 5 in que se utilizó para la litografía de oblea SU-8. La oblea final de silicio—SU—8 se usa para el moldeo de PDMS (Figura 1D). Tras un paso de horneado, la lámina de PDMS se corta en chips que se unen irreversiblemente a las laminillas de vidrio (Figura 1E). Finalmente, se conectan los tubos (Figura 1F).
Figura 2 muestra en detalle el diseño del sistema microfluídico. Este consta de dos entradas para siembra, un generador de gradiente para la mezcla de diferentes sustratos o medios y una salida. Los canales principales tienen una dimensión de 50 µm x 10 µm (A x H). Cada dispositivo consta de seis matrices de PLBR, conteniendo 5 PLBR cada una. Esto resulta en 30 reactores en paralelo dentro de un dispositivo microfluídico.
Figura 3 ilustra la producción del molde maestro para replicación. Como se describe detalladamente en el protocolo, se fabrica una primera capa de SU-8 mediante litografía con SU-8 (Figura 3A). Se aplica un procedimiento similar para la segunda capa (Figura 3B). Para verificar la geometría de los canales, se investigó la altura de los PLBR y de los canales principales utilizando un perfilómetro. En el ejemplo mostrado en la Figura 3C, se midió la primera capa (la capa de cultivo). Aquí, la capa presenta una altura constante de 1.200 nm, adecuada para el cultivo de C. glutamicum en medio BHI.
Figura 4 ilustra el procedimiento de moldeo de PDMS, que comienza con la mezcla de PDMS (Figura 4A), seguido por el proceso de moldeo (Figura 4B) y finalmente el paso de unión (Figura 4C). Figura 4D muestra el chip microfluídico final, que incorpora una placa de vidrio de 170 µm de grosor, el chip de PDMS (de 3 mm de altura) con entradas y salidas, y agujas de acero conectadas a tubos. Después del experimento, el chip puede desecharse y no es necesario un limpiado exhaustivo. Además, es fácil de armar y manipular. No se requiere un procedimiento de llenado complejo ni difícil.
Principio del dispositivo
Figura 5 muestra el principio de funcionamiento del sistema de reactor. Las células se infunden en el dispositivo microfluídico y las células individuales permanecen atrapadas dentro del PLBR simplemente por interacciones entre la célula y la pared. Debido a la diferencia en la resistencia hidrodinámica del canal y del PLBR, solo ocurre un flujo mínimo dentro del PLBR. Tras la siembra del PLBR (Figura 5A), se inicia la fase de crecimiento y observación mediante un cambio de la solución bacteriana al medio de crecimiento (Figura 5B). Una vez que los PLBR están completamente colonizados (Figura 5C), el experimento generalmente se detiene y se pueden analizar las imágenes de lapso de tiempo. Para obtener más detalles sobre los mecanismos de atrapamiento y el perfil de flujo dentro del PLBR, se remite al lector a Grünberger et al.13 .
Análisis de la tasa de crecimiento
El sistema actual puede aplicarse para estudiar diversas especies bacterianas con respecto a diferentes parámetros biológicos, como el crecimiento, la morfología o una señal fluorescente. En un primer ejemplo, C. glutamicum, un organismo productor de relevancia industrial, se cultivó bajo condiciones estándar de cultivo (T=30 °C, medio CGXII21). Figura 6A muestra las curvas de crecimiento derivadas de tres microcolonias isogénicas. El crecimiento exponencial se mantiene hasta que los PLBR están llenos, lo que indica que no ocurre limitación de nutrientes. Figura 6B muestra cuatro imágenes de microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) con lapso de tiempo de una colonia en crecimiento de C. glutamicum.
Análisis de fluorescencia
Para la microscopía de fluorescencia de célula individual, los investigadores suelen utilizar proteínas fluorescentes específicas, por ejemplo GFP o sus derivados, para asociar un fenotipo específico de interés con una señal medible (una señal fluorescente). Para demostrar la aplicabilidad del PBLR en estudios de lapso de tiempo basados en fluorescencia, investigamos la emisión de fluorescencia de una cepa de C. glutamicum que produce una proteína de fusión YFP-TetR codificada en un plásmido bajo el control del promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. Se sabe que, en presencia de bajas concentraciones del inductor (IPTG), la expresión desde el promotor Ptac conduce a una variación significativa entre células en poblaciones bacterianas isogénicas. A partir de un precultivo único, se siguió el crecimiento y la fluorescencia a nivel de célula individual en varias microcolonias isogénicas. Como puede observarse en la Figura 7, observamos heterogeneidad fenotípica entre diferentes microcolonias y heterogeneidad a nivel de célula individual dentro de colonias derivadas de una misma célula madre. Una colonia (Figura 7B, PLBR 1) mostró casi ninguna emisión de fluorescencia, mientras que las células del PLBR 2 exhibieron una emisión de fluorescencia baja debido a la expresión basal de yfp-tetR desde el promotor Ptac. En el PLBR 3, la emisión de fluorescencia fue considerablemente fuerte en comparación con las otras colonias, y se observó una amplia distribución de la población. Este ejemplo demuestra la aplicabilidad del PBLR para estudios de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. En comparación con la citometría de flujo, en la cual se puede determinar la fluorescencia de células individuales en un solo momento, el sistema actual permite el seguimiento de células y el estudio de la fluorescencia individual en tiempo real durante muchas generaciones.
<img alt="Diagrama del proceso de producción de microchips con etapas de diseño, máscara, oblea, moldeo, unión y ensamblaje." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Descripción general del proceso de producción del chip PLBR. Fabricación del molde maestro: comenzando con (A) Diseño, (B) Fabricación de la máscara de litografía y (C) Producción de obleas. Producción del chip de PDMS y vidrio: comenzando con (D) Moldeo de PDMS, seguido de (E) Unión de vidrio y PDMS y (F) Ensamblaje final del chip.
<img alt="Diagramas de chip microfluídico con canales de flujo etiquetados, para investigación de separación y análisis celular." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Diseño del chip PLBR. (A) Dibujo CAD del microchip microfluídico completo; (B) Ampliación de posiciones seleccionadas del diseño: el diseño incluye dos entradas de medio (a1), un generador de gradiente con canales de mezcla (a2) y 6 matrices paralelas de PLBR (b1). b2 muestra un PLBR, que está integrado en un canal de fluido con un ancho de 100 µm. El PLBR tiene un diámetro interno de 40 µm y canales de nutrientes con un ancho de 2 µm. La entrada de siembra tiene una longitud de 40 µm. El color rosa representa la primera capa (región de atrapamiento y cultivo) y el color azul representa la segunda capa (transporte de fluido).
<img alt="Diagrama del proceso de microfabricación con pasos de fotolitografía SU-8 y resultados de medición de altura." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Ilustración del proceso de fabricación de oblea de dos capas. (A) Fabricación de la primera capa que contiene las estructuras de atrapamiento; (B) Fabricación de la segunda capa que contiene canales de fluido, entradas y salidas; (C) Perfiles superficiales representativos de la primera capa. En este caso, la altura de la primera capa fue de 1.200 nm y se utiliza para el cultivo de C. glutamicum en medio complejo.
<img alt="Diagrama del proceso de moldeo de PDMS; arquitectura del chip microfluídico con capas de SU8, PDMS y vidrio; entradas/salidas." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Fabricación del dispositivo y chip representativo. Ilustración del proceso de moldeo de PDMS: (A) mezcla y desgasificación de PDMS; (B) moldeo de PDMS; (C) liberación del molde, corte y unión del chip. Chip final (reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry13): (D) fotografía del chip de PDMS con 2 entradas y 1 salida; (E) imagen CAD de seis arreglos paralelos que contienen 5 PLBR cada uno; (F) imagen de MEV de un PLBR.
<img alt="Crecimiento bacteriano en dispositivo microfluídico; canales de flujo laminar; configuración de PDMS; canales de desbordamiento y alimentación." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Principio de funcionamiento del sistema PLBR. (A) Fase de siembra; (B) Fase de crecimiento de las microcolonias bacterianas; (C) Fase de desbordamiento. Reproducido con permiso de la Royal Society of Chemistry13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>.
<img alt="Gráfico de crecimiento celular con imágenes de microscopía microbiana; ecuaciones para el análisis de la tasa de crecimiento y resultados." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6. Determinación de la tasa de crecimiento de microcolonias de C. glutamicum WT. (A) Gráfico de crecimiento de tres cultivos PLBR y las curvas exponenciales resultantes (partes reproducidas con permiso de la Royal Society of Chemistry)13. <a href="http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H">http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H</a>. (B) Imágenes de lapso de tiempo de una colonia en crecimiento de C. glutamicum.
<img alt="Diagrama del proceso de cultivo microbiano con datos de fluorescencia; el experimento muestra crecimiento celular y análisis." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7. Análisis basado en PBLR de la heterogeneidad poblacional. Se muestra C. glutamicum expresando una fusión yfp-tetR bajo el control del promotor Ptac (pEKEx2-yfp-tetR) en ausencia del inductor IPTG. (A) Flujo experimental; (B) Tres microcolonias isogénicas que muestran heterogeneidad entre colonias y entre células; (C) Distribución de la fluorescencia a nivel de célula individual dentro de las respectivas microcolonias.
<img alt="Imagen de microscopía que compara microestructuras con diferentes entradas de siembra para el análisis de materiales." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50560/50560fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 8"> 
Figura 8. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de diferentes PLBR. Imágenes de MEB que muestran las entradas de siembra para la optimización de la eficiencia de atrapamiento. (A) Entradas de siembra más estrechas (B) Entradas de siembra más pequeñas (C) Entradas de siembra más grandes y «abiertas» (D) Dos entradas de siembra.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<colgroup>
		<col span="4">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Paso</td>
			<td>Problema</td>
			<td>Causa posible</td>
			<td>Solución</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fabricación de obleas</td>
			<td>Burbujas de aire atrapadas en SU-8 durante el horneado suave</td>
			<td>Aumento demasiado rápido de la temperatura</td>
			<td>Hornear varias veces a 95 °C y 65 °C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fabricación de obleas</td>
			<td>Estructuras de SU-8 desaparecidas o rotas</td>
			<td>Procedimiento de fabricación no óptimo; estrés mecánico en las estructuras de SU-8</td>
			<td>Optimizar parámetros como el tiempo de horneado y el tiempo de exposición</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fabricación de obleas</td>
			<td>Capas de SU-8 demasiado bajas, altas o con espesor irregular</td>
			<td>Problema durante el recubrimiento por centrifugación</td>
			<td>Verificar los parámetros del centrifugador y del portamuestras</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unión y ensamblaje del chip</td>
			<td>PLBRs colapsados</td>
			<td>Parámetros de unión de PDMS no óptimos</td>
			<td>Ajustar la potencia, el tiempo de exposición al plasma y el tiempo de horneado después de la unión</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unión y ensamblaje del chip</td>
			<td>Estructuras sucias y partículas en los PLBRs</td>
			<td>El chip no se limpió adecuadamente</td>
			<td>Aplicar cinta adhesiva para limpieza de superficies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unión y ensamblaje del chip</td>
			<td>Unión insuficiente entre PDMS y vidrio</td>
			<td>Parámetros de unión no óptimos o limpieza insuficiente</td>
			<td>Verificar la configuración del plasma de oxígeno</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico</td>
			<td>Fugas de fluido</td>
			<td>El orificio de entrada/salida no se perforó adecuadamente</td>
			<td>Optimizar el proceso de perforación de orificios</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico</td>
			<td>Presencia de muchas partículas pequeñas de PDMS durante el llenado</td>
			<td>El orificio no se perforó adecuadamente</td>
			<td>Optimizar el proceso de perforación de orificios</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Experimento microfluídico, aspecto biológico</td>
			<td>Sin crecimiento celular</td>
			<td>Residuos de disolvente del procedimiento de limpieza</td>
			<td>Lavar más exhaustivamente el chip antes de la carga celular o permitir que el disolvente evapore antes de la unión</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico, aspecto biológico</td>
			<td>Cambios en las tasas de crecimiento</td>
			<td>Diversas causas</td>
			<td>Verificar el precultivo y la temperatura</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico, aspecto biológico</td>
			<td>Cambios en la morfología celular durante el cultivo</td>
			<td>Limitaciones de nutrientes o cambios de temperatura</td>
			<td>Verificar la incubadora y el flujo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico, aspecto técnico</td>
			<td>Deriva de posición durante la microscopía de lapso de tiempo</td>
			<td>Fluctuaciones de temperatura</td>
			<td>Verificar el perfil de temperatura antes de los experimentos hasta que no haya oscilaciones</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico, aspecto técnico</td>
			<td>Pérdida de células durante el cultivo</td>
			<td>Altura del reactor ligeramente demasiado alta</td>
			<td>Optimizar la altura del reactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Experimento microfluídico, aspecto técnico</td>
			<td>Sin atrapamiento</td>
			<td>Altura del reactor demasiado baja</td>
			<td>Optimizar la altura del reactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Solución de problemas. Esta tabla resume aspectos críticos, errores comunes y posibles soluciones durante el trabajo experimental.

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar bacterias individuales y microcolonias isogénicas en evolución con resolución espacial y temporal completa, bajo condiciones ambientales constantes, mediante un dispositivo de cultivo microfluídico. Esto se logra primero diseñando un sistema de cultivo microfluídico utilizando software CAD. A continuación, se fabrican dispositivos desechables de cultivo microfluídico hechos de polidimetilsiloxano que contienen biorreactores de picolitros, con una altura de un micrón para restringir el crecimiento bacteriano a una sola capa.Posteriormente, se infunde cultivo microbiano en el dispositivo microfluídico para inocular células madre individuales dentro de los biorreactores. Estas células se expanden mediante la infusión continua de medio de crecimiento a través del sistema. Los resultados se obtienen mediante microscopía de lapso de tiempo automatizada, que muestra el cultivo de una cepa de Corynebacterium glutamicum de relevancia industrial, datos de crecimiento y la heterogeneidad entre células.En la biotecnología convencional, la mayoría de los análisis se basan en datos promedio. Nuestro dispositivo de microfluidos facilita el análisis individual de células bacterianas con resolución espacial y temporal. Es una herramienta útil para observar de cerca la heterogeneidad entre célula y célula en microcolonias isogénicas.Aplicamos litografía fotográfica común con SU-8 y moldeo de chips de polidimetilsiloxano para fabricar dispositivos microfluídicos de un solo uso con resolución de medios submicrométrica. Hemos demostrado con éxito nuestra tecnología con varios microorganismos biotecnológicos, como Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum. Para comenzar, diseñe el dispositivo microfluídico utilizando software CAD.El diseño presentado en este protocolo consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para mezclar dos sustratos diferentes, una salida y seis matrices compuestas por cinco biorreactores cada una. En un cuarto limpio, prepare una oblea de silicio de cuatro pulgadas y aplique mediante centrifugación una capa de un micrómetro de resistencia fotolitográfica SU-8 2000.5 sobre la oblea, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Coloque la oblea recubierta sobre una placa calefactora a 95 grados Celsius para eliminar el exceso de disolvente, e introduzca luego la primera máscara fotolitográfica, que incluye las regiones de captura de los reactores de picolitros, junto con la oblea recubierta dentro del alineador de máscaras.A continuación, exponga la oblea en modo de contacto al vacío a luz de 350 a 400 nanómetros durante tres segundos a una intensidad de siete milivatios por centímetro cuadrado. Realice un horneado posterior a la exposición en una placa caliente nivelada a 95 grados Celsius para iniciar la polimerización del SU-8. A continuación, coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante un minuto y luego transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco durante unos segundos.Lave la oblea con isopropanol para eliminar el revelador SU-8 y seque la oblea mediante flujo de nitrógeno o con una centrífuga para obleas. A continuación, realice una cocción fuerte de la oblea durante 10 minutos a 150 grados Celsius. Después, fabrique la segunda capa según se describe en el protocolo de texto adjunto para completar el molde maestro.Comience la fabricación del chip de PDMS mezclando la base y el agente portador en una proporción de 10 a 1. Degaire la mezcla de PDMS durante aproximadamente 30 minutos dentro de un desecador al vacío hasta que desaparezcan todas las burbujas. A continuación, coloque la oblea de SU-8 en un dispositivo de moldeo y vierta una capa de tres milímetros de la mezcla de PDMS sobre la oblea.Luego, hornee el PDMS durante tres horas a 80 grados Celsius en un horno. Una vez enfriado, retire cuidadosamente la lámina de PDMS del oblea y corte la lámina en chips individuales utilizando un escalpelo limpio y afilado. Lave los chips en un baño de n-pentano durante 90 minutos, seguido de dos baños de lavado con acetona de 90 minutos cada uno.Seque las láminas durante la noche para eliminar cualquier residuo de disolvente. Justo antes del experimento, perfore los orificios de entrada y salida en el chip de PDMS utilizando una aguja o un perforador con un diámetro ligeramente menor que el de los conectores que se usan para conectar la tubería con el chip de PDMS. A continuación, limpie cuidadosamente el chip de PDMS microfluídico con isopropanol y utilice cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adheridas.Además, limpie un portaobjetos de vidrio delgado de 170 micrones primero con acetona, luego con isopropanol, seguido de agua desionizada, y seque el portaobjetos con un chorro de nitrógeno. Una vez limpio y seco, oxide con plasma el portaobjetos de vidrio y el chip de PDMS durante 25 segundos utilizando una potencia de 50 vatios y un flujo de oxígeno de 20 sccm. Luego, alinee cuidadosamente el PDMS y el chip de vidrio antes de colocar el PDMS sobre el vidrio, lo que hará que se unan en cuestión de segundos.Asegure la unión horneando el montaje durante 10 segundos a 80 grados Celsius. Para preparar las bacterias para un experimento con chip, inocule una colonia individual de una cepa bacteriana deseada, como C.glutamicum, en 20 mililitros de medio BHI fresco e incube el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius en un agitador rotatorio a 120 RPM. A la mañana siguiente, transfiera 10 microlitros del cultivo inicial a un segundo cultivo que contenga 20 mililitros del medio deseado y deje crecer las células durante la noche en las mismas condiciones.Al día siguiente, precaliente el incubador de un microscopio invertido a 30 grados Celsius. Esto puede tardar hasta dos horas, dependiendo del equipo específico. Mientras el equipo se calienta, abra el incubador, seleccione el objetivo deseado y prepárelo con cualquier medio de montaje necesario.Luego, monte el chip dentro del soporte del chip y fíjelo en su lugar. Centre la muestra en el microscopio y enfoque los arreglos de bioreactores de picolitros. Con el chip enfocado, conecte las entradas y salidas con el tubo adecuado y luego coloque el tubo de salida en un depósito de desecho.A continuación, llene una jeringa con medio fresco, colóquela en una bomba de jeringa y enjuague los canales microfluídicos durante una hora a un caudal de 200 nanolitros por minuto para cebado del chip. Mientras las células aún se encuentran en la fase temprana de crecimiento exponencial, transfiera un mililitro de la cultura bacteriana a una jeringa estéril y sustituya la jeringa y el tubo que contienen medio por la suspensión celular y un tubo nuevo. Infunda la suspensión celular en los canales a un caudal volumétrico de 200 nanolitros por minuto hasta que la mayoría de los biorreactores de picolitros estén llenos.Si solo se llenan un pequeño número de biorreactores, aumente el caudal a 800-1200 nanolitros por minuto. Cuando se haya sembrado la cantidad deseada de células, desconecte la suspensión celular, reconecte el medio de crecimiento al chip y pase medio fresco a 100 nanolitros por minuto. A continuación, escanee el chip y seleccione biorreactores específicos para la adquisición de imágenes con lapso de tiempo.Luego, configure una secuencia de microscopía de intervalos para obtener imágenes de los biorreactores desde el inicio hasta el final y comenzar el experimento. Una vez que todos los biorreactores de picolitros estén sobrepoblados, detenga el experimento y deseche las chips adecuadamente. Para iniciar el análisis, primero determine qué biorreactores cumplen con todos los criterios deseados para el experimento, como el número y la posición de las células madre.Mediante un programa de análisis, como ImageJ, determine la tasa de crecimiento de cada microcolonia contando el número de células en cada punto temporal. Calcule la tasa máxima de crecimiento graficando el tiempo frente al logaritmo del número de células. El sistema aquí presentado puede aplicarse para estudiar diversas especies bacterianas con respecto a diferentes parámetros biológicos, tales como crecimiento, morfología o una señal fluorescente.En este ejemplo, C.glutamicum se cultivó bajo condiciones estándar de cultivo y aquí se muestran las curvas de crecimiento resultantes derivadas de tres microcolonias isogénicas. Los biorreactores de picolitros también han demostrado ser útiles para analizar la producción de proteínas mediante microscopía de fluorescencia de intervalos, como se muestra aquí. Al exponer las células a una baja concentración del inductor de proteínas IPTG, se pueden estudiar las variaciones entre célula y célula de la proteína a nivel individual dentro de colonias que se originan a partir de una sola célula madre.La técnica demostrada puede aplicarse para monitorear y analizar células bacterianas individuales con un control ambiental perfecto. Esto apenas es posible utilizando sistemas convencionales de cultivo a escala de banco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar chips de cultivo microfluídicos para realizar análisis comparables de células individuales.

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Biorreactor de picolitros microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: Fabricación, configuración del sistema y operación

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Aprende a fabricar y operar un biorreactor microfluídico de picolitro para análisis de una sola célula en bacterias como Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli. Este método permite estudiar la heterogeneidad fenotípica con resolución espacial y temporal.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación (Video) | JoVE Journal

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

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