Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

El objetivo general de este procedimiento es analizar bacterias individuales y microcolonias isogénicas en evolución con resolución espacial y temporal completa en condiciones ambientales constantes utilizando un dispositivo de cultivo microfluídico. Esto se logra diseñando primero un sistema de cultivo microfluídico utilizando software CAD. A continuación, se fabrican dispositivos de cultivo microfluídicos desechables a partir de polidimetilsiloxano que contiene biorreactores de picolitros, de una micra y de altura para restringir el crecimiento de las bacterias a una sola capa.

A continuación, el cultivo microbiano se infunde en el dispositivo microfluídico para inocular células madre individuales dentro de los biorreactores. Estas células se expanden por infusión continua de medio de crecimiento a través del sistema. Los resultados se obtienen a partir de microscopía automatizada de lapso de tiempo que muestra el cultivo de una cepa industrialmente relevante de Corynebacterium glutamicum, datos de crecimiento y heterogeneidad célula-célula.

En la biotecnología convencional, la mayoría de los análisis se basan en datos promedio. Nuestro dispositivo de microfluídica facilita el análisis de una sola célula de bacterias individuales con resolución espacial y temporal. Es una herramienta útil para observar de cerca la heterogeneidad célula a célula de las microcolonias isogénicas.

Aplicamos fotolitografía SU-8 común y moldeo de chips de polidimetilsiloxano para fabricar dispositivos microfluídicos de un solo uso con resolución de medios submicro. Hemos demostrado con éxito nuestra tecnología con varios microorganismos biotecnológicos como Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum. Para empezar, diseñe el dispositivo microfluídico utilizando software CAD.

El diseño presentado en este protocolo consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para mezclar dos sustratos diferentes, una salida y seis matrices compuestas por cinco biorreactores cada una. En una sala limpia, prepare una oblea de silicio de cuatro pulgadas y centrifugue un código de una micra de fotorresistencia SU-8 2000.5 sobre la oblea como se describe en el protocolo de texto adjunto. Coloque la oblea recubierta en una placa calefactora a 95 grados centígrados para eliminar el exceso de solvente y, a continuación, inserte la fotomáscara de primera capa que consta de las regiones de captura de los reactores de picolitros y la oblea recubierta dentro del alineador de mascarilla.

Luego, exponga la oblea en modo de contacto al vacío a una luz de 350 a 400 nanómetros durante tres segundos a una intensidad de siete milivatios por centímetro cuadrado. Realice un horneado posterior a la exposición en una placa calefactora nivelada a 95 grados centígrados para iniciar la polimerización de SU-8. A continuación, coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante un minuto y luego transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco durante unos segundos.

Enjuague la oblea con isopropanol para eliminar el revelador SU-8 y para secar la oblea con flujo de nitrógeno o un centrifugador de obleas. Luego, hornee la oblea durante 10 minutos a 150 grados centígrados. A continuación, fabrique la segunda capa como se describe en el protocolo de texto adjunto para completar el molde maestro.

Comience la fabricación de chips PDMS mezclando la base y el agente portador en una proporción de 10 a uno. Desgasifique la mezcla de PDMS durante aproximadamente 30 minutos dentro de un desecador al vacío hasta que hayan desaparecido todas las burbujas. A continuación, coloque la oblea SU-8 en un dispositivo de moldeo y vierta una capa de tres milímetros de mezcla de PDMS sobre la oblea.

Luego, hornee el PDMS durante tres horas a 80 grados centígrados en un horno. Una vez que se enfríe, pele con cuidado la losa de PDMS de la oblea y corte la losa en astillas individuales con un bisturí limpio y afilado. Lave las papas fritas en un baño de n-pentano durante 90 minutos, seguido de dos baños de lavado con acetona durante 90 minutos cada uno.

Seque las virutas durante la noche para eliminar cualquier residuo de disolvente. Justo antes del experimento, perfore los orificios de entrada y salida en el chip PDMS con una aguja o perforadora con un diámetro ligeramente menor que los conectores que se utilizan para conectar tubos con el chip PDMS. A continuación, limpie cuidadosamente el chip PDMS microfluídico con isopropanol y utilice cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adheridas.

Además, limpie primero un portaobjetos de vidrio delgado de 170 micras con acetona, luego con isopropanol, seguido de agua desionizada, y seque el portaobjetos con un chorro de nitrógeno. Una vez limpio y seco, el plasma oxida el portaobjetos de vidrio y el chip PDMS durante 25 segundos utilizando una potencia de 50 vatios y un caudal de oxígeno de 20 sccm. Luego, alinee cuidadosamente el PDMS y el chip de vidrio antes de colocar el PDMS en el vidrio, lo que hará que se adhiera en segundos.

Asegure la unión horneando la configuración durante 10 segundos a 80 grados centígrados. Para preparar las bacterias para un experimento con chips, inocule una sola colonia de una cepa bacteriana deseada, como C. glutamicum, en 20 mililitros de medio BHI fresco, e incube el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius en un agitador giratorio a 120 RPM. A la mañana siguiente, transfiera 10 microlitros del cultivo iniciador a un segundo cultivo que contenga 20 mililitros del medio deseado y deje que las células crezcan durante la noche en las mismas condiciones.

Al día siguiente, precaliente la incubadora de un microscopio invertido a 30 grados centígrados. Esto puede tardar hasta dos horas, dependiendo de la configuración individual. Mientras se calienta la instalación, abra la incubadora y seleccione el objetivo deseado y prepárela con cualquier medio de montaje necesario.

A continuación, monte el chip dentro del soporte del chip y asegúrelo en su lugar. Centre la muestra en el microscopio y concéntrela en las matrices de biorreactores de picolitros. Con el chip enfocado, conecte las entradas y salidas con la tubería adecuada y luego coloque la tubería de salida en un depósito de desechos.

A continuación, llene una jeringa con medios nuevos, colóquela en una bomba de jeringa y enjuague los canales microfluídicos durante una hora a un caudal de 200 nanolitros por minuto para cebar el chip. Mientras las células aún se encuentran en la fase temprana de crecimiento exponencial, transfiera un mililitro del cultivo bacteriano a una jeringa estéril y reemplace la jeringa y el tubo que contienen los medios con la suspensión celular y el tubo nuevo. Infundir la suspensión celular en los canales a un caudal volumétrico de 200 nanolitros por minuto hasta que se llenen la mayoría de los biorreactores de picolitros.

Si solo se llena una pequeña cantidad de biorreactores, aumente el caudal a 800 a 1200 nanolitros por minuto. Cuando se haya sembrado la cantidad deseada de células, desconecte la suspensión celular, vuelva a conectar el medio de crecimiento al chip y perfunde con medios frescos a 100 nanolitros por minuto. A continuación, escanee el chip y seleccione biorreactores específicos para obtener imágenes de lapso de tiempo.

A continuación, configure una secuencia de microscopía de lapso de tiempo para obtener imágenes de los biorreactores de principio a fin y comenzar el experimento. Una vez que todos los biorreactores de picolitros estén demasiado crecidos, detenga el experimento y deseche los chips de manera adecuada. Para comenzar el análisis, primero determine qué biorreactores cumplen con todos los criterios deseados para el experimento, como el número y la posición de las células madre.

Utilizando un programa de análisis, como la imagen J, determine la tasa de crecimiento de cada microcolonia contando el número de células en cada punto de tiempo. Calcule la tasa de crecimiento máxima trazando el tiempo frente al registro del número de celda. El sistema que aquí se presenta se puede aplicar para estudiar diversas especies bacterianas con respecto a diferentes parámetros biológicos como el crecimiento, la morfología o una señal fluorescente.

En este ejemplo, C. glutamicum se cultivó en condiciones de cultivo estándar y aquí se muestran las curvas de crecimiento resultantes derivadas de tres microcolonias isogénicas. Los biorreactores de picolitros también han demostrado ser útiles para acceder a la producción de proteínas mediante el uso de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo, como se muestra aquí. Al exponer las células a una baja concentración del inductor de proteínas IPTG, las variaciones de célula a célula de la proteína se pueden estudiar a nivel de una sola célula dentro de colonias a partir de una sola célula madre.

La técnica demostrada se puede aplicar para monitorear y analizar células bacterianas individuales con un control ambiental perfecto. Esto es difícilmente posible con los sistemas convencionales de cultivo a escala de laboratorio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar chips de cultivo microfluídicos para realizar análisis de células individuales comparables.