Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

El objetivo general de este procedimiento es analizar bacterias individuales y microcolonias isogénicas en evolución con resolución espacial y temporal completa, bajo condiciones ambientales constantes, mediante un dispositivo de cultivo microfluídico. Esto se logra primero diseñando un sistema de cultivo microfluídico utilizando software CAD. A continuación, se fabrican dispositivos desechables de cultivo microfluídico hechos de polidimetilsiloxano que contienen biorreactores de picolitros, con una altura de un micrón para restringir el crecimiento bacteriano a una sola capa.

Posteriormente, se infunde cultivo microbiano en el dispositivo microfluídico para inocular células madre individuales dentro de los biorreactores. Estas células se expanden mediante la infusión continua de medio de crecimiento a través del sistema. Los resultados se obtienen mediante microscopía de lapso de tiempo automatizada, que muestra el cultivo de una cepa de Corynebacterium glutamicum de relevancia industrial, datos de crecimiento y la heterogeneidad entre células.

En la biotecnología convencional, la mayoría de los análisis se basan en datos promedio. Nuestro dispositivo de microfluidos facilita el análisis individual de células bacterianas con resolución espacial y temporal. Es una herramienta útil para observar de cerca la heterogeneidad entre célula y célula en microcolonias isogénicas.

Aplicamos litografía fotográfica común con SU-8 y moldeo de chips de polidimetilsiloxano para fabricar dispositivos microfluídicos de un solo uso con resolución de medios submicrométrica. Hemos demostrado con éxito nuestra tecnología con varios microorganismos biotecnológicos, como Escherichia coli y Corynebacterium glutamicum. Para comenzar, diseñe el dispositivo microfluídico utilizando software CAD.

El diseño presentado en este protocolo consta de dos entradas de siembra, un generador de gradiente para mezclar dos sustratos diferentes, una salida y seis matrices compuestas por cinco biorreactores cada una. En un cuarto limpio, prepare una oblea de silicio de cuatro pulgadas y aplique mediante centrifugación una capa de un micrómetro de resistencia fotolitográfica SU-8 2000.5 sobre la oblea, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Coloque la oblea recubierta sobre una placa calefactora a 95 grados Celsius para eliminar el exceso de disolvente, e introduzca luego la primera máscara fotolitográfica, que incluye las regiones de captura de los reactores de picolitros, junto con la oblea recubierta dentro del alineador de máscaras.

A continuación, exponga la oblea en modo de contacto al vacío a luz de 350 a 400 nanómetros durante tres segundos a una intensidad de siete milivatios por centímetro cuadrado. Realice un horneado posterior a la exposición en una placa caliente nivelada a 95 grados Celsius para iniciar la polimerización del SU-8. A continuación, coloque la oblea en un baño de revelador SU-8 durante un minuto y luego transfiera la oblea a un segundo recipiente con revelador SU-8 fresco durante unos segundos.

Lave la oblea con isopropanol para eliminar el revelador SU-8 y seque la oblea mediante flujo de nitrógeno o con una centrífuga para obleas. A continuación, realice una cocción fuerte de la oblea durante 10 minutos a 150 grados Celsius. Después, fabrique la segunda capa según se describe en el protocolo de texto adjunto para completar el molde maestro.

Comience la fabricación del chip de PDMS mezclando la base y el agente portador en una proporción de 10 a 1. Degaire la mezcla de PDMS durante aproximadamente 30 minutos dentro de un desecador al vacío hasta que desaparezcan todas las burbujas. A continuación, coloque la oblea de SU-8 en un dispositivo de moldeo y vierta una capa de tres milímetros de la mezcla de PDMS sobre la oblea.

Luego, hornee el PDMS durante tres horas a 80 grados Celsius en un horno. Una vez enfriado, retire cuidadosamente la lámina de PDMS del oblea y corte la lámina en chips individuales utilizando un escalpelo limpio y afilado. Lave los chips en un baño de n-pentano durante 90 minutos, seguido de dos baños de lavado con acetona de 90 minutos cada uno.

Seque las láminas durante la noche para eliminar cualquier residuo de disolvente. Justo antes del experimento, perfore los orificios de entrada y salida en el chip de PDMS utilizando una aguja o un perforador con un diámetro ligeramente menor que el de los conectores que se usan para conectar la tubería con el chip de PDMS. A continuación, limpie cuidadosamente el chip de PDMS microfluídico con isopropanol y utilice cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adheridas.

Además, limpie un portaobjetos de vidrio delgado de 170 micrones primero con acetona, luego con isopropanol, seguido de agua desionizada, y seque el portaobjetos con un chorro de nitrógeno. Una vez limpio y seco, oxide con plasma el portaobjetos de vidrio y el chip de PDMS durante 25 segundos utilizando una potencia de 50 vatios y un flujo de oxígeno de 20 sccm. Luego, alinee cuidadosamente el PDMS y el chip de vidrio antes de colocar el PDMS sobre el vidrio, lo que hará que se unan en cuestión de segundos.

Asegure la unión horneando el montaje durante 10 segundos a 80 grados Celsius. Para preparar las bacterias para un experimento con chip, inocule una colonia individual de una cepa bacteriana deseada, como C.glutamicum, en 20 mililitros de medio BHI fresco e incube el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius en un agitador rotatorio a 120 RPM. A la mañana siguiente, transfiera 10 microlitros del cultivo inicial a un segundo cultivo que contenga 20 mililitros del medio deseado y deje crecer las células durante la noche en las mismas condiciones.

Al día siguiente, precaliente el incubador de un microscopio invertido a 30 grados Celsius. Esto puede tardar hasta dos horas, dependiendo del equipo específico. Mientras el equipo se calienta, abra el incubador, seleccione el objetivo deseado y prepárelo con cualquier medio de montaje necesario.

Luego, monte el chip dentro del soporte del chip y fíjelo en su lugar. Centre la muestra en el microscopio y enfoque los arreglos de bioreactores de picolitros. Con el chip enfocado, conecte las entradas y salidas con el tubo adecuado y luego coloque el tubo de salida en un depósito de desecho.

A continuación, llene una jeringa con medio fresco, colóquela en una bomba de jeringa y enjuague los canales microfluídicos durante una hora a un caudal de 200 nanolitros por minuto para cebado del chip. Mientras las células aún se encuentran en la fase temprana de crecimiento exponencial, transfiera un mililitro de la cultura bacteriana a una jeringa estéril y sustituya la jeringa y el tubo que contienen medio por la suspensión celular y un tubo nuevo. Infunda la suspensión celular en los canales a un caudal volumétrico de 200 nanolitros por minuto hasta que la mayoría de los biorreactores de picolitros estén llenos.

Si solo se llenan un pequeño número de biorreactores, aumente el caudal a 800-1200 nanolitros por minuto. Cuando se haya sembrado la cantidad deseada de células, desconecte la suspensión celular, reconecte el medio de crecimiento al chip y pase medio fresco a 100 nanolitros por minuto. A continuación, escanee el chip y seleccione biorreactores específicos para la adquisición de imágenes con lapso de tiempo.

Luego, configure una secuencia de microscopía de intervalos para obtener imágenes de los biorreactores desde el inicio hasta el final y comenzar el experimento. Una vez que todos los biorreactores de picolitros estén sobrepoblados, detenga el experimento y deseche las chips adecuadamente. Para iniciar el análisis, primero determine qué biorreactores cumplen con todos los criterios deseados para el experimento, como el número y la posición de las células madre.

Mediante un programa de análisis, como ImageJ, determine la tasa de crecimiento de cada microcolonia contando el número de células en cada punto temporal. Calcule la tasa máxima de crecimiento graficando el tiempo frente al logaritmo del número de células. El sistema aquí presentado puede aplicarse para estudiar diversas especies bacterianas con respecto a diferentes parámetros biológicos, tales como crecimiento, morfología o una señal fluorescente.

En este ejemplo, C.glutamicum se cultivó bajo condiciones estándar de cultivo y aquí se muestran las curvas de crecimiento resultantes derivadas de tres microcolonias isogénicas. Los biorreactores de picolitros también han demostrado ser útiles para analizar la producción de proteínas mediante microscopía de fluorescencia de intervalos, como se muestra aquí. Al exponer las células a una baja concentración del inductor de proteínas IPTG, se pueden estudiar las variaciones entre célula y célula de la proteína a nivel individual dentro de colonias que se originan a partir de una sola célula madre.

La técnica demostrada puede aplicarse para monitorear y analizar células bacterianas individuales con un control ambiental perfecto. Esto apenas es posible utilizando sistemas convencionales de cultivo a escala de banco. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar chips de cultivo microfluídicos para realizar análisis comparables de células individuales.